CN1127995A - 人造肝装置及其用于血液和血浆体外净化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种净化生物流体的装置和一种使用该装置的净化方法。本装置设计为一个可用来选择性地行使正常人的某些肝功能的人造肝。其中，培养基带着非固定化的或是固定于惰性载体上的活的肝细胞，在装置中循环。血液或血浆在半透膜的一侧流过，另一侧是细胞培养基，透过膜扩散进入培养基的溶质被肝细胞代谢和/或由附加的净化措施所捕捉。有些不需要的物质，它们不能由血液或血浆扩散到含有肝细胞的培养基中去，则由附加的去除措施去除之。

Description

人造肝装置及其用于血液和 血浆体外净化的方法

本申请为对在1992年9月11日申请的、而现已放弃了的美国专利No.07/943,777作部分继续申请。发明背景1.发明领域

本发明涉及一种用于血液和血浆的体外净化的装置和方法。它尤其涉及到一种类似于用来治疗肾功能不全的血液透检装置，并使用了新的生物学手段以模拟正常人的许多肝功能。因此，本发明中的装置与方法可用于对患有肝脏疾病或接受过肝移植的病人作辅助治疗和功能维持。2.现有技术的历史

为了充分理解本发明，有必要对与人类肝脏功能和疾病有关的解剖学与生理学原理作一概述。肝脏器官分成两大叶，它是由称作小叶(lobnlus)的功能单元组成的。每一小叶由呈辐射状排布于一个中心静脉周围的许多肝细胞带构成。在这些肝细胞带间是窦状隙，排布着称为kupffer细胞(肝星形细胞)的吞噬细胞。含氧血由肝动脉输入肝脏而去氧血由门静脉排出肝脏。这些血管的分枝将血液传输入窦状隙，肝细胞由此吸收氧、最大量的营养物质和某些毒素。

尤其是，当含高血糖的血液流经肝脏时，过量的葡萄糖被去除并以糖原的形式贮存。当血糖浓度低于正常水平时，糖元降解为葡萄糖并由肝细胞释放入血液中。肝还辅助蛋白质代谢，可通过吸收和贮存血液中过量的氨基酸用以构建血浆蛋白，如清蛋白。胆汁，即含有胆盐、胆红素、胆固醇和脂肪酸的溶液，可乳化脂肪以助肠对脂肪的吸收，它也是由肝细胞产生的。然而，通常它并不由肝细胞排入血液，而是被运送并贮存于胆囊中。

对于本发明来说，重要的不是肝在食物消化中的作用而是它对于调节血液中废物与毒素浓度的作用。肝细胞中含有的酶可以降解血液中的毒素，将他们转化为较为无害的物质；若不能进行以上两种过程，则将其贮存起来。例如，氨基酸代谢会导致游离氨基酸和含氮废物的释放，后者由肝细胞转化为尿素。当含量正常时，这些尿素是无害的，可由肾脏和汗腺顺利地排泄。“老”的红血细胞和某些细菌也可被破坏，在前者情况下，可由Kupffer细胞进行再循环。

简而言之，肝对于维持人体正常的生化状态是十分重要的。肝功能的损伤或丧失将是致命的，有关已知的可能的肝细胞代谢紊乱的简述可在Podolsky，et al.，“肝细胞代谢紊乱”ch.315，Principlesof Internal Medicine，10th ed.，pp1773—1779，1983中找到。医学界已经有了几种治疗或补偿肝疾病、损伤或功能丧失的方法。而且，人类(和许多其他生物一样)有能力再生丧失或是损坏了的肝组织。

然而，辅助性药物治疗或是移植虽然可以缓解或消除许多肝病的症状，但是这些方法都需要时间，这对于一个急性病人来说是不具备的。而且，在接受治疗时，必须提供对任何正常肝功能丧失的支持以维持代谢的体内平衡。因而，需要有一种手段在肝功能丧失时代它行使净化功能，从而为治疗赢得时间。

多年来一直提倡的体外肝灌注(即将血液泵送到外源肝组织中)作为一种治疗和支持手段，有一些成功的例子。一个用重复肝灌注进行长期肝功能维持的例子可见于Abouna，et al.，“以周期性肝灌注进行长期肝功能维持”，The Lancet，pp.391—396，(Aug.22，1970)，其中报道了一个丧失肝功能的病人用周期性肝灌注维持了76天，然而，尽管可用5种来源的肝组织，但是免疫反应和其它生化反应限制了灌注法的使用，有的病人在找到合适的移植器官捐献者之前就死亡了。

还使用过单独移植肝细胞的方法，结果也是有成功有失败。(如参见，Makaowa，L.，et al.，Can.J.Surg，24：39—44，1981和Demetrion，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7475—7479，1986)。

相反，血液和血浆的体外净化，即通过血液透析、血液灌注或血液过滤已被广泛用于肾功能不全的治疗。使用这些方法的主要目的是维持体液平衡和电解质平衡并去除体内废物。

在肾透析中，血液被泵送进一个透析仪中，其中在透析液中悬有一张人造的半透明膜。当就某一物质在膜两边形成了一定的浓度梯度时，该物质就会由血液中流入透析槽中。该方法可成功地降低血液中尿素的浓度和血浆中钾的浓度。那些在血液或血浆中浓度不能改变的物质，例如血浆中钠的净去除可在膜两边形成一个流体静压，产生一个使溶质通过半透膜的对流。有关传统的血液透析仪的结构，还有液体温度、透析液浓度及液体流向的控制的细节可见于几个已知专利，包括有美国专利No.5,011,607 to Shinzato，美国专利4,923,598 to Schal，美国专利No.4,894,164 to Polaschegg，和美国专利5,091,094 to Veech。

在操作中，血液直接由病人体内抽出泵送入透析器沿膜的一侧流动。透析液反向由泵送入流过膜；净化后的血液被送回病人体内。

以上所述的血透析对于去除水溶性的和非蛋白结合型的小分子物质尤其有效。因此，它虽然可用于某些药物过量的治疗，但主要还是用于肾功能不全的治疗。欲将此法用于肝功能丧失的补偿，必须进行附加的血液脱毒过程。

