CN1657609A - 一种保存体外肝细胞系统的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及生物材料保存技术，具体涉及一种体外哺乳动物肝细胞系统的保存方法。本发明体外哺乳动物肝细胞系统保存液，包括保存液A和保存液B，在常温下保存体外肝细胞系统。本发明方法易于掌握，方便存储、运输和使用，经体外药物代谢和相互作用评价试验的验证，所配制和生产的细胞保存液，降低了成本，增加了保存效果，特别是改善了受运输条件影响的细胞存活率和贴壁率，可满足日益发展的体外药物药效筛选和药物相互作用评价的需要。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及生物材料保存技术，具体涉及一种体外哺乳动物肝细胞系统的保存方法。
背景技术
在生物医药研究中，特别是体外药物代谢和相互作用研究中，常需要体外肝细胞系统的参与，体外肝细胞系统的保存效果，是影响上述研究结果的关键因素之一。体外肝细胞系统在运输过程中容易发生肝细胞死亡和贴壁肝细胞的脱落。目前常用的方法是应用UW保存液。根据中华器官移植学会主任委员夏穗生教授1994年10月在“中华器官移植杂志”上报导：UW是迄今为止最成功的器官保存液，可明显地延长器官冷冻保存时间，长达72小时之久。UW对于器官保存具划时代的贡献。然而，在细胞水平，特别对于贴壁肝细胞，以UW为主体的低温保存，常引起细胞在运输过程中的死亡和脱落。因此研制一种特异的肝细胞保存液对生物医药研究具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、有效的生物材料保存技术，具体涉及一种保存体外哺乳动物肝细胞系统的方法。本方法能提高体外肝细胞系统的存活率和贴壁率，方便存储、运输和使用。
本发明方法采用生物材料保存液在常温下保存体外肝细胞系统。
本发明所述的生物材料保存液可为体外哺乳动物肝细胞系统保存液，包括保存液A和保存液B。其中，保存液A的组分含量范围如下，
组分与浓度 含量(毫升)
谷氨酸(glutamine)200mM 500-600
亚麻酸/小牛血清白蛋白linoleic 250-300
acid/BSA
上皮促生长因子(EGF)1μg/mL 8-11
氢化可的松(Hydrocortisone)10mM 12-15
腺苷(Adenosine)50mM 8-10
硒(Selenium)10mM 1.5-2.5
别嘌呤醇(Allopurinol)10mM 8-10
霍乱毒素(Cholera toxin)1mg/ml 8-10
肝细胞生长因子(LCGF)0.5mg/ml 6-8
铁蛋白(Transferrin)25mg/ml 8-10
乙醇胺(Ethanolamine)100mM 1.5-2.5
催乳激素5mg/ml Prolactin 0.7-1
异博定(Isoptin)200μg/ml 8-10
保存液B的组分含量范围是，
组分与浓度 含量(毫升)
WEM细胞培养液Williams E medium 780-820
胰岛素(insulin)10mg/ml 3-5
糖原(Glucagon)1mg/ml 40-50
青霉素/链霉素 40-50
(Penicillin/Streptomycin)，
(青霉素50,000单位，链霉素50mg/mL)
二性霉素(Fungizone)250μg/ml 50-75
上述组分配制如下：
1)谷氨酸glutamine 200mM：直接购自厂商(GIBCO 25030-0810)。
2)亚麻酸/小牛血清白蛋白Linoleic acid/BSA：直接购自厂商(Sigma L-9530)。
3)上皮促生长因子EGF 1μg/ml：溶解100μg(Sigma E-4127)于100mLWEM细胞培养液中。
4)氢化可的松Hydrocortisone 10mM：溶解18.13mg(Sigma H-0888)于5mL 100％的乙醇中。
5)腺苷Adenosine 50mM：溶解134mg(Sigma G9251)于100mL WEM细胞培养液中。
6)硒Selenium 10mM：溶解67mg(Sigma S-5261)于39mL无菌水中。
7)别嘌呤醇Allopurinol 10mM：溶解13.6mg(Sigma A-8003)于100mLWEM细胞培养液中。
8)霍乱毒素Cholera toxin 1mg/ml：溶解100mg(Sigma C-3012)于100mLWEM细胞培养液中。
9)肝细胞生长因子LCGF 0.5mg/mL：溶解(Sigma G-1887)25mg于50mLWEM细胞培养液中。
10)铁蛋白Transferrin 25mg/mL：溶解(Sigma T-8158)50mg于2mL WEM细胞培养液中。
11)乙醇胺Ethanolamine 100mM：溶解0.30mL(Sigma E-0135)于50mL无菌水中。
