CN1041949A - 采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法,其特征是通过采集肝脏→高速捣碎成匀浆→离心沉淀→负压抽滤透析→正压超滤除菌等步骤制备肝细胞生长素(HGF)。具有:既有与LaBrecque法制备的肝再生刺激因子(HSS)相似的活性物质,又保留其它小分子物质的综合作用;简单方便实用;周期短;成本低产量高;易推广应用和大批量生产;厚料资源丰富,且避免了过敏反应作用;冻干品便于长期贮存和运输;产品临床治疗效果好,使用方便等特点。
Description
本发明涉及一种采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,特别是一种利用采集幼龄健康动物的新鲜肝脏,经高速捣碎、匀浆、离心沉淀、薄膜负压透析、正压抽滤除菌等步骤制备肝细胞生长素的方法,属于生化药物的制备方法。
目前国内外都在努力寻找既能阻止肝细胞坏死,又能促进肝细胞再生的物质或药物,先后研究了胰高糖素-胰岛素、前列腺素E2(PGE2)和表皮生长因子(EGF)等疗法,自McGowan等(McGowan JA et al:J Cell Physiol 1981;108:353~364)发现胰高糖素-胰岛素和EGF有促进[+H]胸腺嘧啶核苷掺入原代培养肝细胞DNA中的作用以来,临床上将胰高糖素与胰岛素联合应用治疗暴发型肝炎(简称G-I疗法)日益增多,但国内外对其疗法的评价尚不统一。Bucher等认为,胰高糖素、胰岛素单独使用无效果,但有加强EGF对肝细胞再生的刺激作用。由于胰高糖素、胰岛素和EGF均不是肝脏本身所产生,因而人们的注意力越来越集中到肝再生刺激因子(HSS)的研究与应用上,因为它是肝脏本身所产生,并已有实验资料证明具有刺激肝细胞再生的作用,将成为一种有希望的治疗急性肝功能衰竭与暴发型肝炎的有效方法。
在1975年LaBrecque从断奶大鼠肝脏按化学法提取肝再生刺激因子(HSS),并证明有明显促进肝细胞DNA合成作用。目前国外已有许多人按LaBrecque法原理,经捣碎、高速离心、加热、酒精提取或柱层析等步骤,生产出各种不同名称的肝细胞生长刺激物质。由于各实验室在动物选用,标本来源,提取方法和结果判定方面不一致,结果相差较大。但从总体分析,上述学者的制备方法工序烦琐,采用的仪器设备成本高,生产产量低,生产周期长,不利于推广应用,且这些产品在临床使用时对人体易引起过敏反应。国内已有用“人胎肝细胞悬液”治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎及肝硬化的报告,并取得较好的效果。但由于“人胎肝细胞”不能长期保存,肝脏供应与病情急需的时间差难于掌握;而且人胎肝脏也奇缺,不利于临床治疗,尚难于在临床推广应用。
本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种结合国内实际情况和临床需要,以幼龄健康动物的新鲜肝脏为原料,采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法,该制备方法简单方便,易于推广应用,便于大批量生产,而且可选择的原料资源丰富,生产出的肝细胞生长素(HGF)治疗效果好,使用方便。
采用本发明的方法制备的肝细胞生长素(Hepatocye Growth Factor.简称HGF)是一种耐热的蛋白质,经用高效液相色谱法分析,活性测定等鉴定,与LaBrecque法制备的肝细胞再生刺激因子(HSS)相似,对治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化有显著的疗效。作为一种耐热的蛋白质的肝细胞生长素(HGF),加热至65℃、15分钟时对活性无影响;甚至加热至100℃、15分钟时也相对稳定。因此,可在65℃~100℃的温度下加热、沉淀以除去胞溶质中的杂质(加热至95℃制备的肝细胞生长素(HGF),其特异性比加热至65℃的要高5倍,现已将加热至95℃、15分钟作为肝细胞生长素(HGF)的常规制备步骤。),在pH2~9范围内稳定,但在pH2以下失去活性。肝细胞生长素(HGF)带有较多的负电荷。肝细胞生长素(HGF)是一种分子量小于12000小分子物质,用1%的2-硫基乙醇与1%的二硫赤藓糖醇处理后不失去活性,即表明二硫键对于活性不是必需的。用胰蛋白酶消化能使肝细胞生长素(HGF)失去活性,表明它是一种蛋白质,而神经氨酸酶不影响肝细胞生长素(HGF)的活性,又表明它不是糖蛋白。肝细胞生长素(HGF)可用酒精沉淀,用40%酒精沉淀法制备肝细胞生长素(HGF),不仅可以提高它的纯度和特异性,而且还可以从胞溶质中除去胰高糖素、胰岛素等溶于酒精的物质。肝细胞生长素(HGF)的作用具有器官特异性,只能刺激肝细胞的DNA合成,促使肝细胞的再生;改善枯否氏细胞吞噬功能,防止肠道内毒素对肝细胞的损害;刺激胰岛素分泌,促使与肝细胞结合增加,利于肝细胞的修复;大量的支链氨基酸的存在,促使肝昏迷后的苏醒;多量的微量元素锌,促进免疫功能;β-葡萄糖醛酸酶的增加稳定溶酶体膜的功能,而对脾、肾和骨髓等的细胞则无作用。