为此目的，医学界提出了一些不可移植的、体外的生物人造肝装置，并已进行临床实验(如参见综述，Nyberg，et al.，Am.J.Surg.，166：512—521，1993)。虽然这类装置的设计与操作各不相同，但它们都有一些通用的要素。例如，这些装置都使用分离的肝细胞代谢流过的血液中的溶质，和一张或多张透性膜。用于那些使用分离肝细胞的装置的肝细胞总是被固定于一支持基质上以促进细胞的分化与凝集。

例如，运用本部分继续申请的母案中的许多概念，一个含有位于反应器中空纤维中的固定于裹有骨胶原的微载体小珠(CYTODEX3，Pharmacia的产品)上的肝细胞，这种人造肝经实验证明比将肝细胞包于凝胶或凝胶粒中的反应系统能更有效地转运代谢产物(Roz-ga，et al.，Biotech.and Bioengineering，43：645—653，1994；还可参见，Miura，et al.，Anrif，Org.，10：460—465，1986[有关藻朊酸钙凝胶作为细胞支持物的使用]，和Cai，et al.，Artif.Org.，12：383—393，1988[细胞的凝胶包埋法])。

还有在人造肝中运用分离肝细胞的其它方法，可将细胞固定于微载体上装于层析注中用于灌注(Demetriou，et al.，Ann.Surg，25 9—271，1986)，装入中空纤维(Jauregui，et al.，J.CellBiochem.，45：359—365，1991；还可参见，美国专利No.5,043,260)，放在玻璃平皿中排列于一个舱中用氧化基质灌注(Uchino，etal.，ASAIO Proc.，34：972—977，1988)，装在去唾液酸糖蛋白聚合物上(Akaike，et al.，Gastroenterol.，28 Supp.45—52，1993)，和装入充满了如玻璃珠这样的基质物质的床层中(Li，et al.，InVitro Cell Dev.Bio.，29A：249—254，1993)。这些方法的效率受限于细胞的较短暂的存活性(短至几小时；Demetriou，et al.)，难以形成细胞凝集体，削弱了细胞与营养物质、代谢产物和毒素之间的接触(这是因细胞固定于一载体而部分遮避了细胞表面的结果)。

此后，发展出了改善细胞存活性和凝集性的技术(如参见，专利申请公告93-272876[WO 9316171]，其中描述的一个系统类似于公开于上文中Li，et al.，In Vitro Cell Dev.Bio.，中的内容)。但是，医学界普遍认同，用于体外肝维持的肝细胞凝集与功能完善除了依赖于细胞固定化外至少还依赖于细胞与基质的附着。(如参见，Rotem，et al.，Bio tech and Bioegineering，43：654—660，1994[肝细胞是固定化依赖型细胞]；Miura，et al.，Biomatter Artif.CellsArtif.Org.，18：549—554，1990[肝细胞的正常功能需要细胞的凝集；为此目的，应进行细胞的固定化]；Rozga，et al.，Ann.surg.，217：502—511，1993[将细胞固定于微载体上加强了细胞的功能与分化]；上文中Rozga，et al.，Biotech amd Bioengineering，[将细胞装在微载体上或包埋于凝胶中的方法]。

相反，使用膜和游离的分离肝细胞悬液的传统血液透析方法，还未见有效用以临床肝维持的报道(如参见，Olumide，et al.，surgery，82：599—606，1977)。因此，在医学界正在发展和实验中的使用分离肝细胞的生物人造肝将细胞安装于一基质上，这一过程需要建立起一个相当细致的细胞/底物结合的生产步骤，它有损伤细胞的危险。发明概述

本发明包括一个装置和一项方法，用于净化如血液或血浆那样的生物液体(即去毒素)，血液或分离血浆在至少含有一张贯穿其间的半透膜的反应器中循环。这张半透膜的形式可以是管状、膜状或中空纤维(后者为佳)，四周含无菌培养基溶液以维持肝细胞和/或肝癌细胞系(在以下的说明中，除上下文另有需要，“肝细胞”一词既指分离的肝细胞也指那些与Kupffer胆道上皮细胞和内皮细胞的混合，在有些例子中还包括成纤维细胞)。(血液或血浆中的)可溶性蛋白、葡萄糖和毒素透过半透膜扩散入培养基中供肝细胞进行代谢。

在一个具体化例子中，本发明中所用的肝细胞被安装于生物学上相容的微载体颗粒上。利用某些方法使微载体在细胞培养液中循环，例如利用变化的磁场作用于微载体中的磁体。当扩散的分子(即溶质)与固定化了的肝细胞相接触时，就按照正常肝细胞应答这些分子的功能被吸收和降解、转化或贮存。流出的血液或血浆(与先前分离的血红细胞组分重新混合后)重新输回给病人。

在本发明的优选实例中，使用了未固定的肝细胞(即不与基质结合或未固定化的细胞)。某些方法被用来促进细胞在装置中(即体外)凝集，给那些需要肝功能维持的病人提供体外肝功能维持。

还有其它的净化手段如血液过滤装置，活性炭柱或其化树脂吸附剂的吸附方法和/或传统的透析装置用来去除不能被肝细胞所降解或贮存的毒性药物或废物(例如分泌入培养基中的尿素)。这种装置也可用来去除任何不为肝细胞所结合的抗体，例如异种移植肝组织的抗体。附图简要说明

图1，使用未固定化肝细胞和图1中装置的实施例图解。

图2，包含了附加净化手段的本发明的改变后的实施例图解。

图3，表明鼠肝细胞样品在图1所示设备中循环21小时后活性细胞所占百分数的图表。由台盼蓝排除反应测定活性。

图4，表明猪肝细胞在图1调和中循环6小时后活细胞所占百分率的图表。

图5，表明将图1设备用于活体，一雄猪血浆的体外净化时在其中循环了6小时后鼠肝细胞存活百分率的图表。

图6，表明鼠肝细胞在图1设备的肝细胞环路中循环一定时间后，血液环路中血液中氨浓度的降低程度。

图7，表明鼠肝细胞在图1设备的肝细胞环路中循环一定时间后，血液环路中尿素浓度的降低程度。优选实例描述A.细胞的分离与制备

本发明的一个主要特征是使用活的、分离的肝细胞，来辅助净化本该由肝病、肝损伤、肝功能丧失病人的肝自行排除的血液或血浆中的物质。在大多数实例中。这些细胞是非人类的、人类的、或异源的。但是，必须明确，肝癌细胞也可作为肝细胞用于本发明。因此，肝细胞因其较小的致病可能性而成为优选细胞，但此处的“肝细胞”应包含肝癌细胞。如可用由the American Type Colture Collection，Rock-cille，Maryland得到的人肝癌细胞系Accession No.CRL 8024。