12)催乳激素Prolactin 5mg/ml：溶解1000个国际单位(Sigma L-6520)于6.25mL WEM细胞培养液中。
13)异博定Isoptin 200μg/mL：加(Knoll AG D6700)0.2mL于100mLWEM细胞培养液中。
14)WEM细胞培养液Williams E medium：直接购自厂商(WME，GIBCO12551-032)。
15)胰岛素insulin 10mg/mL：溶解100mg(Sigma I-5500)于10mL酸性水(pH2-3)中。
16)糖原(Glucagon)1mg/mL：溶解5mg(Sigma G-3157)于5mL酸性水(pH2-3)中。
17)青霉素/链霉素Penicillin/Streptomycin：直接购于厂商(GIBCO15140-122)。
18)二性霉素Fungizone 250μg/mL：直接购于厂商(GIBCO 15290-018)
按上述组分含量范围分别配制保存液A和保存液B，
使用时，将上述保存液A和保存液B按下列配比配制：
取保存液A20毫升，保存液B40毫升，加入940毫升WEM细胞培养液，调节酸硷度(pH)为7.45±0.10，渗透压(Permeate pressure)调节至310±10mOsm/L。制成本发明生物材料细胞保存液。保存细胞的使用浓度为1百万贴壁肝细胞/毫升，使用温度为15-25℃。
本发明经过体外药物代谢和相互作用评价试验的验证，结果证实，肝细胞在经过了48小时的运输后仍然保持其存活率和细胞贴壁能力。本发明方法易于掌握，配制和生产的细胞保存液，降低了成本，增加了保存效果，特别是改善、提高了受运输条件影响的细胞存活率和贴壁率，方便存储、运输和使用，可满足日益发展的体外药物药效筛选和药物相互作用评价的需要。
具体实施方式
实施例1
按各组分浓度配制后，取谷氨酸200mM 500mL，亚麻酸/小牛血清白蛋白250mL，上皮促生长因子EGF 1μg/m 18mL，氢化可的松10mM 12mL，腺苷50mM 8mL，硒10mM 1.5mL，别嘌呤醇10mM 8mL，霍乱毒素1mg/m 18mL，肝细胞生长因子0.5mg/mL 6mL，铁蛋白25mg/mL 8mL，乙醇胺100mM 1.5mL，催乳激素5mg/m 10.7mL，异博定200μg/mL 8mL，配制保存液A；
取WEM细胞培养液780mL，胰岛素10mg/mL 3mL，糖原1mg/mL 40mL，青霉素/链霉素(青霉素50,000单位，链霉素50mg/mL)40mL，二性霉素250μg/mL 50mL，配制保存液B；
使用时，将上述保存液A和保存液B按下列配比配制：
取保存液A20毫升，保存液B40毫升，加入940毫升WEM细胞培养液，调节酸硷度(pH)为7.55，渗透压调节至320mOsm/L，保存细胞的使用浓度为1百万贴壁肝细胞/毫升，使用温度为25℃。
实施例2
按各组分浓度配制后，取谷氨酸200mM 600mL，亚麻酸/小牛血清白蛋白300mL，上皮促生长因子EGF 1μg/ml 11mL，氢化可的松10mM 15mL，腺苷50mM 10mL，硒10mM 2.5mL，别嘌呤醇10mM 10mL，霍乱毒素1mg/ml 10mL，肝细胞生长因子0.5mg/mL 8mL，铁蛋白25mg/mL 10mL，乙醇胺100mM 2.5mL，催乳激素5mg/ml 1mL，异博定200μg/mL 10mL，配制保存液A；
取WEM细胞培养液820mL，胰岛素10mg/mL 5mL，糖原1mg/mL 50mL，青霉素/链霉素(青霉素50,000单位，链霉素50mg/mL)50mL，二性霉素250μg/mL 75mL，配制保存液B；
使用时，将上述保存液A和保存液B按下列配比配制：
取保存液A20毫升，保存液B40毫升，加入940毫升WEM细胞培养液，调节酸硷度(pH)为7.55，渗透压调节至300mOsm/L，保存细胞的使用浓度为1百万贴壁肝细胞/毫升，使用温度为15℃。
Claims (6)
1、一种保存体外肝细胞系统的方法，其特征是采用生物材料保存液在常温下保存体外肝细胞系统。
2、按权利要求1所述的保存体外肝细胞系统的方法，其特征是所述的生物材料保存液为体外哺乳动物肝细胞系统保存液，包括保存液A和保存液B，其中，保存液A的组分含量范围如下，
组分与浓度 含量(毫升)
谷氨酸200mM 500-600
亚麻酸/小牛血清白蛋白 250-300
上皮促生长因子1μg/mL 8-11
氢化可的松10mM 12-15
腺苷50mM 8-10
硒10mM 1.5-2.5
别嘌呤醇10mM 8-10
霍乱毒素1mg/ml 8-10
肝细胞生长因子0.5mg/ml 6-8
铁蛋白25mg/ml 8-10
乙醇胺100mM 1.5-2.5
催乳激素5mg/ml 0.7-1
异博定200μg/ml 8-10
保存液B的组分含量范围是，
WEM细胞培养液 780-820
胰岛素10mg/ml 3-5
糖原1mg/ml 40-50
青霉素/链霉素， 40-50
