CN1038512C - 促肝细胞生长素生产方法 - Google Patents

Abstract

一种促肝细胞生产素生产方法，属于生物制品药物生产方法领域。其特点是采用二步超滤技术截留分子量8000道尔顿的多肽成分，并且将细胞破碎匀浆与水浴加热同时完成。此方法克服了现有技术生产的同类药品所含多肽浓度低、制造中收率低以及使用中容易出现过敏反应等缺陷。特别适用于临床抢救重症肝炎或治疗慢性活动型肝炎。

Description

促肝细胞生长素生产方法

本发明涉及一种促肝细胞生长素的生产方法，特别是分子量小于8000道尔顿的促肝细胞生长素的生产方法，属于生物制品药物生产方法的领域。

为临床抡救重症肝炎及治疗慢性活动型肝炎，国内外许多学者正在积极探索胎肝细胞治疗机理及进行提取其有效成分的研究。1975年LaBrecque等首先报道了从大鼠肝脏中提取到一种肝再生刺激物质(Hepatic Stimulator Substance，Hss)，建立一种精典的提取方法(LaBreque DR，et al.Pre-paration and partial characterization of hepatic re-generative stimulator substance(ss)from rat liver.J.Physiol.1975，248：273)。Demetriou等于1978年对此种物质做了进一步的探索，并称其为“肝细胞生长促进因子”(Demetriou AA，et al.Production of a hepatocyte grow-th-stimulating factor by the regenerating liver.Gastroenterology 1978，75：959)。

LaBreque制备HSS的经典方法是：

(1)取动物肝脏加入35％的予冷生理盐水，将组织捣碎、匀浆、破碎细胞。

(2)在水浴中迅速将匀浆加热至95℃保持1.5分钟。

(3)27000g高速离心30分钟。取上清液加6倍体积的冷乙醇4℃搅拌2小时，27000g高速离心20分钟，弃去上清液，沉淀用双蒸水溶解至原液量即为粗制HSS。该制品仅用于HGF的性质、作用研究，因动物来源的HSS中含有大量的大分子杂质不能用于人体。近年来，有些学者，将此细胞因子命名为肝细胞生长因子(Hepatocyte Grcwth Factor，HGF)。HGF是一类具有特异性促肝细胞再生的物质，可分为大分子量(大于11万)，中分子量(2～6万)，小分子量(小于2万)，由于大分子量和中分子量的HGF均属于蛋白质类物质，容易使受者产生过敏反应，很难在临床上使用，而目前国内外学者都重点从事于大分子量和中分子量HGF的研究，因此较长时间徘徊于动物实验阶段。1989年，我国广州空军医院首先改进了LaBrecque等的传统制备方法，采用负压透析法，并以乳猪新鲜肝脏为原料，制备了分子量小于12000道尔顿，含有HGF的多肽类物质，并命名为肝细胞生长素(HGF)。在临床试用过程中取得了较好的疗效。该医院生产HGF(透析法)的步骤是：

1、将新鲜乳猪肝脏去外膜及韧带，切碎。

2、按固体与液体的比例1∶3加入蒸馏水，在组织捣碎机中打碎10000转/分×3分钟，共打碎7次，每次间隔5分钟。

3、3000转/分，离心20分钟，取上清液。

4、选用截留分子量12000的透析袋，将离心后上清液装入透析袋中，每袋不超过5000毫升，透析袋内外溶液按1∶2，在4℃无菌条件下负压抽滤透析8小时以上。本品含蛋白质0.6～0.7毫克/毫升。

5、收集透析外液，低温抽干浓缩，使每毫升溶液含蛋白质不低于5毫克，每瓶分装4毫升。

6、冻干、封口

用此方法生产HGF制剂主要有以下几点不足，(1)HGF收率低；(2)单位体积的多肽浓度低，给制剂工艺带来困难；(3)分子量偏大，在使用过程中容易出现过敏反应；(4)生产过程容易污染热原和细菌，生产环境要求高。(5)生产周期长。

