CN100339386C - 动物用复合型免疫球蛋白的生产方法 - Google Patents

动物用复合型免疫球蛋白的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种动物用复合型免疫球蛋白的生产方法，包括如下步骤：制备免疫血清，将免疫血清分装于适当容器内贮存于-20℃备用；用免疫血清分离提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；纯化免疫球蛋白IgG、IgA、IgM；将三种免疫球蛋白IgG、IgA、IgM按8～10∶1∶1～2比例混合；用纳米级孔径膜过滤。按本发明所生产的复合型免疫球蛋白包含有IgA、IgM和IgG三种免疫球蛋白，可同时具备IgA、IgM和IgG三种免疫功能，免疫效果好，解决了动物病毒性疾病对养殖业的困扰问题；产品中除三种免疫球蛋白外无其它蛋白，可避免由于硫酸铵盐等残留在产品中所造成的注射后不易吸收的现象。

Description

动物用复合型免疫球蛋白的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种动物用免疫球蛋白的生产方法，尤其是动物用复合型免疫球蛋白的生产方法。
背景技术：
动物病毒性疾病一直是困扰养殖业的一大难题，每年由于动物病毒性疾病造成的损失触目惊心。目前兽医临床上除了用抗病毒的药之外，多采用病毒特异性高免血清治疗动物病毒性疾病。目前，病毒特异性高免血清的生产方法是按以下步骤进行：
1.量取一定量的动物血清，在缓慢搅拌的情况下，徐徐加入等体积的80％过饱和硫酸铵，每加一滴在混匀后再加第二滴，搅拌均匀后放到4℃静置1-2小时，取出后以3000～5000转/分钟离心15～20分钟，弃上清，用与最初血清等体积的生理盐水溶解沉淀；
2.在缓慢搅拌的情况下，缓慢加入等体积的80％过饱和硫酸铵，搅拌均匀后放到4℃静置1-2小时，取出后以3000～5000转/分钟离心15～20分钟，弃上清，用与最初血清等体积的生理盐水溶解沉淀；
3.重复步骤2；
4.将溶液装透析袋，4℃透析48小时，每天更换3～4遍透析液(蒸馏水或生理盐水或PBS缓冲液)；
5.将透析好的免疫球蛋白装入容器中，冷冻保存。
现有的生产方法存在着以下缺点：
1.此方法所提取主要是IgG免疫球蛋白，免疫品种单一，不能达到理想的免疫效果；
2.硫酸铵盐易残留在产品中，产品纯度不高，注射后不易吸收。
发明内容：
本发明是为了解决现有技术所存在的免疫球蛋白单一、免疫效果不理想及产品纯度低的技术问题，提供一种具有三种免疫球蛋白、纯度高的动物用复合型免疫球蛋白的生产方法。
本发明的技术解决方案是：
一种动物用复合型免疫球蛋白的生产方法，包括如下步骤：
A.制备免疫血清，将免疫血清分装于容器内贮存于-20℃备用；
B.用免疫血清分离提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；
C.纯化免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；
D.将三种免疫球蛋白IgG、IgA、IgM按8～10∶1∶1～2比例混合；
E.用纳米级孔径膜过滤。
所述的用免疫血清分离提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的具体步骤如下：
a.将免疫血清与3倍体积的水混合，调PH值至7.7，将溶液的温度降至0℃；
b.在快速搅拌下，加入-20℃预冷的乙醇，使其产生沉淀，离心收集沉淀；
c.将沉淀悬于25倍体积的生理盐水中，加50mmol/L的乙酸溶液，使其形成沉淀，离心分离沉淀、上清；
d.将上清调PH至7.4，加入-20℃预冷的乙醇，使其产生沉淀，离心收集沉淀即为IgG；
e.将c步骤所获得沉淀悬浮于0℃水中，加50mmol/L的乙酸溶液调PH至5.1，离心后取上清，调整离子强度至0.075～0.01，pH5.5，然后加入已预冷至-20℃的乙醇，使其产生沉淀，离心后所得沉淀为IgA与IgM的混合物；
f.将混合物溶于2mmol/L、pH6.0的磷酸盐缓冲液中，4℃条件下透析3次；
