CN1944459A - 注射用胎盘多肽制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种注射用胎盘多肽制备方法，包括原料收集、磨研、破碎、病菌灭活、酸化水解、离心分离、澄清过滤、超率、除菌过滤和冻干等步骤，利用本方法生产的产品，在保证产品活性基础上，可较好的杀灭病毒。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物制剂的制备方法，具体涉及一种注射用胎盘多肽的新型制备方法。
背景技术
目前市场上的胎盘制剂，如胎盘组织注射液，主要生产工艺延习传统中药炮制方法，采用高温煮沸提取，减压浓缩等工艺制备；另外，也有单位使用HBVM-AgB阴性、HbsAb阳性胎盘作为原料，采用低温提取工艺制备胎盘制剂，用于乙型肝炎的治疗。
前者容易做到将产品中可能残留的病毒灭活，从而保障产品的安全，但由于是在高温下操作，因此，也极为容易出现将产品中的活性成分减少或者活性降低的情况。后者则恰好与前者相反，由于是低温操作，虽然可以较好的保持产品的活性，以保证其效力，但却容易出现有些病毒不能被去除或灭活，从而使产品的安全性受到影响的情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一种既可确保有效成分、又可较为彻底杀死病原微生物的注射用胎盘多肽的新型制备方法。
本发明的方法依次包括如下步骤：
(1)收集健康产妇足月分娩的胎盘，将其组织破碎；
(2)加入等重的0.75～1％无菌生理盐水，在胶体磨上研磨后分装；
(3)将分装的产品反复在低温、高温条件下进行多次冻、融处理；
(4)在40～60℃下加热进行病原微生物灭活处理；
(5)用盐酸调节PH值至2.0-4.0，并在35～39℃条件下保温1小时以上，再用氢氧化钠将PH值调至中性；
(6)离心分离后取上清液，再先后经过深层过滤和超滤处理，制得分子量小于10000dalton的超滤液；
(7)向超滤液中加入甘露醇5～10％；
(8)将经过步骤(7)得到的液体用0.22μm的膜除菌过滤后分装，真空冷冻干燥。
本方法还可包括病毒检验步骤，即在胎盘收集后通过检验选出无乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等病毒的原料。
本方法制备的产品为白色或淡黄色疏松体，加水复融后为无色或淡黄色澄清液体。
由于本发明的操作步骤中，增加了独特的酸化保温工艺，来进一步灭活病毒，确保制品的安全性，同时最大程度保留了原有成份的活性。
下面通过具体实施方式对本发明的方法作更为详细的描述。
具体实施方式
一种注射用胎盘多肽的新型制备方法，依次包括如下步骤：
(1)首先收集健康产妇足月分娩的胎盘，经乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等病毒检验后，筛选病毒检验结果为阴性的胎盘做原料；
(2)将合格的胎盘组织去除筋膜，破碎，并加入等重的0.75％无菌生理盐水，在胶体磨上研磨后分装；
(3)将分装的产品反复在低温，如零下20℃、高温条件下，如30℃，进行3～5次冻、融处理；
(4)在60±2℃下加热保温10小时，进行病原微生物灭活处理，并不断搅拌，以提高灭活效果；
(5)用2～4N盐酸调节PH值至2.0～4.0，并在35～39℃条件下保温1小时以上，再用2～4N氢氧化钠将PH值调至PH6.5～7.5；
(6)以2000～5000rpm离心分离10～60分钟后取上清液，先经0.3～1.0μm孔径的膜深层过滤，再用截留分子量为10000D的超滤膜超滤，获得超滤液；
(7)向超滤液中加入占滤液重量百分比为5～10％的甘露醇作为赋形剂；
(8)将经过步骤(7)得到的液体用0.22μm的膜除菌过滤后分装，真空冷冻干燥，冷冻干燥的具体操作为先迅速将制品温度降到-40～-55℃，维持2～3小时，抽真空至10Pa以下，经20小时缓慢升温升至25～30℃维持3小时左右。
经过上述步骤，就可得到合格的、固态的胎盘多肽产品，为白色或淡黄色疏松体，加水复融后为无色或淡黄色澄清液体。
其中，步骤(2)中的生理盐水的浓度可以在0.75～1％之间进行选择，在此范围内，产品的性能不受影响；步骤(4)中的温度可以维持在40～60℃，但当温度选择此范围内较低点时，保温时间需相应的延长，如取40℃时需保温大约18小时。
