JPH10506806A - 人工肝臓装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的流体を精製するための人工肝臓装置および該装置の使用方法を開示する。該方法は、不活性担体に結合しているかまたは結合していない生存肝細胞（２３）であって該肝細胞（２３）と共に装置中を循環する細胞培養培地中に懸濁されている生存肝細胞（２３）の使用を含む。血液または血漿は半透膜の一方の面（７'）上を通り、半透膜の他方の面（７）上には細胞培養培地があり、半透膜を横切る濃度および／または圧力勾配がある。膜を横切って細胞培養培地中へ拡散する溶質は、肝細胞（２３）により代謝されおよび／または追加的除去手段（４０）により捕捉される。血液または血漿から肝細胞含有培地中へ拡散しない望ましくない物質は、追加的除去手段（５０）により捕捉される。

Description

【発明の詳細な説明】 人工肝臓装置および方法 本出願は、現在放棄されている１９９２年９月１１日付け米国特許出願第０７ ／９４３，７７７号の一部継続出願である。 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、血液および血漿の体外精製のための装置および方法に関する。より 詳細には、本発明は、腎不全の治療で使用される血液透析装置に構造上類似して いるが、多数の正常ヒト肝臓の機能を果たすための新規な生物学的手段を用いる 精製装置に関する。したがって、該装置および方法は、肝臓疾患を被る患者また は肝臓組織の移植を受けた患者の治療および支援を援助することを意図するもの である。 ２．従来技術の履歴 本発明を最もよく理解するためには、ヒトの肝臓の機能および疾患に関する解 剖学および生理学の基礎を概観するのが有用である。肝臓は、小葉と称される機 能単位よりなる２個の主要な葉に分割された器官である。小葉は、中心静脈の周 囲に放射状に配置した肝細胞の索よりなる。これらの索の間に、洞様腔がクッパ ー細胞として公知の食細胞と並んでいる。酸素化血液は肝動脈を経由して肝臓に 供給され、一方、脱酸素化血液は門脈を経由して肝臓から出る。これらの血管の 枝が血液を洞様毛細血管へ運び、ここで酸素、ほとんどの栄養素およびある毒素 が肝細胞中へ抽出される。 より詳細には、グルコースに富む血液が肝臓を通過するにつれ、過剰のグルコ ースが除去され多糖グリコーゲンとして貯蔵される。血液中のグルコース濃度が 正常未満に低下した場合、グリコーゲンはグルコースに分解され、これは肝細胞 により血流中に遊離されることとなる。また、肝臓は、アルブミンなどの多数の 血漿タンパク質の構築に用いられる血流中の過剰のアミノ酸を抽出および貯蔵す ることにより、タンパク質代謝を援助する。脂肪の乳化および脂質の腸吸収を助 ける塩、ビリルビン、コレステロールおよび脂肪酸の溶液である胆汁も、肝細胞 により生産される。しかし、それはこれらの細胞によっては正常に血流中に分泌 されず、その代わり、胆嚢へ運ばれそこで貯蔵される。 本発明でより重要なのは、食物の消化における肝臓の役割ではなく、血液中の 老廃物および毒素の濃縮の調節における肝臓の役割である。肝細胞は、血液中に 運ばれる毒素を分解し、より害の少ない物質に変換し、またはこれらの過程のい ずれかを経ずにそれらを貯蔵する酵素を含有する。例えば、アミノ酸の代謝によ り、遊離アミノ酸および窒素性老廃物の遊離が起こり、後者は肝細胞により尿素 に変換される。適量であれば、この尿素は無毒であり、腎臓および汗腺により容 易に排出される。「古い」赤血球およびある細菌もクッパー細胞により破壊され 、前者の場合にはリサイクルされる。 要するに、肝臓は、生体の正常な生化学的状態を維持するのに重要である。し たがって、その機能の障害および喪失は致命的である。肝臓代謝の公知の考えう る障害の簡潔な要約は、ポドルスキー（Podolsky）ら、「肝臓代謝障害（Derang ements of Hepatic Metabolism）」（Ch．315，Principles of Internal Medici ne，10th ed，pp．1773-1779，1983）にある。医学技術により、肝臓の疾患、傷 害および不全の治療または代償のためのいくつかのアプローチが開発されている 。さらに、ヒト（および他の多数の種）は、喪失したまたは傷害を受けた肝臓組 織を再生する能力を有する。 しかしながら、支援的および医薬的治療および移植は肝疾患の多数の症状を軽 減または逆転させうるが、これらの方法はすべて、急性病的患者が有しえない時 間を要する。さらに、治療を行っている間、代謝の恒常性を維持またはそれに近 づけるために、正常な肝臓機能のいずれかの喪失に対して支援しなければならな い。したがって、それができない場合は、肝機能を浄化し、治療のできる時間を 延長する手段が必要である。 体外肝臓灌流（すなわち、血液を外部の肝臓組織を通してポンピングすること ）が、治療および支援の手段として古くから提案されており、種々成功している 。反復肝臓灌流を長期肝臓支援に使用した例は、周期的な肝臓灌流による肝不全 の患者の７６日間の維持を報告しているアボウナ（Abouna）ら、「断続的肝臓灌 流による長期肝臓支援（Long-Term Hepatic Support by Intermittent Liver Perfusions）」（The Lancet，pp．391-396(１９７０年８月２２日)）に見いだ される。しかしながら、異なる５つの種からの肝臓組織を用いる試みにもかかわ らず、免疫学的および他の生化学的反応により該灌流の使用が制限され、適当な 移植ドナーが見つかる前に該患者は死亡した。 単離肝細胞移植も行われているが、ここでもまた種々の結果が得られている（ 例えば、マカオワ，エル（Makaowa，L.）ら、Can．J．Surg.，24:39-44，1981お よびデメトリオウ（Demetriou）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83:7475-747 9，1986を参照されたし）。 これと対照的に、血液および血漿を精製する体外法（例えば血液透析、血液灌 流または血液濾過によるもの）は、腎不全の治療の分野でよく知られており、確 立されている。これらの方法の主要な目的は、流体および電解質の平衡を維持し 、体内から老廃産物を除くことである。 腎臓血液透析では、透析溶液中に懸濁された人工的な半透膜を含有する透析機 へ血液をポンピングする。ある特定の物質に関して膜を横切って生じた濃度勾配 により、血液から透析浴中への流動が生じる。この方法は、尿素の血中濃度およ び血漿中のカリウム濃度をうまく低下させるのに用いることができる。血中また は血漿中の濃度を変化させるべきでない物質（例えば後者の場合のナトリウム） の正味の除去は、膜を横切る静水圧勾配を作り、膜を横切る溶質の移動のための 対流経路を作ることにより行うことができる。通常の血液透析装置の構造ならび にその中の流体温度、透析物濃度および流体流動の制御手段に関する詳細は、代 表的にはシンザト（Shinzato）に対する米国特許第５,０１１,６０７号、シャー ル（Schal）に対する米国特許第４,９２３,５９８号、ポラシェグ（Polaschegg ）に対する米国特許第４,８９４,１６４号およびビーチ（Veech）に対する米国 特許第５,０９１,０９４号などのいくつかの現存特許に記載されている。 操作中、患者から透析機へ血液が直接除去またはポンピングされ、血液は該膜 の一方の面に沿って流れる。膜を横切る向流にて該透析溶液をポンピングし、流 出血液を患者に戻す。 以上概説した方法による血液透析は、水溶性でタンパク質に結合していない小 分子量種の除去に最も有効である。その結果、それはある薬物の過投与の治療に 使用しうるが、主に腎不全の治療に使用されている。しかしながら、肝機能の喪 失を代償するために該方法を有効に使用するためには、血液解毒のためのさらな る戦略が必要である。 その目的のために、当該分野において多数の移植可能な体外的生物的人工肝臓 装置が提案され、臨床試験されている（例えばナイバーグ（Nyberg）ら、Am．J. Surg.，166:512-521，1993を参照されたし）。かかる装置の設計および実施は 多種多様であるが、それらは共通の要素を共有する。