g.离心，所得沉淀即为IgM，上清即IgA。
所述的纯化免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的具体步骤如下：
(1)纯化IgG：
①材料
蛋白A-琼脂凝胶；
CL4B缓冲液：
A.0.05M Tris/0.15M NaCl，pH8.6内含0.02％叠氮钠；
B.0.05M磷酸盐/0.15M NaCl，pH7.0；
C.0.05M柠檬酸盐/0.15M NaCl，ph5.5；
D.0.05M醋酸盐/0.15M NaCl，pH4.3；
E.0.05M甘氨酸/0.15M NaCl，pH2.3；
②操作方法
a.称取蛋白A-琼脂糖凝胶CL4B，用缓冲液A膨胀后装入柱子底端用尼龙丝团堵住；
b.用稀的氢氧化钠调整，待亲和层析的抗体溶液pH至8.6；
c.将含量50毫克抗体样品上层析柱，待样品进入柱床后，用缓冲液A洗脱结合的蛋白并用紫外光度计监测洗脱液；
d.用缓冲液B、C、D、E连续洗脱，收集分离物立即予以混和，再透析和浓缩，即得纯化的IgG。
(2)纯化IgM
①材料
2mmol/l磷酸盐缓冲液pH6.0；Tris缓冲液-TBS；Sepharose6B；用TBS装柱。
②操作方法
a.将IgM的提取物加到Sepharose6B柱上，室温下用TBS洗脱，收集洗脱物，在280nm波长下监测光吸收值；
b.第一大峰为含五聚体的IgM，随后一小峰为大分子的凝聚物。
(3)纯化IgA
①材料
Sephadex G200，用0.1M磷酸盐缓冲液A，pH6.8平衡装柱，柱长100厘米，内径3.2厘米；含0.1MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲溶液B，pH7.5；含0.25MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲溶液C，pH7.5；DEAE-纤维素，30毫升湿沉降体积层析柱装柱。
②操作方法
a.将IgA提取物经Sephadex G200柱子用缓冲液A洗脱，每10毫升收集1管，在280nm波长下监测吸收值，在少量的异物之后，第一个主要峰为IgA二聚体；
b.将收集的IgA用缓冲液B透析，并用同一缓冲液平衡的离子交换剂装柱；
c.用缓冲液B洗脱60毫升后用缓冲液C150毫升洗脱，每5毫升收集一管，加样，再用同一缓冲液洗脱；在280nm下监测吸收值，收集IgA。
按本发明所生产的复合型免疫球蛋白包含有IgA、IgM和IgG三种免疫球蛋白，可同时具备IgA、IgM和IgG三种免疫功能，免疫效果好，解决了动物病毒性疾病对养殖业的困扰问题；产品中除三种免疫球蛋白外无其它蛋白，可避免由于硫酸铵盐等残留在产品中所造成的注射后不易吸收的现象。
具体实施方式：
a.制备免疫血清
(1).选用易感同源动物，用一定量的免疫原免疫，免疫次数根据不同动物、不同免疫原具体制定；
(2).免疫血清的分离：将装有血液的容器放在室温约1小时，使其充分凝固，然后置4℃过夜；
(3).吸出清朗的血清置于瓶内；若血清中含有血细胞或血块，以3000g离心20分钟，收集上部清朗的血清；
(4).将免疫血清分装于适当容器内贮存于-20℃备用。
b.用免疫血清分离提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM
(1).将血清与3倍体积的水混合，调PH值至7.7，置-5℃～0℃低温水槽(内盛20％的乙醇水溶液)或冰水浴中，将溶液的温度降至0℃；
(2).在快速搅拌下，加入-20℃预冷的乙醇至终浓度为20％，并保持在冰浴中，使其产生沉淀，沉淀中含有多种类型的免疫球蛋白，4000转30分钟离心收集沉淀；
(3).将沉淀悬于25倍体积的生理盐水中，加50mmol/L的乙酸溶液调PH至5.1左右，使其形成沉淀，以4000转/分钟的转速离心30分钟，沉淀中含有IgA和IgM，上清中含有IgG；
(4).将上清调PH至7.4左右，加入-20℃预冷的乙醇至终浓度为25％，并保持在水浴中，使其产生沉淀，离心收集沉淀即为IgG；