本发明的目的可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法的特征是:
a.采集幼龄健康动物的新鲜肝脏(离体6小时内),除去肝膜及韧带后切碎;
b.加入蒸馏水在高速捣碎机中高速捣碎并制成匀浆;
c.离心沉淀,取上清液去沉渣;
d.将离心原上清液装入透析袋负压抽滤透析。
采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法具有操作简便、生产周期短、成本低、产量高的特点,而且所制备的肝细胞生长素(HGF)的冻干制品便于长期贮存。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法的特征是负压透析后收集的透析外液进行低温浓缩、测定多肽含量、调整多肽含量不小于5毫克/毫升。以确保制出的肝细胞生长素(HGF)的临床使用效果。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法,其特征是所制备的肝细胞生长素(HGF)采用正压超滤除菌。通过正压超滤除菌,进一步确保在无菌操作下制出的肝细胞生长素(HGF)的无菌质量和临床使用效果。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法的特征是所采集的新鲜肝脏为猪龄在60天之内的健康普通家猪(乳猪)的新鲜肝脏(离体6小时内)。既保证了产品的质量、降低了原料成本,又使得制备肝细胞生长素(HGF)具有丰富的原料资源。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法的特征是所采集的新鲜肝脏还可以是SD大鼠的新鲜肝脏、或无脑新生儿的新鲜肝脏(离体6小时内)。以充分利用原料资源。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法的特征是所说的除去肝膜和韧带后切碎的新鲜肝脏,按1克肝加入3克蒸馏水的比例加入蒸馏水,在高速捣碎机中高速捣碎并制成匀浆。以保证捣碎效果和速度、匀浆的质量、以及离心沉淀后的负压透析效果和具有较高的产量。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法的特征是以10000转/分的速度、每次高速捣碎机运转3分钟、共进行7次高速捣碎的方法进行高速捣碎并制成匀浆。既保证了较好的捣碎效果、提高了产量,又能比较节省能源。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法的特征是以3000转/分的速度、运转20分钟的方法进行离心沉淀,沉淀后取上清液去沉渣。以供装入负压透析袋负压抽滤透析。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法的特征是所说透析袋的透析膜是分子量为12000的透析膜,透析膜采用50%乙醇浸泡6小时、无热原蒸馏水冲干净。透析膜可以采用UNION CARBIDE CORPORATION出品的、分子量为12000的透析膜。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到:采用负压透析法制备肝细胞生长素(HGF)的方法的特征是将离心原上清液装入透析袋中,每袋最多不超过500毫升,用无菌绳子扎好,将两袋装入一个10000毫升的抽滤瓶内,然后按每1克肝加入7毫升蒸馏水的比例加入蒸馏水于瓶中,置于4℃的冰柜中负压抽滤透析8小时。