例えば、該装置は典型的に は、通過血液からの溶質を代謝させるための単離肝細胞および１以上の半透膜を 用いる。単離肝細胞を用いる装置のうち、該肝細胞は典型的には支持基質に固定 されて細胞分化および集合を促進させる。 例えば、本一部継続出願の親出願で開示した多数の概念を用いて、中空糸含有 バイオリアクター中でコラーゲン被覆ミクロキャリアービーズ（サイトデックス （CYTODEX）３ビーズ、ファルマシアの商標登録製品）に結合させた肝細胞を含 有する生物的人工肝臓が試験され、ゲルまたはゲル滴中で肝細胞を捕捉する系よ り効率的な代謝物の移動を起こすことが記載されている（ロズガ（Rozga）ら、B iotech．and Bioengineering，43:645-653，1994;またミウラ（Miura）ら、Arti f．Org.，10: 460-465，1986（細胞支持体としてのアルギン酸カルシウムゲルの 再使用）およびカイ（Cai）ら、Artif．Org.，12:383-393，1988（ゲル中への細 胞のマイクロカプセル化）も参照されたし）。 単離肝細胞を人工肝臓で使用するための他のアプローチでは、該細胞をミクロ キャリアーに結合し、それを灌流用クロマトグラフィーカラム中へ（デメトリオ ウ（Demetriou）ら、Ann．Surg.，259-271，1986）、中空糸上へ（ジャウレグイ （Jauregui）ら、J．Cell Biochem.，45:359-365，1991; また米国特許第５,０ ４３,２６０号を参照されたし）、モジュール中で積層され酸素化媒体で灌流さ れるガラス平板上へ（ウチノ（Uchino）ら、ASAIO Proc.，34:972-977，1988） 、アシアロ糖タンパク質ポリマー（アカイケ（Akaike）ら、Gastroenterol.，28 Supp．45-52,1993）、およびガラスビーズなどのマトリックス形成材充填床中 へ（リー（Li）ら、In Vitro Cell Dev．Bio.，29A:249-254,1993）へ配置する 。細胞生存期間が比較的短く（わずか数時間である（デメトリオウ（Demetriou ） ら））、細胞集合形成が困難であり、細胞と栄養素、代謝産物と毒素との接触が 減少するため（細胞表面の一部分を覆う基質上への該細胞の固定化の結果）、こ れらのアプローチの効力は制限されている。 時がたつにつれ、細胞の生存度および集合を改良する技術は改良されてきてい る（例えば、リー（Li）ら、In Vitro Cell Dev．Bio.前掲で開示されているの と同様の系を記載している公開特許出願第９３−２７２８７６（ＷＯ９３１６１ ７１）号を参照されたし）。しかしながら、体外肝臓支援での使用に十分な肝細 胞の集合および機能は、少なくとも、該細胞の基質またはマトッリクスへの結合 、または該細胞の固定化に依存しているということが当該分野で一般に受け入れ られている（例えば、ローテム（Rotem）ら、Biotech．and Bioengineering，43 :654-660，1994（肝細胞は足場依存性細胞である）；ミウラ（Miura）ら、Bioma tter Artif．Cells Artif．Org.，18:549-554，1990（適当な細胞機能には肝細 胞集合が必要であり、その目的のために、該細胞の固定化が好ましい）；ロズガ （Rozga）ら、Ann．Surg.，217:502-511，1993（ミクロキャリアーへの細胞の結 合は細胞の機能および分化を強化する）；およびロズガ（Rozga）ら、Biotech． and Bioengineering、前掲（ミクロキャリアーへの細胞の結合およびゲル中への 細胞の捕捉が好ましい）を参照されたし）。これとは対照的に、遊離の（すなわ ち、「非結合の」）単離肝細胞の懸濁液に対する膜を用いる通常の血液透析は、 肝臓支援を提供するのに臨床的に有効であるとは示されていない（例えば、オル ミド（Olumide）ら、Surgery，82:599-606，1977を参照されたし）。したがって 、当該分野で現在開発中であり試験中である、単離肝細胞を用いる生物的人工肝 臓装置は、該細胞を基質に固定するものであり、この方法は、該細胞／基質結合 を特徴づける比較的繊細な製造工程を必要とし、該細胞に対する損傷の危険があ る。 発明の概要 本発明は、血液、血漿などの生物学的流体を精製（すなわち解毒）し、それに より、中を通る少なくとも１個の半透膜を有するバイオリアクターを通して血液 または分離血漿を循環させるための装置およびそれの使用方法よりなる。該半透 膜は、管、フィルムまたは中空糸の形態であってもよく（好ましくは後者である ）、肝細胞および／または肝癌細胞系を維持するための溶液中の無菌細胞培地 に囲まれている（以下にさらに説明するように、特に前後関係を要しない限り、 「肝細胞」は、単離された肝細胞と、この細胞と、クッパー胆管上皮および内皮 細胞並びに場合によっては繊維芽細胞との組み合わせの双方を意味する）。血液 および血漿中の可溶性タンパク質、グルコースおよび毒素は該膜を横切って培地 中に拡散して、該肝細胞により代謝される。 １つの具体例では、本発明で用いる肝細胞は、生物学的適合性ミクロキャリア ー粒子に結合されている。細胞培地中での該ミクロキャリアーの循環は、該ミク ロキャリアー中に埋め込まれた磁石に影響を及ぼす交互（交流）磁場のような手 段により援助される。該拡散分子（すなわち溶質）が結合肝細胞に接触するにつ れ、それらは該細胞に取り込まれ、上記分子に関する正常な肝細胞機能により分 解、変換または貯蔵される。ついで、流出血液または血漿が（既に分離されてい る赤血球画分と再混合した後）患者に戻される。 本発明の好ましい具体例では、非結合肝細胞（すなわち、基質に結合または固 定化されていない細胞）を使用する。体外肝臓支援を要する患者に対して該支援 を提供するために、該装置内（すなわちその部位で（in situ））に細胞集合を 促進するための手段が設備されている。 また、必要に応じて、肝細胞により分解または貯蔵されなかったある毒性薬物 または老廃産物を除去するために、血液濾過装置、活性炭カラム若しくは他の樹 脂吸着剤への吸着手段および／または通常の透析装置などの追加的精製手段を設 備していてもよい（例えば、尿素はそれにより培地中に排出される）。また、該 装置は、該肝細胞、または例えば該肝細胞に捕捉されなかった移植患者中の肝組 織の異種移植片に対して形成されるいずれかの抗体を除去する手段を設備してい てもよい。 図面の簡単な説明 図１は、非結合肝細胞を使用するための図１の装置の好ましい具体例の図式的 表示である。 図２は、好ましい追加的精製手段を含む、本発明の装置の代替的具体例の図式 的表示である。 図３は、図１の装置を通る肝細胞集団の循環の２１時間後まで生存可能なラッ ト肝細胞の割合を示すグラフである。生存度はトリパンブルー排除により決定し た。 図４は、図１の装置を通る肝細胞集団の循環の６時間後まで生存可能なブタ肝 細胞の割合を示すグラフである。 図５は、雄ブタの血漿のインビボ体外精製で使用した場合の図１の装置を通る 肝細胞集団の循環の６時間後まで生存可能なラット肝細胞の割合を示すグラフで ある。 図６は、図１の装置の血液ループを循環する流体中のアンモニア濃度が、図１ の肝細胞ループを通るラット肝細胞集団の循環により時間の経過と共に減少する 程度を示すグラフである。 図７は、図１の装置の血液ループを循環する流体中の尿素濃度が、図１の肝細 胞ループを通るラット肝細胞集団の循環により時間の経過と共に増加する程度を 示すグラフである。 好ましい具体例の記載 Ａ．細胞の単離および調製 本発明の主な特徴は、肝臓の疾患、障害または不全がなければ患者自身の肝臓 で除去されるであろう血液または血漿からの物質の精製を援助するために、生き た単離された肝臓細胞を使用することである。ほとんどの具体例では、該細胞は ヒト以外、ヒトまたは異種個体起源の肝細胞である。しかしながら、本発明の肝 臓細胞として肝癌細胞も使用してよいと当業者に理解されるであろう。したがっ て、引き起こす病因の危険性がより低いため肝細胞は好ましい肝臓細胞であるが 、「肝細胞」なる語および本明細書中のその開示は、アメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）より入手可能なヒト肝癌細 胞系受託番号ＣＲＬ８０２４などの肝癌細胞を包含すると理解される。 