本发明中所用肝细胞的制备方法如下：

适用于本发明的肝细胞的分离方法是已知的(如参见Taka-hashi，et al.，Artif.Org.，17：653—659，1993)。在人造肝系统中使用人肝细胞可减少使用非人肝细胞所带来的免疫反应的危险。但是，人类肝细胞的来源是十分有限的。所以，在非人肝细胞中，本发明优选猪肝细胞，因其较易得到而且在生理学上与人肝细胞很相似。还可以这样预言，猪肝细胞尤适于将本系统用于肝移植病人，因为猪组织被修饰后可成为人类移植的异种器官来源。但是，也应当认同，其他哺乳类动物也可能是本发明中的肝细胞的合适来源。

以使用猪肝组织为例，小叶中的肝细胞必须立刻取自刚宰杀的动物。用已知的方法对疾病筛选小叶组织。然后，用已知的方法酶(骨胶原酶)解，将肝细胞从小叶组织中分离出来，并纯化(如参见Berry，et al.，J.Cell Biol 43：506—520，1969；Seglen，MothodsCell Biol 13：29—83，1976中描述的技术和下文中的例1)。根据所用的分离方法，Kupffer细胞和小时组织的其它细胞组分(如胆道上皮细胞)也会包含在肝细胞中。如有必要，可在如由Sigma chemicalof st.Louis，MO.销售的60％PERCOLL溶液中低速沉降(50xg)肝细胞以进一步纯化。

由于导致肝病的生化状态还不明确，因而还不能确定样品中的各种细胞在何种程度上影响肝功能。优选使用的是纯化的肝细胞样品；但是，此处的“肝细胞”应理解为包含单独的肝细胞或成纤维细胞，或是与Kupffer细胞、胆道上皮细胞和内皮细胞组合在一起的细胞。也可望使用用基因方法改变后所产生的细胞或代谢肝的特殊产物如清蛋白和凝血因子的细胞。这些细胞可单独使用，也可与原肝细胞混和使用。

用于本发明一实施例的一种或多种肝细胞一经纯化，就可固定于一种生物惰性的载体上，最好是直径为150—200μm的微珠。在这一方面最好使用自然物质的聚合物，如葡聚糖微珠，可用商品名CY-TODEX 3得自Pharmacia LKB Biotechnology of Uppsala.Sueden)。也可使用与此相当的材料，如海藻糖小珠(可得自Bio-Rod，Inc.of Richmond，California)或其他基质如玻璃。因此，虽然用以支承肝细胞的传统基质被提为微珠，本专业人士应当知道或很容易地推断出，适于实施本发明的其他支持基质。

这些珠子最好涂覆一层良性的骨胶原或相当的生物物质以确保肝细胞可固定于其上。优选骨胶原是因为肝细胞与之结合时不需要异源纤维结合。

使用合适的方法的实例可见于：可向Pharmacia LKB Biotech-nology索得的“微载体细胞培养：原理与方法”，Gjessing，et al.，Exp.Cell.Res.129：239—249，1980，和Demetrion，et al.，Sci-ence，23：1190—1192，1986，在此引用的参考可说明本行业中有关细胞与微载体基质结合的知识。例如，使用一个可购得的离心管，每ml细胞培养物中可加入10mg的葡聚糖珠。向珠子中加入肝细胞，至其在细胞培养基中的终浓度为1×10⁵个细胞/ml，缓慢搅拌并在37℃培养。如果结合不易进行，随着培养基体积的增加，也许需要周期性的搅拌。

但是，在本发明的优选实施例中，肝细胞并不固定于基质上或固定化。所以，用于本实施例的肝细胞以前述方法分离，以下述方法保存。

固定化的和非固定化的肝细胞可保存于温度低于-75℃的无菌环境中。最好，将它们冷冻后保存于液氮容器中按保存用于人工授精的分离精子的相同方法保藏。一个特别适于肝细胞冷冻保藏的方法可见于Rozga，et al.，Biotech.and Bioegineering，43：645—653，1994.另一个冷冻保藏肝细胞的方法可见于Dixit，et al.，Trans-plantation，55：616—662，1994，其中将细胞包埋并冷冻于燥朊酸钙中。用冷冻法，虽然细胞可保存几年，但还是以不超过一年为宜。然而最好，为可行性计，肝细胞应在分离后马上使用。

使用肝细胞，细胞应悬浮于一生物适应的培养基中。如果是冷冻过的，细胞应在一合适的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液中融解和清洗，最好，培养基中含有本专业一般技术人士已知或可推断的可维持肝细胞活力的营养物质和补充成分。适用于肝细胞维持的培养基的一个实例是以商品名RPM！-1640由Grand Island Biologicals，Grand Island New York出售的培养基。另一适宜的可购得的培养基是GIBCO Laboratories，Grand Island，NY.提供的WAY-MUTH培养基。依据系统中所用特定细胞的需要，应自培养基中补充本专业人士所知的盐类或营养物质(即，依纯肝细胞还是混和细胞，肝细胞使用长短，代旋物质的种类等而不同)。这类加入的物质可包括一种或数种氨基酸，营养物质和稳定剂，例如丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、血清、氨基酮戊酸、油酸、地塞米松、甲状腺素、维生素E、胰高血糖素、胰岛素和艮他霉素，所有这些都可购得。下文中的实施例1将详细描述一合适的补充后的培养基。尤其当细胞以纯化的目的而需经历6小时以内的分离或解冻，培养液可改为任何与血液相生物适应的液体，例如盐水。B.适用于本发明方法的生物人造肝装置1.适用于非固定化肝细胞的装置的构建与操作

