CN102210889A

CN102210889A - 一种用于人工肝透析的体外生物材料及其制备方法

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Publication number: CN102210889A
Application number: CN2010101393160A
Authority: CN
Inventors: 胡卓汉; 张瑞祺; 杨幼明; 赵书民; 米娜·哈力甫
Original assignee: RUIDE LIVER DISEASE INST (SHANGHAI) CO Ltd; Shanghai Changzheng Hospital
Current assignee: RUIDE LIVER DISEASE INST (SHANGHAI) CO Ltd; Shanghai Changzheng Hospital
Priority date: 2010-04-02
Filing date: 2010-04-02
Publication date: 2011-10-12

Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及一种用于人工肝透析的具有代谢解毒功能的体外生物材料及其制备方法。本发明的人工肝透析用的体外生物材料，其含有猪肝细胞组分，尤其是猪肝亚细胞组分，通过雄性约克夏种白猪肝组织准备、匀浆、离心及药物代谢酶和代谢解毒检测步骤制得。实验证实，本发明提供的新的含有猪肝细胞组分的人工肝透析用的体外生物材料，能够代谢45％的胆红素，既含有肝的代谢解毒酶，又含有代谢解毒所必须的辅酶、具有应用于人工肝透析的作用，可用于替代人工肝透析治疗中的生物系统。

Description

一种用于人工肝透析的体外生物材料及其制备方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及透析用生物材料，具体涉及一种用于人工肝透析的具有代谢解毒功能的体外生物材料及其制备方法。

背景技术

生物性人工肝透析是维持和改善情况危急的肝功能衰竭患者生命的有效治疗方法。通常，生物性人工肝透析由如下两大部分组成：(1)透析的机械系统，其包括泵、半透膜支撑系统；(2)生物性系统，生物性系统主要分为细胞型代谢解毒和亚细胞型代谢解毒的生物材料。目前生物性人工肝的机械系统在技术上已经获得成功，也已经用于市场；生物性系统中的细胞型代谢解毒的生物材料面临的挑战是细胞的分离纯化的经济成本很大，细胞在肝透析系统中的支撑技术难度很高，限制了细胞型生物性人工肝透析的临床应用。然而细胞组分型代谢解毒的生物材料面临的挑战是参与代谢解毒的辅酶在制备过程中基本损失，辅酶的制备的经济成本很大，限制了亚细胞型生物性人工肝透析的临床应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种人工肝透析用的体外生物材料，具体涉及一种新的用于人工肝透析的具有代谢解毒功能的体外生物材料，尤其是一种新的猪肝亚细胞组分生物材料及其制备方法。

本发明的一种新的人工肝透析用的体外生物材料，其特征在于，其含有猪肝细胞组分，尤其是猪肝亚细胞组分。

本发明提供的新的猪肝亚细胞生物材料既含有肝的代谢解毒酶，又含有代谢解毒所必须的辅酶、能应用于人工肝透析。

本发明所述的人工肝透析用的体外生物材料通过下述方法和步骤制备：

1，试剂准备：

2、制备体外生物材料

1)组织准备

雄性约克夏种白猪肝，-80℃冷藏保存，其中每克肝组织准备3.0至3.5毫升的预冷的缓冲溶液A，在每毫升缓冲液A中加入20mM BHT，冰袋中保存；

2)匀浆

采用匀质机10000rpm下开始匀浆，去掉组织中的脂肪层及黏稠物，转速降至9200rpm下时停止；组织匀浆置于冰上保存；

3)离心

转移匀浆液至高速离心试管中，盖盖，于9000g下离心25分钟

离心完成后取出试管，置于冰袋中，上清液(S9)，经双层纱布过滤，缓冲液A及BHT的混合液稀释S9至20mg/ml，分装至2ml冷冻管中，编号，-70℃.下保存

本发明中，猪肝亚细胞组分生物材料其中的猪细胞组分采用雄性约克夏种白猪肝分离制备，蛋白浓度调整到40毫克/毫升。

3、药物代谢酶和代谢解毒检测效果检测

对该体外肝制品的药物代谢酶进行非那西丁O-脱乙基化、香豆素的7-羟基化和睾酮的6-羟基化等特征化研究。用胆红素与细胞色素P450辅酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶辅酶和该产品于37℃共同孵育60分钟，同时以0℃孵育为阴性对照。胆红素的葡醛酸化用-葡萄糖苷酸酶水解加以证实。胆红素解毒实验所用人血浆通过受试者知情同意。样品中胆红素的浓度用已被开发并被验证的HPLC方法检测。实验中以孵育后胆红素母体的消失表示该制品的解毒能力。