(5).将(3)中所获得沉淀悬浮于0℃水中，加50mmol/L的乙酸溶液调PH至5.1，离心后取上清，调整离子强度至0.075～0.01，PH5.5。然后加入已预冷至-20℃的乙醇至终浓度为10％，并保持在冰浴中，离心后所得沉淀主要为IgA、IgM；
(6)将混合物溶于2mmol/L的磷酸盐缓冲液pH 6.0，4℃下透析3次；
(7)离心，所得沉淀即为IgM，IgA则在上清中。
c.纯化免疫球蛋白IgG，提纯IgA、IgM
(1)IgG的纯化：蛋白A-琼脂凝胶亲和层析
①材料
蛋白A-琼脂凝胶CL4B(Protein A-Sepharose CL4B瑞典phamacia公司出品)缓冲液：
A.取6.06克Tris加8.76克NaCL溶于800毫升水中，用HCl调pH8.6，加叠氮钠液和水至1000毫升，制成0.05M Tris/0.15M NaCL，pH8.6内含0.02％叠氮钠的缓冲液A；
B.取2.17克Na2HPO4加1.35克NaH2PO4加8.76克NaCL依次溶于1000毫升水中，pH7.0，制成0.05M磷酸盐/0.15M NaCL，pH7.0的缓冲液B；
C.取2.68克柠檬酸(含一分子水)加10.96克柠檬酸三钠(含二分子水)加8.76克NaCL加水1000毫升，pH5.5，制成0.05M柠檬酸盐/0.15M NaCL，ph5.5的缓冲液C；
D.取6.8克醋酸钠加8.76克NaCL加水800毫升，加醋酸调pH4.3用水加至1000毫升，制成0.05M醋酸盐/0.15M NaCL，pH4.3的缓冲液D；
E.取5.6克甘氨酸加8.76克NaCL加水800毫升，用强酸调pH2.3，加水至1000毫升，制成0.05M甘氨酸/0.15M NaCL，pH2.3的缓冲液E。
②操作方法
A.称取蛋白A-琼脂糖凝胶CL4B用缓冲液A膨胀后装入柱子底端用尼龙丝团堵住；
B.用稀的氢氧化钠调整待亲和层析的抗体溶液pH至8.6；
C.降含量约50毫克抗体样品上层析柱，待样品进入柱床后，用缓冲液A洗脱结合的蛋白(用紫外光度计监测洗脱液)；
D.用缓冲液B、C、D、E连续洗脱，，收集适合的分馏物立即予以中和，再透析和浓缩；
E.柱的再生，用缓冲液D洗柱，然后再用缓冲液A平衡柱子可完成柱的再生。
(2)IgM的纯化
①材料
2mM磷酸盐缓冲液pH6.0；；Tris缓冲液(TBS)；Sepharose6B；用TBS装柱，柱层析装置。
②操作方法
A.将IgM的提取物加到Sepharose6B柱上，室温下用TBS洗脱，收集洗脱物，在280nm波长下监测光吸收值；
B.第一大峰为含五聚体的IgM，随后一小峰为大分子的凝聚物。
(3)IgA纯化
①材料
Sephadex G200，用0.1M磷酸盐缓冲液A，pH6.8平衡装柱，柱长100厘米，内经3.2厘米；0.1MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲溶液B，pH7.5；0.25MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲溶液C，pH7.5；DEAE-纤维素，30毫升湿沉降体积层析柱装柱。
②操作方法
A.将提取液经Sephadex G200柱子用pH6.80.1M磷酸盐缓冲液洗脱，每10毫升收集1管，在280nm波长下监测吸收值，在少量的异物(凝聚蛋白)之后，第一个主要峰为IgA二聚体；
B.将收集的IgA用缓冲溶液A透析，并用同一缓冲液平衡的离子交换剂装柱，加样，再用同一缓冲液洗脱；
C.洗脱大约60毫升缓冲液时，则280nm波长的吸收值返回基线，然后用的缓冲液C150毫升洗脱，每5毫升收集一管，在280nm下监测吸收值；
D.游离的分泌成分可被开始的缓冲液洗掉，IgA则被较高浓度盐的缓冲液洗脱出。
含量测定、半成品检定、成品检验：
a.蛋白质含量测定：紫外光吸收法，利用下面的公式计算蛋白质含量单位为mg/ml：Pr＝(1.45*OD280-0.74*OD260)
b.将三种免疫球蛋白IgG、IgA、IgM按8～10∶1∶1～2比例混合；
c.用纳米级孔径膜过滤。
半成品检定：液体制剂于除菌过滤和除病毒后应做理化检查及热原质试验，并抽样做无菌试验，结果符合要求。