本発明で用いる肝細胞の調製は以下のとおりである。 本発明方法での使用に適するヒト肝細胞の単離方法は当該分野で公知である（ 例えば、タカハシ（Takahashi）ら、Artif．Org.，17:653-659，1993を参照され たし）。人工肝臓系におけるヒト肝細胞の使用は、ヒト以外の肝細胞と接触する 患者による免疫反応の危険性を減少させうる。しかしながら、ヒト肝細胞の 入手可能性は必然的に制限される。したがって、ヒト以外の肝細胞のうち、ブタ 肝細胞が本発明での使用に好ましい。その主な理由は、それが入手しやすく、ヒ ト肝細胞と生理学的に類似しているためである。また、肝臓移植患者による系で の使用には、ヒト移植に対して異種器官源となるようブタ組織を修飾できるブタ 肝細胞が特に有用であると考えられる。しかしながら、他の哺乳動物種も本発明 の肝細胞の適当な起源であると当業者に理解される。 したがって、一例としてブタ組織を用いると、ブタの屠殺直後に小葉中の肝細 胞を肝臓から取り出す。当該分野で公知の手段に従い、該小葉組織を疾患に関し てスクリーニングする。ついで、当該分野で公知の手段に従い、酵素的（コラゲ ナーゼ）消化により該小葉組織から肝細胞を単離し精製する（例えば、ベリーら （Berry）ら、J ．Cell．Biol．43:506-520，1969; セグレン（Seglen）、Method s Cell Biol ．13:29-83，1976; および下記実施例Ｉに記載されている技術を参 照されたし）。用いる単離手段により、クッパー細胞および該小葉組織の他の細 胞成分（例えば胆管上皮細胞）も該肝細胞に含めてもよい。所望により、シグマ ・ケミカル（ミズリー州セントルイス）から商業的に供給される６０％パーコー ル（PERCOLL）溶液などの試薬中、該肝細胞を低速で（例、５０×ｇ）ペレット 化することにより、該細胞をさらに精製してもよい。 肝疾患に寄与する又はこれを引き起こす生化学的状態が完全には理解されてい ないため、これらの細胞集団のそれぞれが本発明の機能にどの程度寄与し又は必 要なのかは未だ知られていない。精製された肝細胞集団が好ましいと予想される が、本明細書中で用いる「肝細胞」なる語は、肝臓細胞または繊維芽細胞の単独 またはクッパー細胞、胆管上皮および内皮細胞との組み合わせを包含すると理解 されるべきである。また、アルブミン、凝固因子などの肝臓特異的産物を生成ま たは代謝するように遺伝子的に改変されている細胞を使用するのが望ましいかも しれない。これらの細胞は単独でまたは天然肝細胞との混合物として使用しても よい。 精製したら、本発明の１つの具体例での使用では、１以上の肝細胞を生物学的 に不活性な担体、好ましくは直径１５０〜２００μｍのビーズに結合させてもよ い。これに関する使用には、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー（スウェー デン国ウプサラ（Uppsala））よりサイトデックス（CYTODEX）３の商品名で入手 可能なデキストランビーズなどの天然ポリマー物質が好ましい。アガロースビー ズ（Bio-Rad，Inc.（カリフォルニア州リッチモンド）より入手可能）などの均 等な物質、またはガラスなどの他の物質を用いてもよい。したがって、本発明で 肝細胞を支持するために使用する基質を便宜のためにビーズと称するが、当業者 であれば他の支持基材が本発明の具体例での使用に適すると知見または容易に確 認することができる。 該ビーズは、好ましくは、変性コラーゲンまたは肝細胞の結合を許容する均等 な生物学的材料で被覆されている。コラーゲンに対する肝細胞の結合には外因性 のフィブロネクチンを必要としないので、コラーゲンが好ましい表面である。 適切な方法としては、例えば、要求によりファルマシアＬＫＢバイオテクノロ ジーより入手可能な「Microcarrier Cell Culture: Principles and Methods」 、Gjessingら、Exp．Cell．Res．129:239-249，1980およびDemetriouら、Scienc e，23:1190-1192、1986（ミクロキャリアー基質に対する細胞結合に関する当該 分野における知見を例示するため、これらの開示は参照文献として本明細書にと り込まれている）中に見いだされる。例えば、商業的に入手可能な撹拌容器を用 いて、細胞培養物１ｍｌに対してデキストランビーズ１０ｍｇを加えることがで きる。細胞培養培地中の最終濃度が１×１０⁵細胞／ｍｌになるように肝細胞を 該ビーズに加え、緩やかに混合し、３７℃でインキュベーションする。容易に付 着しないなら、該細胞培養培地容量が増加するにつれて、定期的な撹拌が必要か もしれない。 しかしながら、本発明の好ましい具体例では、該肝細胞は基質に結合または固 定化されない。したがって、本発明の実施態様での使用では、肝細胞を上記のと おり単離し、下記のとおりに貯蔵する。 該付着または非付着肝細胞は、それらを無菌環境中−７５℃未満の温度で維持 することにより保存してもよい。好ましくは、それらを液体窒素の容器中で凍結 貯蔵し、人工的媒精用に単離された精母細胞を保存するのに使用されるのと実質 的に同じ方法により維持する。肝細胞の低温保存に特に適切な方法は、Rozgaら 、Biotech．and Bioengineering，43:645-653，1994に記載されている。肝細胞 を 低温保存する代替的方法は、Dixitら、Transplantation，55:616-662，1994に記 載されており、この場合、細胞がアルギン酸カルシウム中にカプセル化され凍結 される。１年未満の貯蔵期間が好ましいが、該肝細胞を凍結することにより、該 細胞を数年間貯蔵することが可能かもしれない。しかしながら、最も好ましくは 、実用的な範囲で、該肝細胞は単離直後に使用する。 該肝細胞を使用するために、該細胞を生体適合性培地中に懸濁させる。凍結し ていれば、該細胞を解凍し、リン酸緩衝生理食塩水溶液などの適当な緩衝液中で 洗浄する。好ましくは、該培地は、該肝細胞の生存性を維持するための栄養素お よび他の補足物（該栄養素および補足物は当業者に公知であるか、あるいは容易 に確かめうる）を含有する。肝細胞の維持に用いるのに適した培地の一例は、Gr and Island Biologicals（ニューヨーク州グランドアイランド）により商品名Ｒ ＰＭＩ−１６４０で販売されている培地である。もう１つの適切かつ一般に使用 されている培地は、GIBCO Laboratories（ニューヨーク州グランドアイランド） により商業的に供給されるウェイマウス（WAYMUTH）培地である。好ましくは、 該培地は、該系で用いる特定の細胞の要求に応じて（すなわち、肝細胞以外の細 胞が含まれているか否か、使用肝細胞の使用期間、代謝される特定の物質などに 応じてさまざまであってよい）、当業者に公知の塩類または栄養素で補足する。 かかる添加物は、１以上のアミノ酸、栄養素および安定化剤、例えば、すべて商 業的に入手可能なアラニン、セリン、アスパラギン、アルブミン、アミノレウリ ン酸、オレイン酸、デキサメタゾン、チロキシン、トコフェロール、グルカゴン 、インシュリン、ゲンタマイシンなどを含んでいてもよい。下記実施例Ｉにおい て、適切な補助培地を詳細に説明する。別法として、特に、単離または解凍後６ 時間以内に肝細胞を精製のために使用する場合には、該培地は生理食塩水溶液な どのいずれの血液適合性流体であってもよい。 Ｂ．本発明方法での使用に適した生物的人工肝臓装置 １．非付着性肝細胞と共に使用する場合に好ましい装置の構成および操作 図面を参照すると、図１は、主に非付着肝細胞を用いて使用するための本発明 装置の好ましい具体例を示し、図２は、図１の装置の適切な改良を示している。 本発明装置は、一般に、少なくとも１個の半透膜を有する精製バイオリアクター 、 および少なくとも２個のポンプまたは肝細胞および血液または血漿を該装置を通 して循環させるための他の手段よりなる。一般に、本発明に包含される各装置は 、第１導管（すなわち生物学的流体ループ２０）および第２導管（すなわち肝細 胞ループ５）を含み、これらの導管は少なくとも１個の半透膜により隔離されて いる。該装置のすべての要素（コネクター、クランプ、ルアーロック、管類およ び容器を含む）は好ましくは滅菌可能である。 