现在参见附图，图1表示的是使用非固定化肝细胞和本发明装置的一个优选实施例，图2对图1作了适当的修饰。本发明中的装置主要由一个至少有一张半透膜贯穿其间的净化生物反应器，和至少两台泵或其他用来形成装置中肝细胞和血液或血浆循环的装置。通常，本发明中的每个装置都有一个第一通道(即生物流体环路20)和一个第二通道(即肝细胞环路5)，两者以至少一张半透膜隔开。装置的所有部件(包括连接件、压紧装置、路厄塞、管道和容器)应该灭菌处理。

此外，透析液和血液的温度与压力的传感与控制的方法，和其中有关溶质的浓度测定技术是本行专业人士所已知的，以下描述的可能是适用于本发明装置的技术。为了说明清楚，可能要参考上文背景部分提到的一些细节。

生物液体环路20中的液体必须以体温进入而且以相同的温度输给病人。该流体温度的维持可通过本专业人士所已知的血液或血浆温度的体外控制技术实现；例如，在血浆去除、血液储存和输血过程中使用的维持温度的方法。肾透析和/或肾过滤的控温手段还可见于美国专利4,894,164(公开了一种肾透析中与加热的渗透液作用后的血液的冷却技术)。同时也建议在本发明中的过程中维持血液温度34℃(如参见，Maggiore，et al.，Proc.EDTA 18：597—602，1981).还需要一氧气源(即，氧发生器9)向肝细胞供氧。

一种特别合适的温控方法是将装置的大部分部件放入一足以维持装置中循环流体的温度于体温(例如，对人而言是37℃)的绝热培养箱中。合适的培养箱材料是本专业人员已知的或是很容易推断而知的，并且包括耐用容器如不锈钢容器中的泡沫塑料和玻璃。

必须指出，全系统的操作，包括截流技术、流体进入和流出混和容器1和肝细胞环路5内各节点的开始与结束，还有在生物流体环路20中的进入、穿行和流出，在一个净化循环中必须是连续的。系统的控制方法(未示)用带有人控功能的微过程，宜参考已知的用于控制肾透析和肾过滤那样的方法。

作为电控方法的替代或优化，应有可控制全系统的人控方法(未示)，可允许由一个熟练的操作者来打开和关闭进出生物流体环路20中各站点的阀门，控制泵8，14和15，以及控制流体在肝细胞环路5中的进出。

此外，虽然图1中给出了泵的特定位置，但机械工程的专业人士应当认同，环路中可保含在其他位置而非图中所示的一台或更多台这样的泵。

参见图1，该装置的一个实施例包含有一个混和容器1，它是为了在细胞经肝细胞环路5进入净化反应器7之前，将未固定化和未污染的(即“新的”)肝细胞引入其中进行循环以促进它们的凝集。混和器1有导入口2(用以将新鲜的肝细胞导入混和容器1)，和取样口3(用以排除已污染的肝细胞(即“老的”)和培养液)，肝细胞循环出料管口4、肝细胞循环进料管口5和排污管6。为方便计，这些接口由穿透并固定于容器1壁的管子构成。

例如，如果混和容器1由玻璃做的，接口2—6可用玻璃管做成，如图1所示的以适当位置穿透并固定于容器1壁。这些接口还能通过以管夹式其他对等的压紧装置关闭的软管与一个路厄塞或其他相当的配合件一同安装于混和容器1壁上。关于接口2—6的其他设计与材料对于一般专业人士是显而易见的，在此不再赘述。

肝细胞回路本身(不包括下文中的站点)应是一个由动脉状软管或与混和容器1和净化反应器7所用材料生物学相适或相似材料制成的一个环路。肝细胞环路5以可封闭方式固定于混和容器1的出口4和进口5。可以使用一个O—环和O—环连接夹等方便地完成封闭连接，后者可调节以增减O—环上的压力。

混和容器1和净化反应器7的材料必须是生物学相适和非细胞毒性的，最好聚合物如丙烯腈丁苯(“ABS”)树脂塑料、聚丙烯、聚砜、玻璃或与此相当的材料构成以符合USPXXI VI级毒性测试标准。

混和容器1的大小可各不相同，但总体上足够容纳至少相当于待处理的哺乳类动物肝重的1％的肝细胞；即，细胞数量的“理论最小值”。例如，对于人类，可有效地进行血液和血浆的体外净化的细胞数的理论最小值是肝细胞总数的1％或约20亿个细胞。所以，混和容器1的大小必须至少可容纳悬于无菌的、生物学相适的液体中的理论最小数的细胞，以令肝细胞能在其中循环；即，在混和容器中细胞不能充满至固定化值。

净化反应器7的大小依据系统中循环的血液和血浆的体积。此体积由1/2品脱至4品脱不等，前者适用于儿科应用而后者是与血浆扩张剂和血浆血产品一同使用的成人应用的上限值。

净化反应器7通过一个外连接与生物流体进行流体交换，它可形成一个待处理的生物流(即血液或血浆)的循环。净化反应器最好是一个中空纤维生物反应器。在一中空纤维生物反应器中，生物流体通过依应用而定的不同尺寸所允许的可溶性蛋白(可能包括抗体)和代谢废物交换的半透膜构成的许多毛细管(如图1中的7′所示)，从净化反应器7流过。

为了这一目的，膜孔经大小可大至允许象抗体这样的蛋白质透过。必须指出，使用大孔径的膜时，某些欲收集的物质(如血浆蛋白)可能扩散进入培养基。回收这些物质的方法将在下文叙述，然而，由于这一现象，孔径0.2mm左右的膜最可取，它还能形成明显的对流，这是溶质穿透构成中空纤维的膜的主要推动力。

可购得的适于作净化反应器7的是中空纤维反应器ZYMAX(ZYMAX是Microgon，Inc.of Laguna Hills，California的注册商标)。ZYMAX产品由3600根由混和纤维素酯组成，孔径为0.2μm，是由可允许可溶性蛋白与代谢产物透过的半透膜制成的中空纤维构成。这些纤维装在一个有接口的、生物学相适的、非细胞毒性的聚砜容器中；配件，包括得自生产商的为构建该生物反应器所必需的压紧装置、垫片、管子和插头。其它适用的中空纤维反应器是Microgon的Z22M-060-01X生物反应器(其中只有670根纤维，但使用了比许多常规生物反应器更长的纤维[封装端间约550mm])。和[其他实例？？？？？？]

