JP2020130165A - 生体試料を含む固化体 - Google Patents
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Abstract
Description
DSCの測定条件:
(1)20℃で1分間保持後、5℃/minの降温速度で−80℃まで降温、および
(2)−80℃で1分間保持後、10℃/minの昇温速度で20℃まで昇温。
(1)所定量のNaClを30℃のイオン交換水に溶解させ、0.2MのNaCl溶液(標準液)を調製する。
(2)水溶性高分子またはその塩の試料を30℃の標準液に溶解させ、原液を調製する。水溶性高分子またはその塩の試料が溶液で入手される場合は、溶液から溶媒を除去した固形分を水溶性高分子またはその塩の試料とする。複数の水溶性高分子を含む混合試料の場合は、そのまま混合物の試料とする。水溶性高分子に不純物が混じった混合物であっても、そのまま試料とする。もっとも、後述する粘度平均分子量を測定する場合は、この限りではない。複数の水溶性高分子を含む混合試料の場合は、各水溶性高分子を分離、分画した後、各溶液から溶媒を除去したものを各水溶性高分子の試料とする。また、未知の水溶性高分子であれば、水溶性高分子についてHPLC、LC−MSやLC−IR等で物質を同定して、後述するように粘度平均分子量を計算する。また、未知の水溶性高分子を複数含む場合は、各成分を分離、分画し、それぞれの水溶性高分子についてHPLC、LC−MSやLC−IR等で物質を同定し、後述するように粘度平均分子量を計算する。なお、水溶性高分子に不純物が混じった混合物であっても、粘度に影響がなければ(例えば、金属塩のような不純物)、混合物を水溶性高分子の試料とする。また、粘度平均分子量の計算に影響がある不純物を含む場合は、不純物を除去するか、水溶性高分子を分画した後測定する。この際、標準液および原液それぞれの粘度を測定し、標準液に対する原液の相対粘度が2.0〜2.4となるように調整する。
(3)30℃の原液を、30℃の標準液を用いて5/4、5/3、5/2倍となるようにそれぞれ希釈する。
(4)30℃の標準液、原液および希釈液の粘度をそれぞれ測定する。粘度測定には、E型粘度計を用いる。
(5)原液および希釈液それぞれの粘度を標準液の粘度で割ったものを相対粘度(ηr)とし、下式に基づき還元粘度を導出する。
ここで、ηsp:水溶性またはその塩の還元粘度[mL/g]、ηr:水溶性高分子またはその塩の相対粘度[−]、C:水溶性高分子またはその塩の濃度[g/mL]である。
(6)水溶性高分子またはその塩の濃度と、水溶性高分子またはその塩の還元粘度との関係をそれぞれプロットし、近似直線を引く。近似直線の切片(高分子または糖類濃度=0)の値を水溶性高分子またはその塩の水溶液の極限粘度とする。
粘度平均分子量は、極限粘度から算出する。
上記のマークホーイング桜田の式に、測定で導出した極限粘度と、文献等で公開されているKとαの値から粘度平均分子量Mを求める。例えば、水溶性高分子がヒアルロン酸の場合、K=3.6×10-4およびα=0.78である。その他、プルランおよびゼラチンの場合、文献値よりK=9×10-4、α=0.5であり、デキストランでは、K=6.3×10-8、α=1.4、また、コンドロイチン硫酸では、K=5.8×10-4、α=0.74、フルクタンでは、K=1.6×10-3、α=0.45、カルボキシル化ポリリジンはK=2.78×10-5、α=0.87である。
ここで、DSCの測定条件:
(1)20℃で1分間保持後、5℃/minの降温速度で−80℃まで降温、および
(2)−80℃で1分間保持後、10℃/minの昇温速度で20℃まで昇温。
<試験用試料および試料溶液の調製>
・実施例1
容積2Lの耐圧容器に平均分子量100万である高分子ヒアルロン酸(Shanghai Easier Industrial Development社製)と水とを20:100で混合し、処理温度175℃、処理圧力0.89MPa、および処理時間3分で亜臨界処理を行った。その後、亜臨界処理物を凍結乾燥で乾燥した(なお、この乾燥はスプレードライ法でも可能であった)。これにより、粘度平均分子量が約1万の高分子ヒアルロン酸と粘度平均分子量1000のヒアルロン酸との混合物である水溶性高分子を得た。
処理時間7分で亜臨界処理を行った以外は、実施例1と同様な操作を行い、粘度平均分子量が1000のヒアルロン酸断片である試験用試料を得た。極限粘度0.08dL/gであった。
処理時間5分で亜臨界処理を行った以外は、実施例1と同様な操作を行い、粘度平均分子量が2000のヒアルロン酸断片である試験用試料を得た。極限粘度は、0.14dL/gであった。
処理時間4分で亜臨界処理を行った以外は、実施例1と同様な操作を行い、粘度平均分子量が3000のヒアルロン酸断片である試験用試料を得た。極限粘度は、0.19dL/gであった。
DMSO(ナカライテスク(株)製、細胞培養グレード)を試験用試料とした。この試験用試料1mLを溶媒であるαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)10mLに溶解させることにより、比較例1の試験用試料溶液を得た(すなわち、試験用試料溶液中の試験用試料のDMSO濃度が10w/v%)。