さらに、透析物および血液の流動温度および圧の検出および制御手段ならびに その中の溶質の相対濃度の測定手段は、当該分野で公知であり、以下で示す場合 には、本発明装置での使用に適しているかもしれない。例示のために、これらの 詳細については、上記の背景の項で挙げた参照文献に言及してもよい。 生物学的流体ループ２０中の流体は、実質的には体温でそれを入れ、実質的に 同温度で患者に戻されるべきである。この流体温度の維持は、当業者に公知の血 液および血漿用の外部温度制御手段、例えば血漿瀉血、血液銀行貯蔵または輸血 中に流体温度を維持するのに使用される手段により達成される。また、腎臓の血 液透析および／または血液濾過中の流体の温度制御手段は、米国特許第４,８９ ４,１６４号（腎臓の血液透析中に加熱された透析装置（dialyzate）に接触させ た血液を冷却するための技術を開示する）に記載されている。血液温度を３４℃ に維持するという提案を本発明方法に利用することもできるであろう（例えば、 Maggioreら、Proc．EDTA 18:597-602，1981を参照されたし）。該肝細胞に酸素 を供給するために酸素源（すなわちオキシジネーター９）も設けられている。 １つの特に適切な温度制御手段は、該装置内を循環する流体の温度をほぼ体温 （例えばヒトの場合３７℃）に維持するのに十分な、断熱インキュベーター内に 該装置のほとんどの要素を配置する。適切なインキュベーター材は、当業者に公 知であるかまたは容易に確かめることができ、ステンレス鋼などの耐久性容器中 の発泡材またはガラスを含む。 弁手段の制御、混合容器１中への流入及びこれからの流出の開始および停止お よび肝細胞ループ５内のステーションならびに生物学的流体ループ２０中への流 入、これを通る流れ及びこれからの流出を含む全系の作動は、好ましくは、精製 サイクル内で実質的に連続的であることに注目すべきである。該系の制御は、好 ましくは、当該分野でよく知られており腎臓血液透析および血液濾過用装置の制 御に使用されている手段による、手動補助能力を有するマイクロプロセッサーな どの制御手段（示していない）による。 別法として、あるいは好ましくは、これらの電子制御手段に加え、熟練した操 作者が生物学的流体ループ２０内の各ステーション中へおよびそれから外へ流動 弁を開閉し、ポンプ手段８、１４および１５を制御し、肝細胞ループ５への流入 およびそれからの流出を制御できるように、手動制御手段（示していない）が該 系の全体を通して設けられている。 さらに、図１ではポンプ手段は特定の位置に図示されているが、示されている のと異なる位置で該ループ中に１以上のかかるポンプ手段が含まれていてもよい ことは、機械工学の当業者には理解されよう。 図１を参照して、該装置の好ましい具体例は、肝細胞ループ５を経由して精製 バイオリアクター７中へ肝細胞を導入する前に、肝細胞の凝集を促進するために 非付着で夾雑物を含まない（すなわち「新しい」）肝細胞が導入され循環される 混合容器１を含む。該混合容器１は、肝細胞導入口２（混合容器１中へ新しい肝 細胞を導入するためのもの）、サンプリング口３（夾雑物を含む（すなわち「古 い」）肝細胞および培地を混合容器１から除去するためのもの）、肝細胞循環出 口４、肝細胞循環入口５および排出口６を含む。便宜には、これらの開口は、混 合容器１の壁に結合し貫通している管で形成されていてもよい。 例えば、混合容器１がガラスで形成されている場合、開口２〜６は、容器１の 壁中の適当な位置（例えば図１に示されている位置）に溶融させ貫通しているガ ラス管で形成されていてもよい。また、該開口は、ホースクランプまたは同様の クランピング手段を用いて閉めることができる可撓性の管を経由して該開口に適 合しているルアーロックまたは均等な部品で混合容器１に結合していてもよい。 開口２〜６に関する他の設計および材料は当業者に明らかであるため、本明細書 中では詳細に説明しない。 該肝細胞ループ自体（下記に示す配置を除く）は、動脈用の可撓性の管、また は混合容器１および精製バイオリアクター７を形成させるのに使用したのと同様 のまたは同一の生体適合性材料で形成されている導管である。肝細胞ループ５は 、 出口４および入口５で混合容器１に密封可能に結合している。便宜には、該密封 結合は、Ｏ−リングまたはＯ−リングジョイントクランプで行ってもよく、後者 の場合は該Ｏ−リング密封上の張力を増減するために調整が可能となる。 混合容器１および精製バイオリアクター７は生体適合性で細胞毒性でない材料 のものでなければならず、好ましくは、ポリマー化合物、例えばアクリロニトリ ルブタジエンスチレン（「ＡＢＳ」）樹脂プラスチック、ポリプロピレン、ポリ スルホン、ガラスまたはＵＳＰ ＸＸＩクラスＶＩ毒性試験規準を満たすように 構成されている均等な材料のものである。 混合容器１の大きさは多様であってもよいが、一般には、治療される哺乳動物 種の肝臓のおよその重量の少なくとも１％と均等な多数の肝細胞（すなわち細胞 の「理論的最小」数）を保持するのに十分である。例えば、ヒトでは、血液また は血漿の生体外精製に有効と予想される細胞の理論的最小数は、肝臓の肝細胞の 約１％、または約２×１０⁹個の細胞である。したがって、肝細胞が混合容器１ 内で循環するよう、無菌の生物学的適合性流体中に懸濁した少なくとも理論的最 小数の肝細胞を含有するのに、混合容器は十分な大きさである（すなわち、該細 胞は該混合容器内に固定化点までは充填されない）。 精製バイオリアクター７の大きさは、該系を通して循環させる血液または血漿 の容量に依存する。この容量は１／２パイント〜４パイントの値をとる（前者は 小児への適用で循環されると予想される容量であり、後者は血漿増量剤および血 漿血液製品を使用して大人への適用で有用と予想される上限である）と予想され る。 精製バイオリアクター７は、処理される生物学的流体（例、血液または血漿） のための循環ループを形成する外部接続により処理されるように、生物学的流体 源（例、血液または血漿）に流体連絡している。該精製バイオリアクターは、好 ましくは、中空糸バイオリアクターである。中空糸バイオリアクターでは、適用 に応じて種々の大きさの可溶性タンパク質（これは抗体を含んでいてもよい）お よび代謝老廃産物の交換を可能にする半透膜から形成されている複数の毛細管（ 図１では７'として代表例として図示されている）を通って、生物学的流体の精 製バイオリアクター７を通る循環が起こる。 この目的のためには、抗体などのタンパク質の除去のためにより大きな孔径を 意図すると、タンパク質の通過を許容するのに十分な大きさの孔まで該膜孔径が 上昇変化すると予想される。より大きな孔径を用いる場合、ある望ましい物質（ 例、血漿タンパク質）が培地中に拡散しうることに注目すべきである。これらの 物質の回収手段を以下に示す。しかし、この現象のため、約０.２μｍの孔径が 最も実用的であり、そして、中空糸を形成する膜を横切る溶質輸送に応答する一 次力である有意な流体対流を起こす。 商業的に入手可能であり精製バイオリアクター７として使用するのに適する製 品は、ザイマックス（ZYMAX）中空糸バイオリアクターである（ZYMAXは、Microg on，Inc.（カリフォルニア州ラグナヒルズ（Laguna Hills））の登録商標である ）。該ザイマックス製品は、可溶性タンパク質および老廃産物の自由通過を許容 するセルロースの混合エステルで形成された０.２μｍの孔径を有する半透膜材 で形成された３６００本の中空糸の集合体よりなる。該糸は、開口した（ported ）生体適合性で細胞毒性のないポリスルホンのハウジング（部品；該製造業者か らのバイオリアクターを構成するのに必要なクランプ、ガスケット、ホースおよ びプラグを含む）内に含有されている。他の適切な中空糸バイオリアクターは、 ミクロゴンからのＺ２２Ｍ−０６０−０１Ｘバイオリアクター（これはわずか６ ７０本の糸を有するにすぎないが、多くの通常のバイオリアクターより長い糸（ 約５５０ｍｍの注封（potted）末端）を使用する）である。 必要な中空糸（図１では７'として示されている）の総数は、精製バイオリア クター７内に含有されている培地の容量に依存し、そしてこれが今度は本発明系 内で精製される生物学的流体の容量（これは培地内に懸濁される肝細胞数を決定 する）に依存する。