所需的中空纤维(如图1中7′所示)的总数依净化反应器7中所容纳的培养基体积而定，培养基体积又依将在其中进行净化的生物流体的体积(该体积决定悬于培养基中的肝细胞数)而定。例如，已知血液或血浆的体积和中空纤维的容积与透性(对一个ZYMAX反应器，腔容积约200ml，0.2μm孔径)就可以估算出纤维总量和培养基体积。作为一普遍原理，应根据培养液体积使中空纤维的表面积达到最大，以保证在肝细胞环路5中循环的肝细胞在净化器7中与血液和血浆中的溶质充分接触。

在净化反应器7中，肝细胞环路5由反应器中的毛细外空间构成，生物流体循环20由毛细内空间构成；即反应器7中含中空纤维7′的腔。肝细胞环路中肝细胞的移动由泵14推动(例如，一蠕动泵)，而生物流体环路中血液和血浆的流动由泵8推动(例如，一台血液检测泵)。

如本发明前面的背景中所论述的，迫切要求人造肝系统中肝细胞凝集一起。如前所述，培养基中未凝集的单个肝细胞比凝集状态肝细胞更快衰亡。因为这个原因，现有技术的人造肝系统中，在将细胞用于人造肝系统之前提供了一个可使肝细胞在一个生物反应器中凝集的细胞外固体基质，和/或以一种可促使凝集球体形成的方式进行细胞培养。

肝细胞的凝集过程需要能量，因此，虽然不为肝细胞的生存所绝对需要，但已知氧的存在，尤其在凝集早期可增强肝细胞在人造肝系统中的活力(如参见，Rotem，et al.，Biotech.&Bioengineering，43：654—660，1994[获取肝细胞与骨胶原基的基质的单层连接的最大值的半数需要0.064mm Hg的氧分压，同时需要0.13mm Hg以使细胞在基质中内扩散])。当用于人造肝系统或培养物的肝细胞以多层形式出现时，表层以下细胞的供氧也许需要缩短肝细胞和氧气源之间的扩散距离或提高凝集过程早期阶段的氧浓度(Rotem，etal.，上文659)。

在本发明的优选实施例中，肝细胞既没有固定于一个固体基质上，也没有预培养成一个凝集球体。而是，将细胞直接引入由与血液相适应的液体组成的循环悬浮液中(以盐溶液或是上文中描述的肝细胞培养基为佳)，并促使它们就地凝集。本发明对肝细胞的利用取消了细胞的预培养工作，取消了将细胞固定于一固体基质上的工作，保证每个细胞的全部表面可与培养基中的其他细胞、氧气、营养物质和代谢产物相互作用，使在预培养或固定化细胞过程中可能发生的对细胞特性造成的损害降至最小，并且缩短了细胞从分离到用以本发明所述方法的时间。

为发保证循环悬液中非固定化肝细胞的供氧，混和容器1中与血液相适的液体由贮罐13经泵15送入，其它流体由管线18送入。流体经专业人士已知的传统氧发生器9充氧。为了供氧，打开循环泵14以使管线18中的流体经与出口4阀门连接的管线12和氧发生器9流入管道19。出了氧发生器9，培养液流经pH探头10和溶解氧探头11。

pH探头和溶解氧探头被安装于适当位点，可由此改变培养液中的气体组成。培养基的pH值维持于7—8，并以7—7.5为佳，以7.35为最佳。培养基中的氧浓度维持在0—20％，以不低于5％为宜。氧的最佳浓度是将肝细胞引入培养基时的饱和空气中的浓度。氧组成通过增加或减少由氧发生器9引入的培养基的氧气浓度调节，而培养基的pH值可通过增加或减少由氧发生器9引入CO₂的适宜浓度来调节。氮气用以维持气相平衡。在氧发生器中引入培养基的气体流向与流体的循环方向正好相反。培养基由接口4进入混和容器1，气体由接口6离开该系统进入排气桶16。

生物流体循环如下所述。待净化的血液或血浆可以取自病人然后再引入系统，也可以由病人直接引入系统，后者较佳。在优选实施例中，血管连接可参照如用于急性或慢性肾透析的、医学界已普通认可的技术(例如，导管插入术，原血管或人工移植体的直接吻合术)。在最佳实施例中，欲净化的生物流体为血浆。将血液取自病人之后，用本专业人士已知的设备与技术(未示)的血浆去除法分离出血红细胞而得血浆。去血浆可以在生物流体循环之外独立进行，但最好包含在环路内，这样可使去血浆设备与病人直接血管连接。

血浆(或是未经去血浆处理的未分离的血液)通过一个联结管(未指出)经生物流体循环20进入中空纤维7′，或者，在优选实施例中，可使用象ZYMAX产品这样的生物反应器，每个反应器中都需按生产商的说明安装导管。导管的结构依所用中空纤维7′的数量与结构不同而异，但应与上文所述的用于制造混和容器1一样，必须是由生物学相适的、非细胞毒性的材料制成，或是一根本行专业人员所知的人造软管。可在生物流体环路20的进口与出口安装阀21和22(未示)。阀21宜采用压力控制(例如，由图2所示调压器24控制)，这样可有足够的压力将净化后的血液输回病人。适用的阀门是本专业所熟知的，此文中不再细述。

生特流体环路20中血液或血浆的流体可由血液或血浆离开病人体内时产生的流体压力差推动，但最好在进入环路20前由一低压泵8辅助，该低压泵最好配备一个压力稳定器(未示)以防止回流。图2建议安装测流计25和控制器30。由于流量控制方法在本行中是熟知的，在此不再细述。还须设法将空气由净化反应器7中排出(未示)，此类方法同样是本行中是熟知的，也不再细述。

经生物流体循环20流入反应器7的血液或血浆中的非细胞组分通过膜结构的中空纤维7′与肝细胞环路中的培养液进行交换。一经交换完成，肝细胞就由导入接口2引入混和容器1，然后再加入需要的培养液以保证混和容器1仍被液体所充满。此外，肝细胞也可以在培养液与血浆交换过程中引入混和容器1。

在这一方面，专业人员应认识到使用非固定化的肝细胞需要精确平衡肝细胞环路中的流速，保证细胞间的充分接触与凝集，同时不使细胞剪切受损。同时，在缩短治疗上有效量血液或血浆所需脱毒时间方面的要求必须与溶质由膜结构中空纤维7′向肝细胞环路(即反应器7中的毛细外空间)传递的最佳速度方面的要求相平衡。