本发明制备出来的肝细胞生长素(HGF),经高效液相色谱组份分析证明,其色谱行为与LaBrecque报告的肝再生刺激因子(HSS)的结果极为相似,说明肝细胞生长素(HGF)中存在着与LaBrecque法制备的肝再生刺激因子(HSS)主要组份相同的物质,而且大鼠、家猪及无脑新生儿的肝脏之间无明显的差异。经紫外线扫描发现肝细胞生长素(HGF)样品中有两个主要吸收峰,推测除多肽成分之外还有较大比例的核酸存在。对肝细胞生长素(HGF)平均分子量等项目测定证明,肝细胞生长素(HGF)是一种分子量低于12000的小分子物质,并排除肝细胞生长素(HGF)中有胰岛素、胰高糖素存在的可能性;活性测定表明有明显的刺激肝细胞DNA合成的作用,与盐水对照有显著的差异。
本发明相比现有技术具有如下优点:
(1)既可获得与LaBrecque法制备的肝再生刺激因子(HSS)相似的活性物质,又可充分保留肝细胞内其它小分子物质的综合作用;
(2)制备方法简单方便、生产工艺实用;
(3)生产周期短;
(4)成本低、产量高;
(5)易于推广应用、便于大批量生产;
(6)既保证了制备肝细胞生长素(HGF)有丰富的可选择的原料资源(如选用60天之内的健康家猪-乳猪),又避免了临床治疗中的过敏反应作用;
(7)所制备的肝细胞生长素(HGF)质量标准明确,冻干制品便于长期贮存、运输;
(8)所制备的肝细胞生长素(HGF)临床治疗效果好,使用方便。
而且本发明所制备的肝细胞生长素(HGF)经临床试用,具有降酶幅度大、速度快,退黄显著,无副作用等特点;并能明显改善患者肝区疼痛、乏力、腹胀等症状及增加食欲,对降低SAPT有效率88.2%、血清胆红素100.0%、HBeAg阴转率52.20%。
本发明下面将结合实施例作进一步说明以及利用各图表对本发明所制备的肝细胞生长素(HGF)作进一步说明:
本发明的一种实施例如下:
制造工艺为:
1.采集猪龄在60天之内的健康普通家猪(乳猪)的新鲜肝脏(离体6小时以内),将其肝膜及韧带拔去后切碎;
2.按1克肝加3克蒸馏水的比例加入蒸馏水,然后在高速捣碎机中打碎,运转速度为10000转/分、分7次捣碎、每次3分钟,制成匀浆;
3.以3000转/分的运转速度进行20分钟的离心沉淀,取上清液去沉渣;
4.采用UNION CARBIDE CORPORATION出品、分子量为12000的透析膜经50%乙醇浸泡6小时,无热原蒸馏水冲干净;
5.将离心原上清液装入透析袋中,每袋最多不超过500毫升,用无菌绳子扎好,将2袋装入一个1万毫升的抽滤瓶内,然后按每克肝加7毫升蒸馏水于瓶中,置于4℃的冰柜中负压抽滤透析8小时;
6.收集透析外液,低温浓缩,测多肽含量,根据含量调整体积每毫升含多肽量不应低于5毫克。
7.正压超滤除菌。
制备出的肝细胞生长素(HGF)进行分装,分装步骤为:
1.无菌测定,热原质检测合格后正式分装;
2.在机械运转正常,其它物品用具准备就绪后,即可进行分装,在分装过程中应注意观察、机械出故障或发现异常应尽快排除和处理不能带病操作,停机维修时要保护好制品避免污染;
3.制品应做到随分装随进柜(冻干机柜);
4.全部分装过程中应严格注意无菌操作,制品应由原容器内直接分装,同一容器的制品应当日分装完毕,不同亚批的制品不得连续使用同一套灌注用具。
5.肝细胞生长素(HGF)的冻干共溶点为-8℃至-12℃;
6.样品合格后低温(-20℃)保存。保存时间暂定1年。
在本发明制备肝细胞生长素(HGF)时,对仪器及材料要求:
1.在制备过程中,一切与制品接触的工具、器皿,均应注意不能污染热源,使用前均需用30%NaOH涂抹处理,30分钟-60分钟后,冲洗干净或经180℃ 1-2小时干热处理或大火锅直接烧灼处理后无菌待用;
2.取用健康普通家猪(乳猪),必须核实猪龄在60天之内;
3.生产所用各种化学药品应不低于化学纯,符合中国药典规定。
本发明所制备的肝细胞生长素(HGF)的临床应用效果和分析结果如下:
一、肝细胞生长素(HGF)治疗组(称甲组)及胸腺肽对照组(称乙组)的病例诊断治疗对照:
表1: 两组治疗前病情比较
表2: 两组治疗后SALT的复常率
※P<0.01
表3: 两组治疗后自觉症状改善的比较
※P<0.01
表4: HBV标志物的转换
※P<0.05
二、肝细胞生长素(HGF)的高效液相色谱组份分析结果如图1、图2和图3所示:
1.LaBrecque法制备的肝再生刺激因子(HSS)和本发明制备的肝细胞生长素(HGF)及其采用SD大鼠、猪龄60天之内的家猪(乳猪)和无脑新生儿三种幼龄动物的新鲜肝脏制备肝细胞生长素(HGF)样品图谱如图1所示。