例えば、血液または血漿の容量および該中空糸の容積および 透過性が分かっていれば（単一のザイマックスバイオリアクターで、それぞれ、 管腔で約２００ミリリットルおよび０.２μｍ）、糸の総数および培地の容量が 概算できる。一般則として、血液および血漿からの溶質と肝細胞ループ５中で精 製バイオリアクター７を通って循環している肝細胞との接触を保証するために、 該中空糸の全表面積は培地の容量について最大となるべきである。 精製バイオリアクター７内では、肝細胞ループ５は該バイオリアクターハウジ ング内の毛細管外腔よりなり、一方、生物学的流体ループ２０は毛細管内腔（す なわち、バイオリアクター７に含有されている中空糸７'の内腔）よりなる。該 肝細胞ループを介する肝細胞の移動は、ポンプ１４（例、ペリスタチックポンプ ）により駆動され、一方、該生物学的流体ループを介しての血液または血漿の移 動はポンプ８（例、血液監視ポンプ）により駆動される。 本開示の前の背景的議論で示したとおり、人工肝臓系中の肝細胞が凝集するこ とが非常に望ましい。例えば、培養中の非凝集性の単一肝細胞は、凝集した細胞 に比べて比較的すみやかに死滅することが既に示されている。そのため、人工肝 臓系で肝細胞を使用する前に凝集球の形成を促進するような様態でバイオリアク ターおよび／または培養内で肝細胞が凝集できるように、従来技術の人工肝臓系 は細胞外固体基質を設備している。 肝細胞が凝集する過程にはエネルギーが必要である。したがって、その生存に 絶対的に必要というわけではないが、人工肝臓系で使用する肝細胞の生存度は、 特に凝集の初期段階において酸素の存在により向上されることが示されている（ 例えば、Rotemら、Biotech．& Bioengineering，43:654-660，1994[コラーゲン ベースの基質に対して単一層の肝細胞が最大量の半分だけ付着するのに約０.０ ６４ｍｍＨｇの酸素分圧を要し、該細胞が該基質を通って伸張するのに約０.１ ３ｍｍＨｇが必要だということが示されている]を参照されたし）。人工肝臓系 または培養中の肝細胞が複数層で存在する場合には、最上層表面下の細胞への酸 素供給には、肝細胞と酸素源との間の拡散距離の短縮化および凝集の初期段階に 存在する酸素濃度の増加を必要とすることが示唆されている（ローテムら、前掲 、６５９頁）。 本発明の好ましい具体例では、肝細胞は、固体基質上へ固定化させたり凝集球 中へ前培養したりしない。その代わり、血液適合性流体（好ましくは生理食塩水 または上記したとおりの肝細胞培地）の循環懸濁液中に該細胞を直接導入し、in situでの凝集を促進させる。本発明の肝細胞のこのような利用は、該細胞を前 培養するのにかかる労力を省き、細胞を固体基質に付着させるのにかかる労力を 省き、培地中の他の細胞、酸素、栄養素および代謝物との相互作用に各細胞の全 表面が利用できることを保証し、該細胞の前培養または固定化にかかわる操作に 固有の各細胞への潜在的傷害を最小にし、そして、本発明方法における細胞の単 離と使用との間の時間を短縮する。 該循環懸濁液中の非付着肝細胞への適当な酸素供給を保証するために、供給レ ザバー１３または他の流体源からライン１８を通ってポンプ１５により駆動され る血液適合性流体を混合容器１中に満たす。該流体は、オキシジネーター９（こ れは、当該分野で公知のいずれの通常の流体オキシジネーターであってもよい） により酸素供給される。酸素供給のために、ライン１８中の流体が、出口４にあ る弁付き供給ライン１２およびオキシジネーター９を通ってライン１９中を通過 するように、リサイクルポンプ１４を活動させる。オキシジネーター９を出ると 、該培地はｐＨプローブ１０および溶存酸素プローブ１１を通過する。 該ｐＨおよび酸素プローブは、所望の目標値にセットし、それに応じて、該培 地のガス組成を調節する。該培地は、ｐＨ約７〜８、好ましくは約７〜７.５、 最も好ましくは約７.３５に維持する。該培地の酸素組成は、０〜２０％、好ま しくは約５％以上で維持する。最も好ましくは、該酸素組成は、肝細胞を培地中 に導入する際の飽和空気の酸素組成とほぼ同じである。該酸素組成は、オキシジ ネーター９中の培地中に導入された酸素濃度を増減することにより調節し、一方 、培地のｐＨは、オキシジネーター９で培地に導入された二酸化炭素濃度を適当 に増減することにより制御してもよい。気相のバランスは窒素である。気体は、 該循環流体の流動方向と反対の流動方向にて該オキシジネーター中の培地中に導 入する。該培地が出口４を通って混合容器１に入るときに、気体は該系から廃棄 出口６を通って脱気容器１６中へ出る。 該生物学的流体ループを通る流動は以下のとおりである。精製のための血液ま たは血漿は、該系中への導入のために患者から取り出すか、あるいは好ましくは 、流動は患者から直接生じる。好ましい具体例では、例えば急性または慢性腎臓 透析（例、カテーテル法、天然血管または人工移植片の直接吻合）で使用される ような医学上許容される技術に従い血管アクセスが設けられている。最も好まし い具体例では、精製のための生物学的流体は血漿である。血液を患者から取り出 した後、当該分野でよく知られている方法および装置（示していない）を用いて 、血漿瀉血により血漿画分を赤血球から分離する。血漿瀉血は独立して該生物学 的 流体ループから行うが、患者への直接血管アクセスを血漿瀉血装置を用いて行う ために、そのための手段は好ましくは該ループ中に含まれている。 該血漿画分（または血漿瀉血を行っていない非分離血液）は、生物学的流体ル ープ２０を通り、各糸への接続導管（示されていない）を経由して中空糸７'へ 行くか、あるいは好ましい具体例では、ザイマックス製品などの生物反応性ハウ ジングを用い、該ハウジング製造業者の仕様書に従い該導管が設備されそれに接 続されている各々のかかるハウジングへ行く。該導管の構造は、使用する中空糸 ７'の数および構造により多種多様であってもよいが、当該分野で公知の混合容 器１または動脈の柔軟な管を形成するのに使用するために上記で開示したのと同 様の生物学的適合性で細胞非毒性の材料から形成される。弁手段２１および２２ は、生物学的流体ループ２０の入口および出口（示されていない）に設備されて いてもよい。好ましくは、患者に戻される流出血液が適当な圧力となるように、 弁手段２１は圧力制御（例えば、図２に示す圧力レギュレーター２４による）さ れる。適切な弁手段は当該分野でよく知られているため、本明細書中ではこれ以 上説明しない。 生物学的流体ループ２０を通しての血液または血漿の流動は、それが患者から 出る際の該血液または血漿の流動圧の間の圧力勾配により起こすことができるが 、好ましくは、いずれかの逆サージ（surge）を防ぐために好ましくは圧力レギ ュレーター（示されていない）と嵌合する生物学的流体ループ２０への入口の前 の低圧機械ポンプ手段８により援助される。流動センサー２５および制御手段３ ０の提案される配置を図２に図示する。流動制御のための適切な手段は当該分野 でよく知られているため、それについてここではこれ以上説明しない。また、精 製バイオリアクター７から空気を放出するための手段（示されていない）を設備 することが必要かもしれない。ここでもまた、かかる手段は当該分野でよく知ら れており、ここではこれ以上説明しない。 生物学的流体ループ２０を経由してバイオリアクター７中へ導入される血液ま たは血漿の非細胞成分は、中空糸７'よりなる膜を通して肝細胞ループ中の培地 と交換される。この交換が完了したら、肝細胞導入口２から混合容器１中へ肝細 胞を導入し、ついで、混合容器１が完全に流体で満たされたままとなるのを保証 するために必要に応じて追加的培地を加える。別法として、該培地が血漿と交換 されるにつれて、混合容器１中へ肝細胞を導入する。 この点に関して、非結合肝細胞に剪断または分解を起こさせないで、該非結合 肝細胞は、該肝細胞間の接触およびその集合を促進するのに十分な肝細胞ループ 中の流速の繊細な平衡を得る必要があると当業者は理解するであろう。同時に、 治療上有益な量の血液または血漿の解毒に必要な時間の短縮化の必要性を、中空 糸７'よりなる膜を通って溶質が該肝細胞ループ中へ（すなわち、バイオリアク ター７の毛細管外腔中へ）移動する速度を最適化する必要性に対して釣り合わせ なければならない。 この目的のために、生物学的流体ループ２０中の流動の方向は、肝細胞ループ ５中の流動の方向と実質的に反対である。