CN1763095A - 蛋黄免疫球蛋白的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种蛋黄免疫球蛋白的生产方法，包括如下步骤：将免疫卵黄、生理盐水、氯仿按1∶2∶2混匀后室温放置2小时，离心取上清液；在上清液中加入硫酸钠搅拌溶解，使硫酸钠浓度为20％W/V，4℃静置1小时，离心弃去上清，取沉淀的蛋白质；将沉淀物溶于生理盐水中，再对生理盐水透析，得粗制蛋黄免疫球蛋白；用DEAE－纤维素柱对粗制蛋黄免疫球蛋白纯化；采用纳米级孔径膜对纯化后的蛋黄免疫球蛋白过滤。此方法所获蛋黄免疫球蛋白制剂杂质少、纯度高(可达95％以上)、性能稳定，克服了现有技术生产蛋黄免疫球蛋白所存在的种种弊病，保证了产品的高效和安全。
Description
技术领域：
本发明涉及一种蛋黄免疫球蛋白的生产方法，尤其是一种纯度高的蛋黄免疫球蛋白的生产方法。
背景技术：
蛋黄免疫球蛋白(IgY)是存在于鸡卵黄中的一种免疫球蛋白，虽然其结构与哺乳动物的IgG有所不同，但它与IgG一样，具有较高的免疫活性，50ng/ml含量仍能被检测出有特异性活性。经证实，从卵黄中可获得200种不同的抗体，在体内的主要生理功能为凝集、吞噬及中和细菌及毒素等成份，增强机体防病抗病能力，因此蛋黄免疫球蛋白被广泛的应用于免疫治疗、疾病诊断等许多方面。
目前，蛋黄免疫球蛋白的制备方法是用高免鸡蛋卵黄经稀释后直接制备，即将收集好的高免蛋蛋壳消毒，无菌分离蛋黄和蛋清，将蛋黄液和灭菌生理盐水按1∶3(V/V)混合，在组织捣碎机中高速搅拌制成匀浆，经双层灭菌纱布过滤，加青、链霉素2000ug/ml和0.01％叠氮钠，然后分装于瓶中，-20℃保存。虽然用鸡蛋作为抗体生产的来源，比从免疫的动物中直接生产多克隆抗体的传统方法工艺简单、成本低廉，避免了大量人畜共患传染病的垂直传播，但是目前的制备方法存在着如下缺点：
1.性能不稳定，需低温冷冻保存，不能反复冻融，否则容易形成沉淀及凝块等缺陷；
2.蛋黄液纯度不高，不易吸收，大剂量注射易造成注射部位的损伤，影响血液循环，并加速体况较差的患病动物的死亡；
3.由于产品中杂质较多，必需添加青、链霉素和叠氮钠作为防腐剂，对机体有一定的副作用。
发明内容：
本发明针对现有技术所存在的性能不稳定、纯度不高、杂质较多及易造成多种传染病严重传播等技术问题，提供一种性能稳定、纯度高、杂质少的蛋黄免疫球蛋白的生产方法。
本发明的技术解决方案是：一种蛋黄免疫球蛋白的生产方法，其特征在于
包括如下步骤：
a.将免疫卵黄、生理盐水、氯仿按1∶2∶2混匀后室温放置2小时，离心取上清液；
b.在上清液中加入硫酸钠搅拌溶解，使硫酸钠浓度为20％W/V，4℃静置1小时，离心弃去上清，取沉淀的蛋白质；
c.将沉淀物溶于生理盐水中，再对生理盐水透析，得粗制蛋黄免疫球蛋白；
d.用DEAE-纤维素柱对粗制蛋黄免疫球蛋白纯化；
e.采用纳米级孔径膜对纯化后的蛋黄免疫球蛋白过滤。
所述的用DEAE-纤维素柱对粗制蛋黄免疫球蛋白纯化有以下步骤：
a.DEAE-纤维素预处理：用蒸馏水将DEAE-纤维素搅匀、浸泡20～24小时，漂洗2-3次，倾去上层细粒，先用0.1N NaOH处理1小时，用蒸馏水反复洗至中性，随后用0.1N HCl处理30分钟，反复洗至中性，最后用0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡。
b.装注、层析：装柱时将平衡好的DEAE-纤维素搅匀，将玻棒插入柱床底部，再将DEAE-纤维素沿玻棒倒入，边提取玻棒边加，直至装成柱床，放置8～24小时。
c.加样、洗脱、收集保存：打开出水口，使柱床上部缓冲液下降或吸出多余液体，放入直径与柱床内径相当的圆滤纸片，使其和DEAE-纤维素顶端接触，再加样；待样品完全进入柱床，再迅速加少量缓冲液将管壁内侧洗一下，待洗液进入柱床后用缓冲液开始洗脱，用紫外光检测仪自动监测蛋白峰，收集含蛋白质的洗脱液，分装保存。
可以用聚乙二醇浓缩蛋白。
本发明是以免疫鸡蛋黄为原料，用氯仿去除类脂质成分后以饱和硫酸钠盐析法沉淀蛋白，采用DEAE-纤维素柱层析获得含有蛋黄免疫球蛋白的制剂，用带有纳米级孔径的膜过滤装置，将细菌和病毒100％去除。此方法所获蛋黄免疫球蛋白制剂杂质少、纯度高(可达95％以上)、性能稳定，克服了现有技术生产蛋黄免疫球蛋白所存在的种种弊病，保证了产品的高效和安全。
具体实施方式：
实施例1：
用现有技术获得免疫蛋黄。即第一天用含0.1-0.5mg所选特定抗原的Fre-und完全佐剂(CFA)对产蛋鸡进行免疫。分别在首免后的第14和21天用相同的抗原将鸡做两次加强免疫，每次抗原注射量为1ml。首次免疫后28天开始收集鸡蛋，之后每月作一次注射免疫，此鸡群可在6个月内作为IgY生产用的鸡蛋来源。
具体生产方法如下：
a.将免疫卵黄、生理盐水、氯仿按1∶2∶2混匀后室温放置2小时，离心取上清液，去除类脂质成分；
b.在上清液中加入硫酸钠搅拌溶解，使硫酸钠浓度为20％W/V(质量/体积)，4℃静置1小时，离心弃去上清，取沉淀的蛋白质；