本发明的目的是要提供一种HGF收率高、单位体积多肽浓度大、分子量小、生产过程不易污染、生产周期较短的方法。

本发明的目的是如此实现的：以新鲜乳猪肝为原料，采用以下步骤生产HGF：

A、加蒸馏水初搅，

B、细胞破碎匀浆与水浴加热同时完成，

   固体与液体比例1∶1

   加热温度95℃

   搅打时间1.5分钟

   冰盐浴中冷却温度至4℃

C、离心及过滤澄清，

   离心操作温度4℃

   离心机转速3000转/分，时间20分钟

   使用0.3微米过滤膜

D、将澄清液进行第一次超滤，

   超滤速度50-500毫升/分

   截留分子量10000道尔顿

F、将澄清液进行第二次超滤，

E.1、加入4％赋型剂，

E.2、用8000道尔顿超滤膜去除8000-10000道尔顿之间组分，

F、分装、冻干。

由于采用上述方法，本发明具有以下优点：

(1)采用初搅后，加热与匀浆同时进行的新工艺，可使细胞在短时间内破碎匀浆，一次处理量大，比匀浆器法可提高效率8倍，适合大规模生产的需要。并且在匀浆时加热，固体液体比例由1∶3增加到1∶1，提高了单位体积的蛋白含量。同时使热不稳定蛋白质沉淀、变性，离心后去除，为成品的热稳定性好，保存时间长打下了基础。经多次实验证明，使用本法肝细胞可达到100％破碎。在匀浆过程中加热，还可杀死一部分细菌。同时，使用二步超滤工艺亦可有效的除去制品中的热原质和残留细菌，因而本工艺在半无菌条件下即可生产，降低了对环境的要求。(2)首次使用切相流超滤器制备HGF。我们采用美国Milipore超滤设备，经多次生产证明，无论是大分子的分离和除菌、除热原效果，还是对保持HGF的良好生物活性都是可靠的。(3)首次选用收分子量8000道尔顿以下的组份作为HGF制剂成分。肝细胞生长素是一种含有多种肽类的混合物，而起关键作用的是HGF分子，因此，HGF的分子量测定成为HGF制剂的关键环节。国内外报道HGF的分子量测定结果不一，但均在10000道尔顿以上，因此，广州空军医院选用的透析袋是截留分子量12000道尔顿。由于该制剂是来自异体的动物脏器提取的多肽成分，含有芳香族氨基酸，有微弱的半抗原性，对个别T细胞功能缺陷患者可能发生过敏反应。而制品分子量大，大分子杂多肽成分也就多。我们在研究中发现HGF分子量实际小于8000道尔顿，是在7500道尔顿左右，进一步的实验结果证明8000～12000道尔顿的成分中几乎没有HGF的活性成分，因而小分子的HGF几乎全部在8000道尔顿以下组份中。这一发现使我们最终确定使用8000道尔顿的超滤膜进行截留，与透析法相比排除了12000～8000道尔顿之间的大分子杂多肽成分，使产品更加纯化。本发明提供的分子量小于8000道尔顿的促肝细胞生长素(以下简称8HGF)制剂，经氨基酸组成分析表明，其中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量显著低于用透析法生产的HGF，(以下简称12HGF)。此外紫外光谱分析也证明，在相同含量的情况下，8HGF在280nm处的光密度值低于12HGF在相同波长下的吸收值，说明8HGF含有较少的芳香族氨基酸，这一结果与氨基酸组成分析相吻合。由于8HGF具有较小的分子量，且含有较少的芳香族氨基酸，因此发生过敏反应的可能性大大降低，同时，急性毒性实验指出，8HGF的半数致死量LD₅₀为3000～3500毫克/公斤，而12HGF的LD₅₀是2100～2475毫克/公斤，由此可以看出8HGF制剂较12HGF更为安全可靠。我们采用8000道尔顿的截留分子量，不但大大提高了HGF的纯度而且又排除了相对大分子的多肽成分，大大降低了发生过敏反应的可能性，因此也大大降低了制剂的抗原性。保持药物疗效的同时，长期使用无不良反应。(4)在制备HGF过程中采用两步超滤法，增加了控制过程，减少了细菌污染机会，缩短了制备时间，特别适合于大规模生产，降低了生产成本，对防止生物制品的热原，提高产品的纯度均非常有利。