为此，生物流体环路20的流动方向要与肝细胞环路5流动方向完全相反。通过一台用于培养基充氧的反向循环泵14，含肝细胞的流体以约20—80ml/min，约65ml/min为佳的流速流出混和容器1，经反应器7，通过探头10和11及氧发生器9。同时，通过血液控制泵8，血液或血浆在环路中的流速维持在20—250ml/min，以150—200ml/min为佳。

必须指出，生物流体环路中的流速可简便而有效地通过一个流体贮罐得以控制。将血液或血浆贮存在这个贮罐中，一定贮量的流体可按本发明法的操作提供高于流体完全直接源自病人所可能得到的更高的流速与流量。使用贮罐，如此处所另作的描述，流体取自病人，导入贮罐，经阀门流入生物流体环路。

再回到生物流体环路20中的物流的问题，当血液或血浆通过中空纤维7′流动，可溶性蛋白和代谢废物依靠中空纤维中生物流体与反应器7中培养基之间的渗透压，还有所谓的透膜压而扩散入培养基。

应当认识到，与肾透析过程不同，本装置中不需要通常的透过中空纤维7′的逆流。虽然可推测，当环路20中的流体和培养基相对达到平衡时，会出现溶质反扩散，但这样的反扩散可以通过补充培养基避免，由附加的净化手段(例如，图2中40和50所示)补偿，也可由中空纤维7′两侧的浓差而减至最小。

但是，当膜的孔径需要较大时，逆流也许是重要的了；例如，当发现从血液中扩散出一些大分子物质的时候。但是，那些物质也许是必须输回给病人的血浆蛋白。在这样的应用中。可以使用多途径捕捉血浆蛋白，和利用逆流将它们返还到生物流体回路中，(如参见，美国专利No.5,011,607中描述的逆流泵方法)。例如，如果被移滤液中物质的直径是已知的，比较小的血浆蛋白(如清蛋白)就可以设法(未示)用一张反向固定的孔径更小的次级半透膜捕捉后返还到环路20之中。原滤液中物质因分子太大不能由次级膜扩散而仍以溶液状态留在培养液中，以供肝细胞代谢。

当缺少方法返还给病人合乎需要的物质时，尤其是特定的血浆蛋白，这些物质可以通过已知的医学方法单独返还给病人。但是，由于存在外源血制品感染的危险，这并不是一个好的方法。

作为一条普遍原理，那些易被肝细胞所代谢或贮存的、在培养基中呈溶液状态的蛋白质和废物(下文称“溶质”)是会被与之接触的肝细胞所吸收的。但是，可推断，所达到的吸收程度至少受两方面因素的制约。

首先，某些溶质可能因为不与肝细胞接触、或不与活性肝细胞接触而留在溶液中；也就是一种过滤吸收的能力。这后一种可能性导致了第二个限制因素；即，肝细胞可能死亡、损伤或变得无法在系统中行施期望的功能。

由于无法测定或预言一个给定的肝细胞何时会失去其功能，有必要通过取样口3全部或部分置换使用过了的肝细胞。但是，根据前文描述的方法，用于本设备的肝细胞应该能在设备中至少存活6小时，这样一段时间对于一个成人病人作一次治疗已足够长。

此外，因为未被肝细胞吸收的溶质残留在溶液中(由于上述讨论的原因，或者由于某些毒素并不易被肝细胞代谢)，有必要附加一些去除手段和周期性地更换培养基。

为此，肝细胞环路5可能包括一个位于取样口3的补料站(未示)，在此，环路被暂时打断以移去和补充肝细胞，如有必要，还在系统中加入培养基。补料站可以有许多种结构，包括安装有供“旧”细胞和培养基流出和“新”细胞和培养基流入的阀门的(未示)无菌的，有接口的罐或管。

在一个净化循环过程中，这种流出与引入最好在预先设定好的间歇进行，以保证整个过程的优化。由于肝细胞与培养基的全部替换在一个净化循环过程中是不太现实的，因此最好采用统计百分率替换的方法。这一百分率，还有进行替换的时间，依系统中培养基、细胞，生物流体的体积不同而异，如果这些值已知，则可以通过已知的统计学计算方法确定该百分率。另外，作为可选方案或与上述方法结合，也可以在每次循环后进行细胞和培养基的全置换。

完成一个净化循环之后，血液通过与前述将血液或血浆导入生物流体环路20相同的管道输回给病人，或是血浆则将血浆先送回去血浆装置与病人的血红细胞重新混和后再输回病人。应该认识到，在将血液输回给病人之前或之后，可通过IgM免疫分析和/或肝功能测试以确证本发明过程的操作正确与有效。根据治疗过程不同和循环时间的需要，净化循环可在一天内重复二至三次。

至于附加的去除措施，生物流体环路20中的流体在经过反应器7之后，在返回病人或再次通过反应器7之前可通过一个或多个附加的净化站。同样，根据欲再去除物质的不同，这些装置也可包括在肝细胞环路5中，例如，对于那些由肝细胞分泌入培养基的代谢废物，如尿毒，去除装置最好安装在肝细胞环路5中。

由于有作用于或导致肝功能丧失或损伤的生化状态根据临床原因而不同(如肝炎、酒精或毒物污染、过量服药)，并且还没有被完全揭示，因此不能确定特定的病人需要何种体外肝功能。哪雪功能完全或主要由肝细胞完成，哪些可能必须由副加措施完成也都不明确。但是，这些措施的实例是医学界所共知的，在图2中相应地以副加净化措施40和50指出，并且可能包括：

·用活性炭柱或有涂覆层的活性炭(例如，商品名为“GAM-BRO”的过滤器)、其他树脂吸附剂(一可购得的吸附器为Ash Medi-cal，Inc.west Lofayette，Indiana的“DT”机[解毒器])来去除如尿毒素这样的溶质的吸附措施。