(青霉素50,000单位，链霉素50mg/mL)
二性霉素250μg/ml 50-75
3、按权利要求2所述的保存体外肝细胞系统的方法，其特征是所述组分如下配制，上皮促生长因子EGF 1μg/ml：溶解100μg于100mL WEM细胞培养液中；
氢化可的松10mM：溶解18.13mg于5mL 100％的乙醇中；
腺苷50mM：溶解134mg于100mL WEM细胞培养液中；
硒Selenium 10mM：溶解67mg(Sigma S-5261)于39mL无菌水中；
别嘌呤醇Allopurinol 10mM：溶解13.6mg于100mL WEM细胞培养液中；
霍乱毒素1mg/ml：溶解100mg于100mL WEM细胞培养液中；
肝细胞生长因子0.5mg/mL：溶解25mg于50mL WEM细胞培养液中；
铁蛋白25mg/mL：溶解50mg于2mL WEM细胞培养液中；
乙醇胺100mM：溶解0.30mL于50mL无菌水中；
催乳激素5mg/ml：溶解1000个国际单位于6.25mL WEM细胞培养液中；
异博定200μg/mL：加入0.2mL于100mL WEM细胞培养液中；
胰岛素10mg/mL：溶解100mg于10mL酸性水中；
糖原1mg/mL：溶解5mg于5mL酸性水中。
4、按权利要求1和2所述的保存体外肝细胞系统的方法，其特征是所述保存液，其中保存液A和保存液B按下列配比配制：
取保存液A20毫升，保存液B40毫升，加入940毫升WEM细胞培养液，调节pH为7.45±0.10，渗透压为310±10mOsm/L。
5、按权利要求1所述的保存体外肝细胞系统的方法，其特征是所述保存细胞的使用浓度为1百万贴壁肝细胞/毫升，使用温度为15-25℃。
6、按权利要求3所述的保存体外肝细胞系统的方法，其特征是所述酸性水为pH2-3。
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|---|---|---|---|---|
| CN102210889A (zh) * | 2010-04-02 | 2011-10-12 | 瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司 | 一种用于人工肝透析的体外生物材料及其制备方法 |
| CN106472483A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-03-08 | 宁波华莱斯医疗器械有限公司 | 一种液基细胞保存液及其制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
| US5200398A (en) * | 1991-09-12 | 1993-04-06 | Mount Sinai Hospital Corporation | Composition for the preservation of organs comprising glucuronic acid or a physiologically tolerated salt or ester thereof |
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| US20030013074A1 (en) * | 2000-12-04 | 2003-01-16 | Kenzo Bamba | Cell-preservation liquid and method of preserving cells by using the liquid |
| GB0031065D0 (en) * | 2000-12-20 | 2001-01-31 | Univ Cardiff | Preservation of cells |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102210889A (zh) * | 2010-04-02 | 2011-10-12 | 瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司 | 一种用于人工肝透析的体外生物材料及其制备方法 |
| CN106472483A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-03-08 | 宁波华莱斯医疗器械有限公司 | 一种液基细胞保存液及其制备方法 |
| CN108260586A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-10 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种原代小鼠肝实质细胞的冻存方法 |
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