结果显示，

1、所述的的猪亚细胞型代谢解毒的生物材料其代谢动力学结果表明非那西丁O-脱乙基化的活性的Km为85uM、香豆素的7-羟基化活性的Km为17uM，睾酮6-羟基化的活性的Km为117um(如表1所示)。

表1猪肝细胞成分的细胞色素P450亚酶活性。

Table 1：Activities of CYP450s of the porcine liver preparation

2、代谢解毒结果：用胆红素与细胞色素P450辅酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶辅酶和本发明的猪肝亚细胞组分于37℃共同孵育60分钟，同时以0℃孵育为阴性对照。胆红素的葡醛酸化用-葡萄糖苷酸酶水解加以证实。胆红素解毒实验所用人血浆通过受试者知情同意。样品中胆红素的浓度用已被开发并被验证的HPLC方法检测。实验中以孵育后胆红素母体的消失表示该制品的解毒能力。以不含人血浆的缓冲液配制的20，40，100和200uM的胆红素与该制品孵育后分别代谢14％，31％，46％，和45％。以人血浆配制400uM的胆红素与该系统孵育后25％的母体被代谢。结果显示，大部分胆红素葡糖苷酸化的产物能够被β-葡糖苷酸酶水解(图2)。

实验证实，本发明提供的新的含有猪肝细胞组分，尤其是猪肝亚细胞组分的人工肝透析用的体外生物材料，能够代谢45％的胆红素，具有应用于人工肝透析的作用，可用于替代人工肝透析治疗中的生物系统。