·去除水溶性的和不与蛋白质紧密结合的小分子的传统透析措施。

·去除可与猪的异种抗原反应的人血清中的原IgM抗体的免疫反应。免疫吸附的材料的实例包括以商品名SPECTRA/POR6、SPECTRA/POR7、SPECTRA/POR1由VWR Scientific出售的透析膜。SEPHAROSE 6mb珠上附着的外源凝集素也可用于分离IgM抗体(这些珠子可由Pharmacia LKB购得)。根据已知技术，分离和净化措施可以是人控的也可以是自控的；这类措施的一个实例是Pierce，Rockford，Iuinoiz出售的商标为IMMUNOPURE的产品(IgM净化试剂盒)。

血液过滤措施(即，使血液通过一个血液过滤器流过一个体外回路的方法，在这个血液过滤器中含尿毒素的超滤液被阻滞同时通过一个交换单元按比例加入对等量的不含尿毒素的血液)。

由于实施每个附加净化步骤都需要时间，在两个环路中使用或不使用这些附加措施将会增加或减少整个净化循环的完成时间。然而，必须认识到，这些措施可通过使用独立于本发明系统所介绍的方法去实现。

必须明确，稳妥的医学实践表明，生物反应器7在每一次净化循环之后最好是废弃、更换或消毒，而且不可以用于1个以上的病人。可以推断，根据具体的治疗过程，如果以恒速进行每个净化循环将持续几个小时，而且，专业人员应认识到，相对于图1和图1所示系统中的单个反应器通过配备如上文所述的附加的管道、配件和泵，可能平行使用不只一个反应器。C.本发明方法中使用固定化肝细胞装置的构建与操作

专业人员应该认识到，上文所述的装置也可用于利用固定化肝细胞进行血液或血浆的脱毒。但是，使用了固定化肝细胞，就没有必要再去确保肝细胞环路中的流体流速能足以促进肝细胞凝集。相反，流速应尽量减小到使固定化肝细胞间的接触免受损伤。另外，固定化肝细胞可通过肝细胞环路中的补料站和/或取样口直接导入反应器7。为此，装置可如图2所示进行简化。

在人造肝系统中使用固定化肝细胞可带来前文所论述过的缺点，例如减少了肝细胞与可被代谢的溶质间的接触面积。为了补偿细胞表面积的损失，在本发明实施例中采用了令肝细胞在装置内循环的措施。

然而，为了避免与反应器7内表面的接触而损害肝细胞，这一循环必须温和地进行。出于这一考虑，培养基的机械搅拌或是反应器7的振动是反应器内肝细胞获得循环的可选方法，但不是优选手段。取而代之的优选手段是，利用一个变化的磁场作用于反应器。

根据这一方法，使用了一个低频交流电源31(例如，60次/秒)，和至少一对电学连接的相反的感应圈32，以产生一个交变的低频磁场。感应圈32最好相对地安装于反应器7外；最好将它们罩在绝缘的罩子中以合适的连接方式安装于反应器7外壁相对的两侧。由于对安装于有肝细胞固定于其上的葡聚糖或其他微载体23内的磁体(图2中以如带“X”的珠23A表示装有磁性颗粒的珠子，带磁性颗粒珠子所占的比例至少达1/10)的作用可在培养基形成一个非常温和的环流。带有磁体的微珠可购自Dynal，Inc.of Great Neek，NewYork，商品名为DYNABEADS M-450。

另一种可使溶质与固定化的肝细胞尽可能接触的获得循环的方法是使用一台界面层泵。最有用的是带有膜状或片状(而不是中孔纤维)的膜，界面层上可形成一股沿膜表面流动的带有肝细胞的培养基流。如果特定要使用中空纤维膜，可用泵将肝细胞和培养基引入穿过具有足够大直径的一个轴向导管(未示)，并在其中形成肝细胞和培养基的螺旋或循环。

界面层泵法及其用于固体颗粒的移动可见于Gurth的美国专利No.4,335,994。这类泵可购自Giscoflo Corporation in SanteeCalifornia，商标为DISCFLO PUMP。Discflo Corporation可提供DISCFLO PUMP安装与使用的说明与帮助。

除了这些改变，本发明装置的操作与安装的可选实施与前文所述的优选实施法相同。

以下是本发明方法与装置的实施例。实施例是用来进一步说明本发明而不是限制本发明的范围。以下均使用标准缩写(例如，“ml”表示毫升，“min”表示分钟，等)。实施例1利用非固定化肝细胞的如图1所示的人造肝装置的体外测试

肝细胞分离自以Li，et al.[引用？]，1990中所描述的方法牵杀的Sprague-Hawley鼠和家猪。简言之，该方法主要使用了骨胶原酶(0.5％w/v，1型)灌注法。该分离得的细胞群经台盼蓝排除法测定存活率达80％以上。分离之后，将肝细胞悬于培养基WAYMUTH752/L并补充11.2mg/L丙氨酸、12.8mg/L丝氨酸、24mg/L的天冬酰胺、0.168mg/ml氨基酮戊酸、0.393mg/L地塞米松，0.03mg/L胰高血糖素，20单位/；的胰岛素，和84mg/L的艮他霉素。

以培养基充满混合容器、反应器和生物流体回路，在总体积为约350ml的培养基中将氧浓度平衡在20％。在生物流体环路中加入20μg/ml的氨作为人造肝装置中代谢的模拟废物。向混和容器中注射约200,000,000个活性鼠肝细胞，而在第二个装置中，则在混和容器中注入等量猪肝细胞。肝细胞环路与生物流体环路中的循环随即开始，并在这两个循环中将流速都维持在65ml/min。

21小时后存活的鼠肝细胞数显示于图3。6小时(含猪肝细装置测试的全部时间)后存活的猪的肝细胞数见图4。以传统技术测定存活率，如台盼蓝染色排除法。

图5与图6所示为6小时后这两个装置中培养基内氨浓度显著降低程度。如图所示，氨浓度显著降低。根据这些数据和下文实施例2中的数据可推测，人的血液或血浆中的氨浓度可降低的系数约为10％。实施例2使用非固定化肝细胞的图1所示的人造肝装置的体内测试

图1所示装置中使用实施例1中所述的鼠肝细胞，但不直接将培养液导入生物流体环路20。建立一个幼公猪(重约26kg)的股静脉与生物流体环路之间的静脉连接。血液由猪的股静脉以约150ml/min的流速向反应器灌注，同时不断将血液向猪回输。