該培地を酸素化するのに用いるのと反 対方向にリサイクルポンプ１４を活性化することにより、該肝細胞ループ中の細 胞含有循環流体は、約２０〜８０ミリリットル（流動／分）の速度、好ましくは 約６５ミリリットル（流動／分）の速度にて、混合容器１からバイオリアクター ７を通り、プローブ１０および１１を通り、オキシジネーター９を通って流動す る。同時に、血液監視ポンプ８の活性化により、該生物学的流体ループ中の血液 または血漿は、約２０〜２５０ミリリットル流動／分の速度で維持され、１５０ 〜２００ミリリットル流動／分の速度が好ましい。 生物学的流体ループ中の流速が、流体レザバーを用いることにより効果的およ び単純に制御されうることに注目すべきである。血液または血漿をこのレザバー 中に保持することにより、流動を直接すべて患者から行う場合に起こりうるもの より実質的に高い流速および大きな容量にて、本発明の方法に従い加工するため の流体の貯蔵が可能となる。したがって該レザバーを用いて、流体を患者から集 め、該レザバーに向け、ついで弁手段により除去し、該生物学的流体ループを通 してポンピングする（そうでない場合には本明細書中で説明する）。 生物学的流体ループ２０を通る流動の通過に戻ると、血液または血漿が中空糸 ７'を通過するにつれて、該中空糸の内腔中の流体とバイオリアクター７中の培 地との間の浸透圧勾配ならびにいわゆる貫膜圧（transmembrane pressure）によ り、可溶性タンパク質および代謝老廃産物がそれを通って培地中へ行く。 腎臓透析の方法と異なり、本装置では通常、中空糸７'を通る向流は全く得ら れないし所望もされないと理解される。ループ２０中の流体および該培地に対し 濃度平衡に到達する溶質のいくらかの逆拡散があると予想されうるが、かかる拡 散は、好ましくは、培地の補給により防げ、追加的精製手段（例えば、図２で４ ０および５０で示すもの）により補償され、中空糸７'を横切る濃度勾配により 最小化される。 しかしながら、大きな膜孔径を要する場合、例えば、血液からのより大きな分 子量種の拡散を望む場合には、向流が重要かもしれない。しかし、それらの種で は、例えば、患者に戻すべき血漿タンパク質が拡散するかもしれない。かかる適 用では、向流を利用して血漿タンパク質を捕捉しそれを該生物学的流体ループに 戻すために複数のチャンネルを用いてもよい（例えば、米国特許第５,０１１,６ ０７号に記載されている向流ポンプ手段を参照されたし）。例えば、除去する濾 液が一定の直径を有することが判明していれば、生物学的流体ループ２０に戻る チャンネル（示されていない）により対向的に結合している第２のより小さな半 透膜により、より小さな血漿タンパク質（例、アルブミン）を捕捉できるであろ う。該第２膜を拡散するには大きすぎる残りの濾液は、肝細胞による代謝のため の培地中に溶液で残る。 別法として、所望の溶質を患者に戻す手段がない場合には、公知の医学実施に より、かかる溶質（特に血漿タンパク質）を患者に単独で戻してもよい。しかし ながら、外的血液製品からの感染の危険性のため、これは好ましいアプローチで はない。 一般則として、肝細胞により代謝または貯蔵され得る該培地中の溶液中のタン パク質および老廃産物（以下「溶質」と称する）は、それらが接触した肝細胞に より吸収される。しかしながら、得られる吸収の程度は少なくとも２点で制限さ れると予想される。 第１に、ある溶質は肝細胞と接触しないか生存肝細胞（すなわち濾液の吸収能 を有するもの）と接触しないため溶液中に残る。第２の制限を引き起こすのはこ の後者の可能性である。すなわち、肝細胞は死亡していたり、傷害を受けていた り、あるいは該系で期待される機能を果たす能力を失っているかもしれない。 与えられた肝細胞に関していつ機能を喪失するかを決定または予想することは 可能でないであろうが、本発明で使用した肝細胞のすべてまたは一部をサンプリ ング口３から置換することは必要かもしれない。しかし、該装置で用いる場合上 記方法に従えば、該装置中を循環する肝細胞は、少なくとも６時間（これは、ヒ ト成人の一回の精製治療で費やされると考えられる時間である）、生存性を維持 すべきである。 さらに、肝細胞により吸収されない溶質が（上記要因によるか、あるいは、あ る毒素の場合には、該溶質が肝臓による代謝を受けにくいからである）培地中に 残るため、追加的除去手段が必要かもしれないし、培地の定期的置換が必要であ ろう。 その目的のため、肝細胞ループ５は、肝細胞および所望により該系中の培地か らの除去およびそれらの置換のために該ループを通る流動が一時的に中断される サンプリング口３に補給場所（示されていない）を含む。該補給場所は、無菌で ありかつポート化（ported）されたタンク、または「使用した」細胞および培地 を流動させ「新しい」細胞および培地を導入する弁手段（示されていない）を有 する導管を含む種々の構造よりなる。 好ましくは、該方法の最適の性能を保証するため、この除去および再導入は、 精製サイクル全体を通じて、前もって定められた間隔にて行う。すべての肝細胞 および培地を１回精製サイクルの間にリサイクルするのはやや非実用的であるの で、その統計的割合の除去および置換が好ましい。この割合およびそれを除去し 置換する間隔は、系中の培地、細胞および生物学的流体の容量に応じてさまざま であり、これらの値がわかれば、当該分野で公知の許容された統計計算に従い決 定することができる。別法として、あるいは上記方法と組み合わせて、細胞およ び培地の全容量を各サイクル後に置換することができる。 精製サイクルが完了したら、血液を患者に戻すか、あるいは血漿をまず血漿瀉 血装置に戻して患者の赤血球と再混合し、ついで、生物学的流体ループ２０中へ の血液または血漿の導入に関して上記したものと同じ導管を経由して患者に戻す 。患者へ血液を戻す前または後で本発明方法の適当で効果的な性能の確認を助け るために、ＩｇＭについての免疫検定および／または公知の肝臓機能試験を行っ てもよいと理解される。指示された治療の経過および必要なサイクルの長さに応 じて、１日に２〜３回まで、該精製サイクルを反復してもよい。 該追加的除去手段に関して、生物学的流体ループ２０中の流動がバイオリアク ター７を通過したら、患者に戻す前、あるいはバイオリアクター７に再度通す前 に、その中の流体を１以上の追加的精製手段場所に通してもよい。別法として、 追加的に除去される物質に応じて、これらの手段は、肝細胞ループ５内に含まれ ていてもよい。例えば、肝細胞により培地中に排出されるある代謝老廃産物、例 えば尿素の場合、除去手段が肝細胞ループ５中に位置しているのが最もよいと理 解される。 肝臓の不全または傷害に寄与する又はこれを引き起こす生化学的状態は、臨床 的原因（例、肝炎、アルコールまたは毒汚染、薬物過投与）に応じてさまざまで あり、完全には知見または理解されていないため、どのような体外肝臓機能が個 々の患者に必要なのかは明らかではない。また、肝細胞によりこれらの機能のい ずれが完全にあるいは適当に発現されるのか、そして、追加的手段により完了ま たは達成されねばならないのはどれかについても明らかではない。しかしながら 、かかる手段の実例は医学分野でよく知られており、図２には追加的精製手段４ ０および５０として代表例として記載されており、これは以下のものよりなる： − 尿素などの溶質を活性炭カラムまたは被覆木炭（例えば、「ガンブロ（GA MBRO）」の商品名で販売されているフィルター）および他の樹脂吸着剤（商業的 に入手可能な吸着剤は、アッシュ・メディカル・インコーポレーティッド（Ash Medical，Inc.）（インディアナ州ウエストラファイェッテ（West Lafayette） ）から「ＤＴ」マシン[解毒剤]として入手可能である。）上へ除去するための吸 着手段。 − 水溶性でありかつタンパク質に強く結合しない小分子量種を除去するため の通常の透析手段。 − ブタ異種抗原と反応しうるヒト血清中に存在する天然ＩｇＭ抗体を除去す るための免疫反応方法。免疫吸収物質としては、例えば、商標スペクトラ／ポア ６（SPECTRA/POR 6）、スペクトラ／ポア７（SPECTRA/POR 7）およびスペクトラ ／ポア１（SPECTRA/POR 1）でＶＷＲサイエンティフィック（Scientific）によ り販売されている透析膜が挙げられる。