c.将沉淀的蛋白质溶于等体积的生理盐水中，再对生理盐水透析，去除残余的硫酸钠，得粗制蛋黄免疫球蛋白；
d.用DEAE-纤维素柱对粗制蛋黄免疫球蛋白纯化；
e.采用纳米级孔径膜对纯化后的蛋黄免疫球蛋白过滤。
实施例2：
其前三步骤同实施例1，而用DEAE-纤维素柱对粗制蛋黄免疫球蛋白纯化有以下步骤：
a.DEAE-纤维素预处理：用蒸馏水将DEAE-纤维素搅匀、浸泡20～24小时，漂洗2-3次，倾去上层细粒，先用0.1N NaOH处理1小时，用蒸馏水反复洗至中性，随后用0.1N HCl处理30分钟，反复洗至中性，最后用0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡。
b.装注、层析：装柱时将平衡好的DEAE-纤维素搅匀，将玻棒插入柱床底部，再将DEAE-纤维素沿玻棒倒入，边提取玻棒边加，直至装成柱床，放置8～24小时。
c.加样、洗脱、收集保存：打开出水口，使柱床上部缓冲液下降或吸出多余液体，放入直径与柱床内径相当的圆滤纸片，使其和DEAE-纤维素顶端接触，再加样；待样品完全进入柱床，再迅速加少量缓冲液将管壁内侧洗一下，待洗液进入柱床后用缓冲液开始洗脱，用紫外光检测仪自动监测蛋白峰，收集含蛋白质的洗脱液，可按1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml分装保存。
实施例3：
其它步骤同实施例1、2，当所收集蛋白的浓度较低时，可以用聚乙二醇浓缩蛋白。
成品检验：抽样每批成品分别做物理检查、化学检定、蛋白质含量、热稳定性试验、无菌试验、热原质试验和安全试验等全面的质量检测，结果符合要求。
半成品检定：液体制剂于除菌过滤和除病毒后应做理化检查及热原质试验，并抽样做无菌试验，结果符合要求。
Claims (3)
1.一种蛋黄免疫球蛋白的生产方法，其特征在于包括如下步骤：
a.将免疫鸡卵黄、生理盐水、氯仿按1∶2∶2混匀后室温放置2小时，离
心取上清液；
b.在上清液中加入硫酸钠搅拌溶解，使硫酸钠终浓度为20％W/V，4℃静置1小时，离心弃去上清，取沉淀的蛋白质；
c.将沉淀物溶于生理盐水中，再对生理盐水透析，得粗制蛋黄免疫球蛋白；
d.用DEAE-纤维素柱对粗制蛋黄免疫球蛋白纯化；
e.采用纳米级孔径膜对纯化后的蛋黄免疫球蛋白过滤。
2.根据权利要求1所述的蛋黄免疫球蛋白的生产方法，其特征在于所述的用DEAE-纤维素柱对粗制蛋黄免疫球蛋白纯化有以下步骤：
a.DEAE-纤维素预处理：用蒸馏水将DEAE-纤维素搅匀、浸泡20～24小时，漂洗2-3次，倾去上层细粒，先用0.1N NaOH处理1小时，用蒸馏水反复洗至中性，随后用0.1N HCl处理30分钟，反复洗至中性，最后用0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液平衡。
b.装注、层析：装柱时将平衡好的DEAE-纤维素搅匀，将玻棒插入柱床底部，再将DEAE-纤维素沿玻棒倒入，边提取玻棒边加，直至装成柱床，放置8～24小时。
c.加样、洗脱、收集保存：打开出水口，使柱床上部缓冲液下降或吸出多余液体，放入直径与柱床内径相当的圆滤纸片，使其和DEAE-纤维素顶端接触后加样；待样品完全进入柱床，再迅速加少量缓冲液将管壁内侧洗一下，待洗液进入柱床后用缓冲液开始洗脱，用紫外光检测仪自动监测蛋白峰，收集含蛋白质的洗脱液，分装保存。
3.根据权利要求2所述的蛋黄免疫球蛋白的生产方法，其特征在于用聚乙二醇浓缩蛋白。
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| CN 200510047205 CN1763095A (zh) | 2005-09-12 | 2005-09-12 | 蛋黄免疫球蛋白的生产方法 |
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Publications (1)
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| CN1763095A true CN1763095A (zh) | 2006-04-26 |
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| CN 200510047205 Pending CN1763095A (zh) | 2005-09-12 | 2005-09-12 | 蛋黄免疫球蛋白的生产方法 |
Country Status (1)
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2005
- 2005-09-12 CN CN 200510047205 patent/CN1763095A/zh active Pending
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