附图说明

图1是辅酶体系对6β-羟基睾酮形成的影响。

图2是胆红素被猪肝细胞成分葡糖苷酸化。

具体实施方式

实施例1制备人工肝透析的体外生物材料

1，试剂准备：

冰醋酸(上海试剂一厂)，

1M Tris Acetate Stock(Sigma)，

1M Tris Acetate母液(Sigma)，

1M KCl Stock(上海试剂一厂)，

1M KCl母液(上海试剂一厂)，

5N NaOH(上海试剂一厂)，

100mM EDTA Stock(上海试剂一厂)，

20mM BUT Stock(Sigma)，

Buffer A(瑞德肝脏)，

0.5％Lysol(上海元吉化工)。

2、制备过程

1)组织准备

(1)从-80℃冰箱中取出清洗过的肝脏(雄性约克夏种白猪肝)，

(2)将肝脏置于冰袋中直至使用，

(3)每克肝组织准备3.0至3.5毫升的预冷的缓冲溶液A，

(4)在每毫升缓冲液A中加入20mM BHT，冰袋中保存，。

(5)称重肝脏80克为一批，清洗后冰上储存。，

本发明中，保存液A和20mM BHT按现有技术制备(中国专利200410016343.3)。

2)匀浆

(1)安装匀质机并启动，

(2)从冰中取出1升的烧杯至匀浆板中，

(3)缓慢抬起板至匀浆机顶部接触到烧杯顶部，再降低板高度约一寸，

(4)保持匀浆板高度不变，

(5)将烧杯口用膜封住，防止匀浆中样品的损失，

(6)打开匀浆机于10000rpm下开始匀浆，

(7)匀浆液必须匀浆彻底，

(8)如果组织中富含脂肪或黏稠的组织，匀浆速度会减慢。注意：若转速降至9200rpm下时须停止，应去掉组织中的脂肪层及黏稠物，

(9)重复上述步骤直至全部组织匀浆均匀，

(10)倒回1升烧杯中，置于冰上。

3)离心

转移匀浆液至高速离心试管中，盖上试管盖，

称重各个离心试管，

按所需吸取匀浆液以保证试管重量相等使离心机保持平衡，

若数量为奇数可用装水的试管代替，

将平衡的试管直接相对放置，

于9000g下离心25分钟，

离心完成后取出试管，立即置于冰袋中，

用双层纱布罩住烧杯的口，

从试管中缓慢倒出上清液(S9)，经双层纱布过滤至1升的烧杯中，防止将上层的脂肪层倒出，

2毫升的冷冻管先于-20℃冰箱中预冷，

用缓冲液A及BHT的混合液稀释S9至20mg/ml，

把S9分装至2ml冷冻管中，

盖上冷冻管，

记录试管编号，

冷冻盒上贴上标签，

所有成品装入盒中于-70℃.下保存，

制得含猪细胞组分的体外生物材料。

效果检测：

制得的含猪细胞组分体外肝制品，蛋白浓度调整到40毫克/毫升。对该体外肝制品的药物代谢酶进行非那西丁O-脱乙基化、香豆素的7-羟基化和睾酮的6-羟基化等特征化检测。用胆红素与细胞色素P450辅酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶辅酶和该产品于37℃共同孵育60分钟，同时以0℃孵育为阴性对照。胆红素的葡醛酸化用-葡萄糖苷酸酶水解加以证实。

本发明中，胆红素解毒实验所用人血浆通过受试者知情同意。

本发明中，样品中胆红素的浓度用本领域已知的并被验证的HPLC方法检测。

本发明实验中以孵育后胆红素母体的消失表示该制品的解毒能力。检测结果显示，

1、药物代谢酶代谢动力学结果表明非那西丁O-脱乙基化的活性的Km为85uM、香豆素的7-羟基化活性的Km为17uM，睾酮6-羟基化的活性的Km为117um(如表1所示)。

表1猪肝细胞成分的细胞色素P450亚酶活性

Table 1：Activities of CYP450s of the porcine liver preparation

2、猪肝细胞组分的代谢解毒检测结果显示：用胆红素与细胞色素P450辅酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶辅酶和猪肝亚细胞组分于37℃共同孵育60分钟，同时以0℃孵育为阴性对照。胆红素的葡醛酸化用-葡萄糖苷酸酶水解加以证实。胆红素解毒实验所用人血浆通过受试者知情同意。样品中胆红素的浓度用已被开发并被验证的HPLC方法检测。实验中以孵育后胆红素母体的消失表示该制品的解毒能力。以不含人血浆的缓冲液配制的20，40，100和200uM的胆红素与该制品孵育后分别代谢14％，31％，46％，和45％。以人血浆配制400uM的胆红素与该系统孵育后25％的母体被代谢。

大部分胆红素葡糖苷酸化的产物能够被β-葡糖苷酸酶水解(图2)。

本发明实验中所用试剂，及雄性约克夏种白猪肝组织均为市购。

Claims

1.一种用于人工肝透析的体外生物材料，其特征在于，其含有猪肝细胞组分。

2.按权利要求1所述的人工肝透析的体外生物材料，其特征在于，所述的猪肝细胞组分采用雄性约克夏种白猪肝分离制得，蛋白浓度调整到40毫克/毫升。

3.一种制备权利要求1的体外生物材料的方法，其特征在于，包括下述方法和步骤：

1，试剂准备，

2、制备体外生物材料

1)组织准备

2)匀浆

采用匀质机10000rpm下开始匀浆，去掉组织中的脂肪层及黏稠物，转速降至9200rpm下时停止，组织匀浆置于冰上保存；

3)离心

转移匀浆液至高速离心试管中，盖盖，于9000g下离心25分钟，离心后取出试管，置于冰袋中，上清液过滤，加入缓冲液A及BHT的混合液稀释至20mg/ml，分装，编号，-70℃下保存；

4)药物代谢酶和代谢解毒检测。

4.按权利要求3的方法，其特征在于，所述的体外生物材料的药物代谢酶检测是对该材料的药物代谢酶进行非那西丁O-脱乙基化、香豆素的7-羟基化和睾酮的6-羟基化特征化检测。

5.按权利要求3的方法，其特征在于，所述的体外生物材料的代谢解毒检测是以孵育后胆红素母体的消失表示该生物材料的解毒能力。