また、ＩｇＭ抗体を単離するために、セ ファロース（SEPHAROSE）６ｍｂビーズに結合させたレクチンを用いてもよい （これらのビーズはファルマシア（Pharmacia）ＬＫＢより商業的に入手可能で ある）。また、単離および精製手段は、当該分野でよく知られている技術に従い 、手動または自動で用いてもよい。かかる手段の一例は、ピアス（Pierce）（イ リノイ州ロックフォード）によりその商標イミュノピュア（IMMUNOPURE）で販売 されている製品（ＩｇＭ精製キット）である。 − 血液濾過のための手段（すなわち、体外循環により血液を血液フィルター に通す手段であり、これにより、尿毒性物質の限外濾液が取り除かれ、血液容量 に比例して尿毒性物質を含まない等量の血液が交換要素を経由して添加される） 。 いずれかのループ中の該追加的精製手段の存在または不存在は、与えられた精 製サイクルを完了するのに必要な時間を、各追加的精製工程を行うのに必要な時 間だけ、増加または減少させる。しかしながら、本発明の系と独立して記載され ている手段を用いることにより、これらの工程を行ってもよいと理解される。 適切な医療実施では、各精製サイクルの後、バイオリアクター７が処分され、 置換または滅菌されてもよい、あるいは、好ましくはそのようになされ、２人以 上の患者に使用されないと理解されるべきである。指示された治療の経過に応じ 、各精製サイクルは一定速度で行われれば数時間継続すると予想される。さらに 、例えば図１および２中に示した単一バイオリアクター系に関して上記したよう な追加的導管、部品およびポンプ手段を設備することにより、並列した２個以上 のバイオリアクターを用いてもよいと当業者に理解される。 Ｃ．本発明方法で結合肝細胞と共に使用するための装置の構成および作動 結合肝細胞を用いて血液または血漿を解毒するのに上記装置を用いてもよいと 当業者に理解される。しかしながら、結合肝細胞を用いる場合には、該肝細胞ル ープ中の流体の流速が細胞集合の促進に十分であることを保証する必要はない。 その代わり、流速は、結合肝細胞間の接触を最小限にしてそれに対する傷害を防 ぐ程度のものである。さらに、該肝細胞ループ中の補給場所および／またはサン プリング口を経由して、結合肝細胞を直接バイオリアクター７中に導入してもよ い。この目的のために、図２に図示するとおり、該装置は単純化されている。 人工肝臓系で結合肝細胞を使用すると上記の欠点（例えば、肝細胞と代謝され る溶質との間の接触のための表面積の減少）が現れる。該装置の本具体例では、 細胞表面積の喪失を補償するために、肝細胞を該バイオリアクター内で循環させ るための手段が設備されている。 しかしながら、バイオリアクター７の内部表面と接触して肝細胞を傷害または 破壊するのを防ぐために、この循環は緩やかに行わなければならない。この懸念 のため、培地の機械的混合またはバイオリアクター７の振とうは可能であるが、 該バイオリアクター内で肝細胞の循環を行うための好ましい方法ではない。その 代わりに、循環の好ましい方法は、変化する（交互、交流）磁場を該バイオリア クターに適用することである。 この方法によれば、低周波数ＡＣ電源３１（例、６０サイクル／秒）およびそ れに電気的に接続した少なくとも１対の対向コイル３２を用いて、変化する低周 波数磁場を発生させる。コイル３２は、好ましくは、互いに反対に、かつ、バイ オリアクター７の外部に位置し、好ましくは、非伝導性ハウジング中に収容され 、いずれかの適当な結合手段により該リアクターの反対の外壁に結合されている 。該培地内の非常に適切な循環流動は、肝細胞が結合するデキストランビーズま たは他のミクロキャリアー２３（図２では、選択ビーズ内の磁気粒子を示す「Ｘ 」を付したビーズ２３Ａとして示されており、好ましくは、約１０個のビーズの うちの少なくとも１個の中に磁気粒子が配置されている。）の一部の中に配置さ れた磁石に反応して発生する。中に磁気粒子を有するビーズは、ダイナル・イン コーポレーティッド（Dynal，Inc.）（ニューヨーク州グレイトネック（Great N eck））から商業的に入手可能であり、商品名ダイナビーズ（DYNABEADS）Ｍ−４ ５０で販売されている。 結合肝細胞に対する溶質の接触を最少にしつつ循環を行うもう１つの有用な方 法は、境界層ポンプを用いて行う。フィルムまたはシート（中空糸でない）膜を 用いるのが最も有用であり、境界層は、該膜表面に沿って移動し結合肝細胞を運 搬する培地の流れを作る。別法として、特に中空糸膜を使用したい場合には、肝 細胞および培地を軸性導管中へ、該導管を収容するのに十分な径の糸の内径に通 して導入し、該導管中を旋回または循環させる求心力を発生させるためにポンプ を用いてその中を通過させる。 境界層ポンプ手段、および固体物質を移動させるためのその使用は、ガース （Gurth）に対する米国特許第４,３３５,９９４号に記載されている。かかるポ ンプ手段（示されていない）は、ディスクフロ・コーポレーション（Discflo Co rporation）（カリフォルニア州サンティー（Santee））より入手可能であり、 商標ディスクフロポンプ（DISCFLO PUMP）として販売されている。該ディクフロ ポンプの接続および使用に関する指示および援助はディスクフロ・コーポレーシ ョンから得ることができる。 これらの修飾を除き、本発明の装置の本代替的具体例の作動および構造は、上 記の好ましい具体例に関して記載したのと同様である。 本発明の装置および方法の使用に関する実施例を以下に示す。該実施例は例示 にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。略語は標準的なもの（例、ミ リリットルに「ｍｌ」、分に「ｍｉｎ」、など）を使用する。 実施例Ｉ 非結合肝細胞を用いる図１の人工肝臓装置のインビトロ評価 リー（Li）ら、1990の技術を用いて、屠殺後、スプレイグ−ホーリー（Spragu e-Hawley）ラットおよび／または農家のブタから肝細胞を単離した。簡単に言え ば、コラゲナーゼ（０.５％ｗ／ｖ、１型）灌流により該技術を実施した。該単 離細胞集団は、トリパン・ブルー排除による評価で、８０％を越える生存度を有 すると測定された。単離後、１１.２ｍｇ／ｌのアラニン、１２.８ｍｇ／ｌのセ リン、２４ｍｇ／ｌのアスパラギン、０.１６８ｍｇ／ｌのアミノレブリン酸、 ０.３９３ｍｇ／ｌのデキサメタゾン、０.０３ｍｇ／ｌのグルカゴン、２０単位 のインシュリンおよび８４ｍｇ／ｌのゲンタマイシンで補足されたウェイマス（ WAYMUTH）７５２／Ｌ培地中に該肝細胞を懸濁した。 該混合容器、バイオリアクターおよび生物学的流体ループを培地で満たし、合 計培地容量約３５０ｍｌ中２０％酸素濃度にまで平衡化した。該人工肝臓装置中 の代謝の老廃産物モデルとして、約２０μｇ／ｍｌの濃度のアンモニアを該生物 学的流体ループに加えた。約２億個の生存可能なラット肝細胞を該混合容器に注 入し、一方、等価の数のブタ肝細胞を第２装置の混合容器に注入した。該肝細胞 ループおよび生物学的流体ループを通る流体循環を開始し、両ループ中の流速を 約６５ｍｌ／分に維持した。 該系中、２１時間後にまだ生存可能なラット肝細胞数を図３にグラフ化し、一 方、６時間（ブタ細胞含有装置に適用した合計試験時間）後にまだ生存可能なブ タ肝細胞数を図４に示す。通常の技術（すなわちトリパン・ブルー排除染色）に より生存度を測定した。 図５および６は、それぞれ、６時間かけて両装置中の培地中で得たアンモニア 濃度の減少を示す。図中に示されているとおり、アンモニア濃度の実質的な減少 が得られた。これらのデータおよび下記実施例ＩＩで報告するデータに基づき、 血液または血漿中のアンモニア濃度はヒトにおいて約１０％の倍率だけ減少させ ることができると予想できる。 実施例ＩＩ 非結合肝細胞を用いる図１の人工肝臓装置のインビボ評価 図１の装置は、該生物学的流体ループ中に培地を直接導入していないことを除 き実施例Ｉに記載したのと同様にして、ラット肝細胞と共に使用するために製造 した。該装置の生物学的流体ループと若い雄ブタ（体重：約２６ｋｇ）の大腿静 脈との間の静脈接続を行った。該ブタに血液を連続的に戻しながら、該ブタの大 腿静脈から流れる血液を、流速約１５０ｍｌ／分で約６時間、該バイオリアクタ ーを通して灌流した。 その６時間の灌流時間の間じゅう、該ブタの生命徴候および血液化学を観察し た。定期的に該サンプリング口を通して該混合容器から肝細胞を集め、該細胞の 生存度をトリパンブルー排除染色により評価した。 図５は、図中に示した時点の灌流時間にまだ生存可能な肝細胞の割合を示す。 図６は、図中に示した時点の、該装置の生物学的流体ループから採取した血液 中で測定したアンモニア濃度の減少を示す。図７は、同じ時点で同じ血液試料中 で測定した尿素濃度の増加を示す。 図に示されているように、観察された該系の効力およびインビボで該系を循環 させた肝細胞の生存度は、実施例ＩＩで報告したインビトロの効力および生存度 の値と比較しうるものであった。該ブタは、該人工肝臓装置の使用に起因する、 健康に対するいずれの悪影響も被らなかった。 本明細書中には本発明の装置および方法の好ましい具体例を開示しているが、 ここに添付する請求の範囲により定義される本発明の精神または範囲を逸脱する ことなく、該開示具体例に対して修飾を行ってもよいと当業者には理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 デメトリュー，アキレス アメリカ合衆国 90067 カリフォルニア 州 ロサンゼルス，センチュリー パーク レーン ＃406 2132