溶媒として使用したαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)を試験用試料とした。
ゼラチン(粘度平均分子量315000 新田ゼラチン(株)製)1gを溶媒としてのαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)10mLに溶解させることにより、比較例3の試験用試料溶液を得た(すなわち、試験用高分子水溶液中の試験用試料のゼラチン濃度が10w/v%)。極限粘度は0.50dL/gであった。
粘度平均分子量1000000である高分子量ヒアルロン酸(Shanghai Easier Industrial Development社製)1gを溶媒としてのαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)100mLに溶解させることにより、比較例4の試験用試料溶液を得た(すなわち、試験用試料溶液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が1w/v%)。極限粘度は、17.2dL/gであった。
粘度平均分子量15000であるヒアルロン酸(lifecore biomedical社製;粉末)を試験用試料とした。この試験用試料1gを溶媒であるαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)10mLに溶解させることにより、比較例5の試験用試料溶液を得た(すなわち、試験用試料溶液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が、10w/v%)。極限粘度は、0.65dL/gであった。
粘度平均分子量23000であるコンドロイチン硫酸ナトリウム塩A(sigma社製)を試験用試料とした。この試験用試料1gを溶媒であるαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)10mLに溶解させることにより、比較例6の試験用試料溶液を得た(すなわち、試験用試料溶液中の試験用試料のコンドロイチン硫酸濃度が10w/v%)。極限粘度は、0.97dL/gであった
アミノ基が60%カルボキシル化されたカルボキシポリリジン(粘度平均分子量13400:(株)バイオベルデ製、CryoScarless DMSO free)に、製造例1の試験用試料(粘度平均分子量が1000のヒアルロン酸断片試料)を1w/v%の量で添加して比較例7の試験用試料溶液とした。極限粘度は、0.11dL/gであった。
試験用試料としてラッキョウ由来のフルクタンを用いた。なお、フルクタンは特開2012−235728号公報の例2にしたがい、以下の方法で抽出・精製することによって得た。
粘度平均分子量373000であるプルラン(東京化成工業(株)製)を試験用試料とした。この試験用試料1gを溶媒であるαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)10mLに溶解させることにより比較例9の試験用試料溶液を得た(すなわち、試験用試料溶液中の試験用試料のヒアルロン酸濃度が10w/v%)。極限粘度は、0.55dL/gであった。
比較例5の試験用試料(粘度平均分子量15000のヒアルロン酸)1gを溶媒であるαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)10mLに溶解させたヒアルロン酸濃度10w/v%の水溶液に、製造例2の試験用試料(粘度平均分子量が2000のヒアルロン酸断片試料)を終濃度1w/v%の量で添加して、比較例10の試験用試料溶液を得た。極限粘度は、0.47dL/gであった。
比較例5の試験用試料(粘度平均分子量15000のヒアルロン酸)1gを溶媒であるαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)10mLに溶解させたヒアルロン酸濃度10w/v%の試験用試料溶液に、製造例1の試験用試料(粘度平均分子量が1000のヒアルロン酸断片試料)を終濃度1w/v%の量で添加した。得られた水溶液のpHを10mM Tris−HClを用いて中性に調整して、実施例2の試験用試料溶液とした。極限粘度は、0.65dL/gであった。
比較例9の試験用試料(粘度平均分子量373000のプルラン)1gを溶媒であるαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)10mLに溶解させたプルラン濃度10w/v%の試験用試料溶液に、製造例1の試験用試料(粘度平均分子量が1000のヒアルロン酸断片試料)を終濃度1w/v%の量で添加して、実施例3の試験用試料溶液を得た。極限粘度は、0.55dL/gであった。
比較例9の試験用試料(粘度平均分子量373000のプルラン)1gを溶媒であるαMEM培地(Gibco製、品番C1257−1500BT、溶媒は水である)10mLに溶解させたプルラン濃度10w/v%の試験用試料溶液に、製造例1の試験用試料(粘度平均分子量が1000のヒアルロン酸断片試料)を終濃度5w/v%の量で添加した。得られた水溶液のpHを10mM Tris−HClを用いて中性に調整して、実施例4の試験用試料溶液とした。極限粘度は、0.55dL/gであった。