在图1中,图1a、b、c、d、e的色谱峰图表明:本发明采用SD大鼠、猪龄60天之内的家猪(乳猪)和无脑新生儿三种幼龄动物的新鲜肝脏制备的肝细胞生长素(HGF)样品,通过采用高效液相色谱仪,在规定的色谱条件下,各制备物对应峰的保留时间基本一致,而且与LaBrecque报告的色谱洗脱图形(图1e)极其相似,但各种制备物组份之间的紫外线相应值因样品来源不同而有些差异。值得注意的是,按LaBrecque法制备的肝再生刺激因子(HSS)的色谱图谱如图1d所示,其主要峰亦与本发明制备的肝细胞生长素(HGF)的色谱图谱基本一致,说明这两种提取方法的药物存在极其相似的色谱行为。
2.不同波长条件下对采用家猪的新鲜肝脏制备的肝细胞生长素(HGF)样品色谱图谱如图2所示:
在图2中,图2a、b、c、d分别为本发明采用家猪制备的肝细胞生长素(HGF)在紫外线280、260、230、及210mm检测波长下的反相色谱洗脱图,表明家猪制备的肝细胞生长素(HGF)在检测波长280及230mm下,主要相应组份比较明显,可能是属于蛋白质或多肽的相应组份,但在波长260及210mm下主峰可明显检测到两个组份峰,表明肝细胞生长素(HGF)中含有较大比例的核酸或多聚核酸物质。
3.肝细胞生长素(HGF)的细胞色素C,胰高糖素及胰岛素的色谱图如图3所示:
在图3中,图3a、b、c、d分别为细胞色素C、胰高糖素及胰岛素反相色谱洗脱图,表明在相同的色谱条件下,胰高糖素、胰岛素的保留时间分别为7.84、12.86分钟,可认为肝细胞生长素(HGF)中不可能存在上述两种组份。但细胞色素C(WM:11700)的峰保留时间与肝细胞生长素(HGF)的主要洗脱峰极其接近,以肝细胞生长素(HGF)的平均分子量(见图5)亦表明,肝细胞生长素(HGF)与肝再生刺激因子(HSS)的分子量是近似的。
三、肝细胞生长素(HGF)氨基酸含量分析如表5所示:
表5: 肝细胞生长素(HGF)氨基酸含量测定结果
名称 | 含量(W%) | 名称 | 含量(W%) | 名称 | 含量(W%) |
Asp | 1.39 | Ala | 1.18 | Tyr | 0.48 |
Thr | 0.39 | Cys | 微 | Phr | 0.73 |
Ser | 0.72 | Val | 0.84 | Hls | 0.58 |
Glu | 3.14 | Met | 0.56 | Try | 2.48 |
Pro | 0.94 | Ile | 0.67 | Lys | 1.11 |
Gly | 1.23 | Leu | 1.66 | Arg | 6.96 |
表5说明:采用本发明的方法制备的肝细胞生长素(HGF)含有18种氨基酸,总量占25.06%。
四、肝细胞生长素(HGF)微量元素分析结果如表6所示:
表6: 肝细胞生长素(HGF)微量元素分析结果
名称 | 含量(μg/ml) | 名称 | 含量(μg/ml) |
Fe | 7.8 | Ca | 35.0 |
Se | <0.05 | Mn | 0.40 |
Mg | 111.5 | Co | <0.005 |
Zn | 15.8 | Cu | 0.76 |
Na | >500 | K | >2000 |
表6表明,肝细胞生长素(HGF)中除含有K、Na、Ca、Mg外,还存在着比正常人血清高15倍的Zn和微量的Se。
五、肝细胞生长素(HGF)紫外线扫描分析结果如图4所示:
图4表明,肝细胞生长素(HGF)在波长180-380mm的扫描图谱中存在两个吸收峰,196.7及257.5吸收值分别为2.4349及0.478,推测是多肽和核酸峰。
六、肝细胞生长素(HGF)平均分子量测定结果如图5及表7所示:
图5和表7说明:肝细胞生长素(HGF)的平均分子量均低于标准样品的分子量,所以,根据峰保留时间推测,试样的平均分子量在12000以下,按峰面积估算主峰2、3、4相对百分比含量最高。
表7: 分子量标准品与肝细胞生长素(HGF)分子量比较
七、肝细胞生长素(HGF)生物活性测定结果如表8所示:
表8: LaBrecque法(1)制备的肝细胞再生刺激因子(HSS)
和本发明(2)制备的肝细胞生长素(HGF)活性比较
表8中数值为3-6只大鼠至少重复二次以上的平均值,每组为配对资料。表8中说明LaBrecque法制备的肝再生刺激因子(HSS)和本发明制备的肝细胞生长素(HGF)活性与盐水对照均有非常显著的差异,而动物之间基本相同。表明本发明可以替补LaBrecque法,而且取材广泛的家猪可以作为本发明制备肝细胞生长素(HGF)的主要来源。并且表8证明了本发明采用动物肝脏制备的肝细胞生长素(HGF)均有明显促进肝细胞DNA合成的效果;胰岛素、胰高糖素、表皮生长因子虽均不是肝脏本身所产生,但肝细胞溶质中可含有胰岛素、胰高糖素,过去认为需经酒精沉淀法去除这两种成分,但本发明提取的肝细胞生长素(HGF),经紫外线扫描分析,从图3鉴定的结果否定了胰岛素、胰高糖素存在的可能性。因此可以认为表8的实验结果是由于样品中的肝细胞生长素(HGF)作用所致。