依据2005版《中国药典》第三部的相关标准，对本方法制备的产品的水分、PH值、多肽含量、含菌状况、异常毒性等均复合标准；依据2000版《中国生物制品规程》，其核糖含量复合要求；与黄基水杨酸反应，蛋白质反应呈阴性；用小白鼠细胞粘附抑制试验法，产品未粘附白细胞抑制指数(NAI)大于30％；产品紫外吸光度OD250.1cm≥10；病毒检测结果为：HBsAg、HCV、HIV-1/HIV-2、梅毒螺旋体均呈阴性；分子量分布范围及相对组分通过高效液相色谱法测定。
下面是对本发明工艺制备的胎盘多肽活性和相对分子量分布范围及组分检测的检测。
一、胎盘多肽活性测定(白细胞粘附抑制法)
1.试验材料
1.1小鼠白细胞悬液的制备
取体重22～25g健康小鼠5只，脱颈处死。无菌取出脾脏，Hank’s液洗3次，用无菌铜网轻轻压碎制成细胞悬液。用1640培养液洗3次(1500r/min离心15分钟。然后每只鼠脾脏加3ml无菌蒸馏水破坏红细胞，再加3.6％氯化钠溶液1ml调整渗透压，混匀后用200目尼龙网过滤，滤液1500r/min离心5分钟。再分别用0.9％氯化钠溶液和1640培养液各洗1次，收集细胞，用1640培养液调整细胞浓度为1.0×106～3.0×106/ml，备用。
1.2待检样品溶液的制备
取待测样品用蒸馏水稀释成多肽含量1mg/ml左右的溶液。
2.试验步骤
取洁净的离心管6支，各加细胞悬液1ml，前3管加待检样品1ml为试验管，另3管加无菌Hank’s液1ml为对照管。37℃致敏30分钟，1500r/min离心10分钟，弃上清液，每管沉淀分别准确加入1640培养液1ml。CO2培养箱内37℃培养1～2小时，取出轻轻摇匀，静置1～3分钟，显微镜下计数未粘附的白细胞数。
3.结果判定
未粘附白细胞抑制指数(NAI)≥30％判定为活性合格。NAI＝(试验组平均未粘附细胞数-对照组平均未粘附细胞数)/对照组平均未粘附细胞数×100％。
结果显示，所检验的产品的NAI均≥30％。
二、注射用胎盘多肽相对分子量分布范围及组分检测(高效液相色谱法)
1.试验材料
1.1仪器
高效液相色谱仪，Protein PAK60凝胶色谱柱(300mm×7.8mm，5μm)。
1.2流动相
0.1mol/L磷酸钠缓冲液，pH 6.7，0.45m膜过滤并脱气。
1.3对照品
申请人自己制造的稳定产品(已通过质谱法确定最大分子量小于10000dalton)
2.试验步骤
2.1色谱条件
流速：0.6ml/min；波长：280nm；柱温：室温；进样量：10μl。
2.2测定
将对照品、待测样品用蒸馏水稀释成多肽含量1mg/ml左右的溶液，分别进样进行测定。
3.结果判定
3.1待测样品相对分子量分布范围小于10000dalton。用对照品与待测样品同时进行凝胶色谱检测，比较第一峰的出峰时间，二者基本一致。
3.2待测样品色谱图保留时间在15-17分钟左右三至四个较为稳定的色谱峰，以17分钟左右的最高峰为1号峰，依次往左为2、3或4号峰。1、2号峰与对照品相应峰的百分峰面积的比值在1.00±25％范围内3或3、4号峰与对照品相应峰的百分峰面积的比值在1.00±40％范围内。
3.3此三个或四个峰与对照品相应峰的保留时间的比值在1.00±1.5％范围内。
Claims (4)
1.一种注射用胎盘多肽制备方法，依次包括如下步骤：
(1)收集健康产妇足月分娩的胎盘，将其组织破碎；
(2)加入等重的0.75～0.1％无菌生理盐水，在胶体磨上研磨后分装；
(3)将分装的产品反复在低温、高温条件下进行多次冻、融处理；
(4)在40～60℃下加热进行病原微生物灭活处理；
(5)用盐酸调节PH值至2.0～4.0，并在35～49℃条件下保温1小时以上，再用氢氧化钠将PH值调至中性；
(6)离心分离后取上清液，再先后经过深层过滤和超滤处理，制得分子量小于10000dalton的超滤液；
(7)向超滤液中加入占其重量百分比为5～10％的赋性剂；
(8)将经过步骤(7)得到的液体0.22μm除菌过滤后真空冷冻干燥。
2.如权利要求1所述的注射用胎盘多肽制备方法，其特征在于：还包括在收集胎盘之后、将其组织破碎之前进行相关病毒检验的步骤。
3.如权利要求1所述的注射用胎盘多肽制备方法，其特征在于：步骤(3)中的低温、高温分别是-20℃和30℃。
4.如权利要求1或2所述的注射用胎盘多肽制备方法，其特征在于：步骤(8)中冷冻干燥的具体过程为：先迅速将制品温度降到-40～-55℃，维持2～3小时，抽真空至10Pa以下，经20小时缓慢升温升至25～30℃维持3小时左右。
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