容積2Lの耐圧容器に平均分子量100万である高分子ヒアルロン酸(Shanghai Easier Industrial Development社製)と水とを20:100で混合し、処理温度175℃、処理圧力0.89MPa、および処理時間3.5分で亜臨界処理を行った。その後、亜臨界処理物を凍結乾燥またはスプレードライ法で乾燥した。これにより、粘度平均分子量が約6000のヒアルロン酸試料を得た。
培養した初代ヒト間葉系幹細胞(Lonza PT2501)を、1×106個/mLの濃度で、実施例1および5ならびに比較例1、2、4、5、7および8の試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した。
実施例1〜5、比較例1〜10および製造例1〜3の各試験用試料溶液の溶媒をαMEM培地から超純水に変えて、示差走査熱量分析用のサンプルとした。各サンプルを、次に示すように示差走査熱量分析装置(DSC)で走査した。
(1)20℃で1分間保持後、速度フリーで−80℃まで降温。
(2)−80℃で1分間保持後、10℃/minの昇温速度で20℃まで昇温。
培養した初代ヒト間葉系幹細胞(Lonza PT2501)を、1×106個/mLの濃度で、実施例1および比較例1の試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した。その後、各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器(Nalgene(登録商標)ミスターフロスティー)中で、−80℃冷凍庫内で凍結して固化体を得た。固化体を−80℃で最長12か月まで保存した後、所定の保管期間で、各固化体を取り出し、37℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液の細胞生存率を解凍直後にトリパンブルー染色により評価した。結果を図4Aに示す。また、3か月間−80℃で凍結保存した固化体を解凍し、続いて4℃で、一日あるいは1週間保存した。4℃で保存後の細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。なお、4℃での保存後の細胞生存率は、解凍直後(すなわち保存直前)の細胞生存率を100%として算出した。結果を図4Bに示す。
培養した初代ヒト間葉系幹細胞(Lonza PT2501)を、1×106個/mLの濃度で、実施例1および比較例1の試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した。その後、各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器(Nalgene(登録商標)ミスターフロスティー)中で、−80℃冷凍庫内で凍結して固化体を得た。固化体を−80℃で6か月間保存した。6か月後に、各固化体を37℃の温浴中で急速解凍し、αMEMで洗浄したのち、6ウェルプレートに2.5×104個ずつ播種し、4日後、培養培地中のHGFおよびIL−10濃度を定量した。HGFおよびIL−10の定量には、それぞれ、専用のキット(Quantikine(登録商標) ELISA Human HGF、カタログ番号DHG00、R&D社製)、Quantikine(登録商標) ELISA Human IL−10、カタログ番号D100B、R&D社製)を用い、キット添付の手順書の順序に準じて行った。結果を図5Aおよび5Bに示す。
培養した初代ヒト間葉系幹細胞(Lonza PT2501)を、1×106個/mLの濃度で、実施例1および比較例1の試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した。その後、各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器(Nalgene(登録商標)ミスターフロスティー)中で、−80℃冷凍庫内で凍結して固化体を得た。固化体を−80℃で6か月間保存した。6か月後に、各固化体を取り出し、37℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液において、CD90、CD44およびCD105の発現強度をフローサイトメトリーにより解析した。結果を図6に示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞(cyagen C160)を、1×106個/mLの濃度で、実施例1〜4および比較例3、6、9および10の試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した(ただし、実施例1の試験用試料溶液中のヒアルロン酸試料の濃度は20w/v%とした)。その後、各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器(Nalgene(登録商標)ミスターフロスティー)中で、−80℃冷凍庫内で凍結して固化体を得た。