附图的图面说明如下:
图1是高效液相色谱组份分析对比的色谱峰图;
图1中,a是本发明采用SD大鼠的新鲜肝脏制备的肝细胞生长素(HGF)在波长为280mm的色谱峰图;b是本发明采用家猪(乳猪)的新鲜肝脏制备的肝细胞生长素(HGF)在波长为280mm的色谱峰图;c是本发明采用无脑新生儿的新鲜肝脏制备的肝细胞生长素(HGF)在波长为280mm的色谱峰图;d是LaBrecque法采用家猪(乳猪)的新鲜肝脏制备的肝再生刺激因子(HSS)在波长为280mm的色谱峰图;e是LaBrecque报告的肝再生刺激因子(HSS)在波长为280mm的色谱峰图;
图2是本发明采用家猪(乳猪)的新鲜肝脏制备的肝细胞生长素(HGF)在不同波长条件下的高效液相色谱组份分析的反相色谱洗脱图;
图2中,a是在波长为280mm的反相色谱洗脱图;b是在波长为260mm的反相色谱洗脱图;c是在波长为230mm的反相色谱洗脱图;d是在波长为210mm的反相色谱洗脱图;
图3是本发明制备的肝细胞生长素(HGF)在波长230mm的细胞色素C、胰高糖素及胰岛素高效液相色谱组份分析的反相色谱洗脱图;
图3中,a是细胞色素C在波长230mm的反相色谱洗脱图;b是胰高糖素在波长230mm的反相色谱洗脱图;c是胰岛素在波长230mm的反相色谱洗脱图;
图4是本发明制备的肝细胞生长素(HGF)在波长180-380mm的紫外线扫描分析图;
图5是本发明制备的肝细胞生长素(HGF)的平均分子量测定色谱峰图。
Claims (10)
1、一种采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是:
a.采集幼龄健康动物的新鲜肝脏(离体6小时内),除去肝膜及韧带后切碎;
b.加入蒸馏水在高速捣碎机中高速捣碎并制成匀浆;
c.离心沉淀,取上清液去沉渣;
d.将离心原上清液装入透析袋负压抽滤透析。
2、根据权利要求1所述的采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是负压透析后收集的透析外液进行低温浓缩、测定多肽含量、调整多肽含量不小于5毫克/毫升。
3、根据权利要求1或2所述的采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是所制备的肝细胞生长素采用正压超滤除菌。
4、根据权利要求1或2所述的采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是所采集的新鲜肝脏为猪龄在60天之内的健康普通家猪(乳猪)的新鲜肝脏(离体6小时内)。
5、根据权利要求1或2所述的采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是所采集的新鲜肝脏还可以是SD大鼠的新鲜肝脏、或无脑新生儿的新鲜肝脏(离体6小时内)。
6、根据权利要求1或2所述的采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是所说的除去肝膜和韧带后切碎的新鲜肝脏,按1克肝加入3克蒸馏水的比例加入蒸馏水,在高速捣碎机中高速捣碎并制成匀浆。
7、根据权利要求6所述的采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是以10000转/分×3分钟×7次的方法进行高速捣碎并制成匀浆。
8、根据权利要求1或2所述的采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是以3000转/分×20分钟的方法进行离心沉淀,取上清液去沉渣。
9、根据权利要求1或2所述的采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是所说透析袋的透析膜是分子量为12000的透析膜,透析膜采用50%乙醇浸泡6小时、无热原蒸馏水冲干净。
10、根据权利要求9所述的采用负压透析法制备肝细胞生长素的方法,其特征是将离心原上清液装入透析袋中,每袋最多不超过500毫升,用无菌绳子扎好,将两袋装入一个10000毫升的抽滤瓶内,然后按每1克肝加入7毫升蒸馏水的比例加入蒸馏水于瓶中,置于4℃的冰柜中负压抽滤透析8小时。
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