8HGF是最后保留8000道尔顿以下有效物质的生产工艺而得到的，除测得多肽含量外，尚含有少量的DMA、RNA和糖类等成分及一定量的游离氨基酸。特别指出的是本品中还含有有利于肝病恢复的高于正常人血清水平15倍左右的Zn和微量的Se，这些成分与12HGF含量基本相同，8HGF的稳定性实验指出，HGF95℃加热2分钟不失去活性是热稳定性蛋白质(多肽)。实验证明8HGF在4℃两年不失去活性，室温三个月活性仍保持在90％以上。而12HGF，4℃保存为十二个月，室温保存为一个月，表明8HGF较12HGF热稳定性提高了。尤其在4℃下保存期长更有利于临床使用，并为生产、销售过程中制品的质量提供了保证。

综上所述，本工艺加热匀浆一步完成，采用二步超滤技术，采用截留分子量8000道尔顿多肽成分，所建立的HGF制备方法在国内外均为首次。本工艺克服了透析法的不足，是目前生产HGF的最有效的方法。

分子量8HGF制剂与12HGF制剂性能比较；

1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、层析色谱分析

8HGF主带主要在7500道尔顿左右，平均分子量在7000道尔顿左右，12HGF平均分子量为10650道尔顿。

2、紫外吸收光谱

在相同含量情况下，8HGF在280nm处的光密度值明显低于12HGF在相同波长下的吸收值，说明8HGF含有较少芳香族氨基酸。

3、高压液相色谱组成分析

8HGF制剂中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸明显低于12HGF。

4、活性测定

几种方法制备的HGF制剂均无种属特异性，而具有器官特异性。8HGF刺激小白鼠DNA合成增加率与12HGF结果无明显差别。

5、药效学分析

在模拟动物肝衰模型中，在增加动物存活率、改善肝功能指标等方面，8HGF、12HGF均取得相同结果。

6、急性毒性实验

8HGF的半数致死量LD₅₀为3000～3500毫克/公斤，12HGF的LD₅₀为2100～2475毫克/公斤。

7、急性毒性、过敏、细菌、热原符合中国药典90年版规定。

实施例：

1、将新鲜乳猪肝去外膜及韧带、洗净，在不锈钢胶体磨中按固体与液体之比等于1∶1加入蒸馏水，初搅1分钟后，通95℃循环水，水浴加热循环搅打1.5分钟(细胞全部破碎)使细胞匀浆。将匀浆液迅速置于冰盐浴中冷却至4℃。

2、在4℃下离心3000转/分×20分钟，取上清液，利用0.3微米的滤膜过滤澄清。

3、澄清液用美国Milipore超滤器，截留分子量10000道尔顿，收集分子量10000道尔顿以下组分，超滤速度50～500毫升/分。

4、将超滤液按比例加入4％的甘露醇作为赋形剂溶解后再用8000道尔顿的超滤膜截留8000～10000道尔顿之间组分，收集8000道尔顿以下的多肽成分，本品每毫克含蛋白质不少于10毫克。

5、分装、冻干、质检。

Claims (1)

1、一种促肝细胞生长素的生产方法，特别是分子量小于8000道尔顿的促肝细胞生长素的生产方法，以新鲜乳猪肝为原料，其特征在于：

A、加蒸馏水初搅，

B、细胞破碎匀浆与水浴加热同时完成，

   固体与液体比例1∶1

   加热温度95℃

   搅打时间1.5分钟

   冰盐浴中冷却温度至4℃

C、离心及过滤澄清，

   离心操作温度4℃

   离心机转速3000转/分，时间20分钟

   使用0.3微米过滤膜

D、将澄清液进行第一次超滤，

   超滤速度50-500毫升/分

   截留分子量10000道尔顿

E、将澄清液进行第二次超滤，

E.1、加入4％赋型剂，

E.2、用8000道尔顿超滤膜去除8000-10000道尔顿之间组分，

F、  分装、冻干。