在6小时的灌注过程中观察猪的生理现象和血液化学性质。周期性地由取样口收集混和容器中的肝细胞，以台盼蓝染色排除法测定存活率。

图5所示为图中所示不同时刻存活细胞的百分数。

图6所示为测得的图中所示时刻自生物流体环路的血液中的氨浓度降低情况。图7为相同时刻、相同样品中尿素浓度的升高情况。

如图所示，实施例2中报道的观察到的用于体内系统的效率和循环后肝细胞的存活率是与用于体外的测量值相当的。使用人造肝装置未对猪造成任何健康损害。

虽然在此公开了本发明的优选实施例，专业人士应该认识到，在不背离下文权利要求书中所定义的本发明的精神与范围下，还可以有许多方案。

Claims (43)

1.一个用于哺乳类动物的生物流体诸如血液和血浆之类的体外净化的装置，其特征在于它包括：

一个生物反应器，其上有供生物流体分别进出的进出管口。有供培养基分别进出的进出管口；至少有一张半透膜贯穿于整个反应器，由该膜界定生物流体进出的第一通道和培养基进出的第二通道；

一个与第二通道相连通的混和容器，其上有一个用以引入活的、非固定化的肝细胞的进口；

与混和容器相连通的供氧装置；

用以产生生物流体通过生物反应器第一环路中流体循环的泵装置；和

用以产生肝细胞和培养基在混合容器中和通过生物反应器第二环路中流体循环的泵装置。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于它至少还包括了理论最小值非固定化肝细胞。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于具有与混和容器连接并进行液体交换的附加去装置用以去除下列物质中一种或多种：抗体，毒性物质和代谢废物。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于具有与生物反应器相连并进行液体交换的附加去除装置，用以去除下列物质中的一种或数种：抗体，毒性物质和代谢废物。

5.根据权利要求3或4所述的装置，其特征在于，具有以下一种或数种附加措施：吸附措施，传统透析手段，免疫反应过程和血液过滤。

6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，其中的半透膜是一个中空纤维，其第一通道是生物流体走纤维内腔，第二通道是培养基走纤维外的空间。

7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，制成生物流体环路的材料与下述液体相适应：血液，血浆和含有血浆扩充剂的血浆。

8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，活的肝细胞分离自猪的肝组织。

9.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，活的肝细胞分离自人的肝组织。

10.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，用于推动生物反应器中生物流体循环的泵装置包括一台推动生物流环路中流体运动的边界层泵。

11.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，推动生物反应器中生物流体循环的泵装置包括至少一个通过向心力使流体在其中循环的、轴向通过半透膜中空纤维的导管。

12.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，半透膜包括血浆蛋白不透性膜，以作为防止其向培养基中扩散的屏障。

13.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，推动生物流体循环的泵装置包括一台产生使血浆蛋白向生物流体回流的对流的泵。

14.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，半透膜对蛋白质是不透性的。

15.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，半透膜对蛋白质至少具有部分透性。

16.一种进行生物流体诸如血液和血浆的体外净化的方法，其特征在于包括：

向充满培养基的不含空气的混和容器中引入理论最小值的活的、非固定化肝细胞；

使生物流体在生物反应器中循环；和，

使来自混和容器的肝细胞和培养基在至少有一张半透膜贯穿其中的生物反应器中循环，在其中，膜将培养基与生物流体隔开，但允许生物流体中的溶质向培养基中穿透。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，生物反应器中循环的生物流体的流速为20—250ml/min。

18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，生物反应器中循环的含有肝细胞的培养基的流速为20—80ml/min。

19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，含有肝细胞的培养基和生物流体在生物反应器中循环约6小时。

20.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，在循环过程中，部分或全部肝细胞和培养基至少置换一次。

21.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，生物流体和培养基的温度维持在生物流体来源哺乳动物的体温。

22.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，由附加净化装置去除抗体，和/或毒性物质。

23.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，由附加净化装置去除代谢废物。

24.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，半透膜是蛋白质不可透性的。

25.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，半透膜对蛋白质至少具有部分可透性。

26.一种用于生物流体，诸如血液和血浆的体外净化的装置，其特征在于包括：

一个生物反应器，具有生物流体分别进出的进出管口；培养基分别进出的进出管口；和至少一张贯穿于其间的半透膜，由该膜界定一个生物流体进出的第一通道和另一个培养基进出的第二通道；

一个与第二通道进行液相交流的、用以自培养基中引入固定于基质上的肝细胞的接口；

推动生物流体通道中流体循环的泵装置；和

推动肝细胞和培养基进入并流过生物反应器中培养基通道的泵装置。

27.根据权利要求26所述的装置，其特征在于，还包括至少理论最小值的固定化肝细胞。

28.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，至少有部分的肝细胞固定于含金属的基质上。

29.根据权利要求28所述的装置，其特征在于，还包括能产生作用于含金属基质使之在生物反应器中循环的交变磁场的装置。

30.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，还包括从生物流体中去除抗体和/或毒性物质的附加净化措施。

31.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，还包括从培养基中去除代谢废物的附加净化装置。

32.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，活的肝细胞分离自猪的肝组织。

33.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，活的肝细胞分离自人的肝组织。

34.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，推动生物反应器中生物液循环的泵装置包括一台推动生物流体通道中流体循环的界面层泵。

35.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，其中的半透膜包括血浆蛋白质不可透性的膜，可作为防止其向培养基中扩散的屏障。

36.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，推动生物流体循环的泵装置包括一台产生使血浆蛋白向生物流体回流的对流的泵。

37.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，其中的半透膜是蛋白质不可透性的。

38.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，其中的半透膜对蛋白质至少具有部分可透性。

39.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，其中的基质包括微载体颗粒。

40.根据权利要求39所述的装置，其特征在于，其中的微载体是涂覆有胶原的微珠。

41.一种进行诸如血和血浆的生物流体的体外净化的方法，其特征在于，包括：

向生物反应器的第一通道中引入至少理论最小量的活的肝细胞；

令生物流体通过生物反应器中的第二通道循环，其中，第一通道和第二通道是由半透膜隔开；和

令肝细胞在生物反应器的第一通道中循环。

42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，其中的肝细胞是非固定化的。

43.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，其中的肝细胞是固定化的。