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物の血液および血漿などの生物学的流体の体外精製用装置であって 、生物学的流体をそれぞれ入れおよび出すための入口および出口、培地をそれぞ れ入れおよび出すための入口および出口、並びに生物学的流体を入れおよび出す ための第１導管並びに培地を入れおよび出すための第２導管を限定し中で伸張す る少なくとも１個の半透膜を有するバイオリアクター； 生存している非結合肝細胞を培地中に導入するための入口を有し、第２導管に 流体連絡されている混合容器； 混合容器に気体連絡されている酸素化手段； バイオリアクターの第１導管を通して生物学的流体を循環させるためのポンプ 手段；並びに バイオリアクターの第２導管を通して混合容器中の肝細胞および培地を循環さ せるためのポンプ手段を含む装置。 ２．さらに少なくとも理論的最小数の非結合肝細胞を含む請求項１記載の装置 。 ３．抗体、毒性物質および代謝老廃産物よりなる群から選ばれる物質を除去す るための追加的手段が混合容器に接続または流体連絡されている請求項１記載の 装置。 ４．抗体、毒性物質および代謝老廃産物を含む溶質を除去するための追加的手 段がバイオリアクターに接続または流体連絡されている請求項１記載の装置。 ５．追加的手段が、吸着手段、通常の透析手段、免疫反応法および血液濾過よ りなる群から選ばれる１以上の手段を含む請求項３または４記載の装置。 ６．半透膜が中空糸であり、第１導管が糸内腔であり、第２導管が糸外腔であ る請求項１記載の装置。 ７．生物学的流体ループが、血液、血漿および血漿含有血漿エキステンダーよ りなる群から選ばれる流体に適合性の材料よりなる請求項１記載の装置。 ８．生存肝細胞がブタの肝臓組織より単離される請求項１記載の装置。 ９．生存肝細胞がヒトの肝臓組織より単離される請求項１記載の装置。 １０．バイオリアクターを通して生物学的流体を循環させるためのポンプ手段 が、バイオリアクターの第１導管を通して生物学的流体を移動させるための境界 層ポンプを含む請求項１記載の装置。 １１．バイオリアクターを通して生物学的流体を循環させるためのポンプ手段 が、求心力により流体が中を循環する中空糸半透膜を通る同軸的に位置する少な くとも１個の導管を含む請求項６記載の装置。 １２．半透膜が、血漿タンパク質に対して不浸透性で細胞培養培地中へのその 拡散の障害として機能する膜を含む請求項１記載の装置。 １３．生物学的流体を循環させるためのポンプ手段が、生物学的流体中への血 漿タンパク質の逆拡散のための向流を発生させるためのポンプを含む請求項１記 載の装置。 １４．半透膜がタンパク質に対して不浸透性である請求項１記載の装置。 １５．半透膜がタンパク質に対して少なくとも部分浸透性である請求項１記載 の装置。 １６．血液および血漿などの生物学的流体の体外精製方法であって、培地で満 たされ空気を含まない混合容器中へ少なくとも理論的最小数の生存している非結 合肝細胞を導入し、 バイオリアクターを通して生物学的流体を循環させ、並びに 中を通っている少なくとも１個の半透膜を有するバイオリアクターを通して混 合容器中のおよび混合容器からの肝細胞および培地を循環させることよりなり、 前記膜が培地を生物学的流体から分離するが生物学的流体から培地中へ溶質が通 過するのを許容することを特徴とする方法。 １７．バイオリアクターを通して生物学的流体を流速約２０〜２５０ｍｌ／分 で循環させる請求項１６記載の方法。 １８．肝細胞を含有する培地を、バイオリアクターを通して流速約２０〜８０ ｍｌ／分で循環させる請求項１６記載の方法。 １９．肝細胞を含有する培地および生物学的流体を、バイオリアクターを通し て約６時間循環させる請求項１６記載の方法。 ２０．循環中に少なくとも１回、肝細胞および培地の全部または一部を置換す る請求項１６記載の方法。 ２１．生物学的流体が由来する哺乳動物のほぼ体温に生物学的流体および培地 を維持する請求項１６記載の方法。 ２２．追加的精製手段により生物学的流体から抗体および／または毒性物質を 除去する請求項１６記載の方法。 ２３．追加的精製手段により培地から代謝老廃産物を除去する請求項１６記載 の方法。 ２４．半透膜がタンパク質に対して不浸透性である請求項１６記載の方法。 ２５．半透膜がタンパク質に対して少なくとも部分浸透性である請求項１６記 載の方法。 ２６．哺乳動物の血液および血漿などの生物学的流体の体外精製用装置であっ て、生物学的流体をそれぞれ入れおよび出すための入口および出口、培地をそれ ぞれ入れおよび出すための入口および出口、並びに生物学的流体を入れおよび出 すための第１導管並びに培地を入れおよび出すための第２導管を限定し中で伸張 する少なくとも１個の半透膜を有するバイオリアクター； 基質に結合している生存している肝細胞を培地中に導入するための第２導管に 流体連絡されている口； バイオリアクターの第１導管を通して生物学的流体を循環させるためのポンプ 手段；並びに バイオリアクターの第２導管中へおよびそれを通して肝細胞および培地を循環 させるためのポンプ手段を含む装置。 ２７．さらに少なくとも理論的最小数の結合肝細胞を含む請求項２６記載の装 置。 ２８．肝細胞の少なくとも一部が金属含有物質に結合している請求項２７記載 の装置。 ２９．さらに、バイオリアクター内で金属含有物質を循環させる交互磁場の発 生手段を含む請求項２８記載の装置。 ３０．さらに、抗体および／または毒性物質を生物学的流体から除去するため の追加的手段を含む請求項２７記載の装置。 ３１．さらに、代謝老廃物を培地から除去するための追加的精製手段を含む請 求項２７記載の装置。 ３２．生存肝細胞がブタの肝臓組織より単離される請求項２７記載の装置。 ３３．生存肝細胞がヒトの肝臓組織より単離される請求項２７記載の装置。 ３４．バイオリアクターを通して生物学的流体を循環させるためのポンプ手段 が、第１導管を通して流体を移動させるための境界層ポンプを含む請求項２７記 載の装置。 ３５．半透膜が、血漿タンパク質に対して不浸透性で細胞培養培地中へのその 拡散の障害として機能する膜を含む請求項２７記載の装置。 ３６．生物学的流体を循環させるためのポンプ手段が、生物学的流体中への血 漿タンパク質の逆拡散のための向流を発生させるためのポンプを含む請求項２７ 記載の装置。 ３７．半透膜がタンパク質に対して不浸透性である請求項２７記載の装置。 ３８．半透膜がタンパク質に対して少なくとも部分浸透性である請求項２７記 載の装置。 ３９．基質がミクロキャリアー粒子を含む請求項２７記載の装置。 ４０．粒子がコラーゲン被覆ビーズである請求項３９記載の装置。 ４１．血液および血漿などの生物学的流体の体外精製方法であって、バイオリ アクターの第１導管中へ少なくとも理論的最小数の生存している肝細胞を導入し 、 バイオリアクターの第２導管を通して生物学的流体を循環させ、該第１導管お よび該第２導管は半透膜により分離されているものであり、および バイオリアクターの第１導管中肝細胞を循環させることを含む方法。 ４２．肝細胞が結合していない請求項４１記載の方法。 ４３．肝細胞が結合している請求項４１記載の方法。