成品检验：抽样每批成品分别做物理检查、化学检定、蛋白质含量、热稳定性试验、无菌试验、热原质试验和安全试验等全面的质量检测，结果符合要求。

Claims (1)

1.一种动物用复合型免疫球蛋白的生产方法，包括如下步骤：
A.制备免疫血清，将免疫血清分装于容器内贮存于-20℃备用；
B.用免疫血清分离提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；
C.纯化免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；
D.将三种免疫球蛋白IgG、IgA、IgM按8～10∶1∶1～2比例混合；
E.用纳米级孔径膜过滤；
所述的用免疫血清分离提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的具体步骤如下：
a.将免疫血清与3倍体积的水混合，调PH值至7.7，将溶液的温度降至0℃；
b.在快速搅拌下，加入-20℃预冷的乙醇，使其产生沉淀，离心收集沉淀；
c.将沉淀悬于25倍体积的生理盐水中，加50mmol/L的乙酸溶液，使其形成沉淀，离心分离沉淀、上清；
d.将上清调PH至7.4，加入-20℃预冷的乙醇，使其产生沉淀，离心收集沉淀即为IgG；
e.将c步骤所获得沉淀悬浮于0℃水中，加50mmol/L的乙酸溶液调PH至5.1，离心后取上清，调整离子强度至0.075～0.01，pH5.5，然后加入已预冷至-20℃的乙醇，使其产生沉淀，离心后所得沉淀为IgA与IgM的混合物；
f.将混合物溶于2mmol/L、pH6.0的磷酸盐缓冲液中，4℃条件下透析3次；
g.离心，所得沉淀即为IgM，上清即IgA；
所述的纯化免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的具体步骤如下：
(1)纯化IgG：
①材料
蛋白A-琼脂凝胶；
CL4B缓冲液：
A.0.05M Tris/0.15M NaCl，pH8.6内含0.02％叠氮钠；
B.0.05M磷酸盐/0.15M NaCl，pH7.0；
C.0.05M柠檬酸盐/0.15M NaCl，ph5.5；
D.0.05M醋酸盐/0.15M NaCl，pH4.3；
E.0.05M甘氨酸/0.15M NaCl，pH2.3；
②操作方法
a.取蛋白A-琼脂糖凝胶CL4B，用缓冲液A膨胀后装入柱子底端用尼龙丝团堵住；
b.用稀的氢氧化钠调整，待亲和层析的抗体溶液pH至8.6；
c.将含量50毫克抗体样品上层析柱，待样品进入柱床后，用缓冲液A洗脱结合的蛋白并用紫外光度计监测洗脱液；
d.用缓冲液B、C、D、E连续洗脱，收集分离物立即予以混和，再透析和浓缩，即得纯化的IgG；
(2)纯化IgM
①材料
2mmol/l磷酸盐缓冲液pH6.0；Tris缓冲液-TBS；Sepharose6B；用TBS装柱；
②操作方法
a.将IgM的提取物加到Sepharose6B柱上，室温下用TBS洗脱，收集洗脱物，在280nm波长下监测光吸收值；
b.第一大峰为含五聚体的IgM，随后一小峰为大分子的凝聚物；
(3)纯化IgA
①材料
Sephadex G200，用0.1M磷酸盐缓冲液A，pH6.8平衡装柱，柱长100厘米，内径3.2厘米；含0.1MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲溶液B，pH7.5；含0.25MNaCl的0.01M磷酸盐缓冲溶液C，pH7.5；DEAE-纤维素，30毫升湿沉降体积层析柱装柱；
②操作方法
a.将IgA提取物经Sephadex G200柱子用缓冲液A洗脱，每10毫升收集1管，在280nm波长下监测吸收值，在少量的异物之后，第一个主要峰为IgA二聚体；
b.将收集的IgA用缓冲液B透析，并用同一缓冲液平衡的离子交换剂装柱，加样，再用同一缓冲液洗脱；
c.用缓冲液B洗脱60毫升后用缓冲液C150毫升洗脱，每5毫升收集一管，在280nm下监测吸收值，收集IgA。
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