各固化体を1日間保存した後、各固化体を取り出し、37℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を表1に示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞(cyagen C160)を、1×106個/mLの濃度で、実施例1および比較例1の試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した。対照として、凍結保存剤を含まないαMEM培地からなる比較例2の試験用試料溶液に細胞を懸濁させた対照懸濁液を同様に調製した。その後、各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液および対照懸濁液を、硬質硝子製試料置板(16φ×0.12mm)に5μL添加し、硬質硝子製カバーガラス(12φ×0.12mm)でカバーし、linKam社製顕微鏡用冷却ステージ(THMS600)で、5℃/minで−80℃まで降温し、透過光顕微鏡(Olympus BX53)で−80℃にて固化体の画像を撮影した。結果を図7A〜Cに示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞(cyagen C160)を、1×106個/mLの濃度で、実施例1〜5および比較例1〜10の試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した。対照として、凍結保存剤を含まないαMEM培地からなる比較例2の試験用試料溶液に細胞を懸濁させた対照懸濁液を同様に調製した。その後、各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液および対照懸濁液を、硬質硝子製試料置板(16φ×0.12mm)に5μL添加し、硬質硝子製カバーガラス(12φ×0.12mm)でカバーし、linKam社製顕微鏡用冷却ステージ(THMS600)で、5℃/minで−80℃まで降温し、透過光顕微鏡(Olympus BX53)で−80℃にて固化体の画像を撮影した。図8Aおよび8Bに実施例1ならびに比較例1および2の結果を示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞(cyagen C160)を、1×106個/mLの濃度で、実施例1〜5、比較例1〜10および製造例1〜3の試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した。その後、各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液を、硬質硝子製試料置板(16φ×0.12mm)に5μL添加し、硬質硝子製カバーガラス(12φ×0.12mm)でカバーし、linKam社製顕微鏡用冷却ステージ(THMS600)で、5℃/minで−80℃まで降温して固化させ、透過光顕微鏡(Olympus BX53)で固化体を観察した。培養液中(培地中)すなわち固化前および−80℃への降温後(固化した状態)に冷却ステージの法線方向上方から固化体の画像を撮影した。撮影した降温前および降下後の画像において各細胞の細胞面積を画像解析ソフトImageJを用いて算出し(細胞の正射影面積)、固化に伴う細胞の正射影面積の変化を求めた。固化前の培養液中(培地中)の細胞の面積に対する固化後の細胞の面積の割合を算出し、細胞の収縮率(%)とした。結果を表1に示す。
培養したマウス由来マクロファージ様細胞株(RAW264)、ヒト結腸癌由来細胞(Caco-2)および初代ヒト肺微小血管内皮細胞(HMVEC)のそれぞれを、1×106個/mLの濃度で、実施例1および比較例1の試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した。その後、各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器(Nalgene(登録商標)ミスターフロスティー)中で、−80℃冷凍庫内で凍結して固化体を得た。固化体を7日間保存した後、各固化体を取り出し、37℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図9に示す。
培養した初代イヌ間葉系幹細胞(cyagen C160)を、1×106個/mLの濃度で、製造例1〜3の各試験用試料溶液(血清非含有)に懸濁した。その後、各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液を、緩慢細胞凍結器(Nalgene(登録商標)ミスターフロスティー)中で、−80℃冷凍庫内で凍結して固化体を得た。固化体を7日間保存した後、各固化体を取り出し、37℃の温浴中で急速解凍した。解凍後の各試験用試料溶液を含む細胞懸濁液の細胞生存率をトリパンブルー染色により評価した。結果を図10および表1に示す。
製造例1〜3の試験用試料の1wt%水溶液を作製し、0.45μmのメンブレンフィルター(ミリポア社製)でフィルターろ過した後、各試験用試料の成分をHPLCにより分析した。移動相として、A液:16mM NaH2PO4水溶液、B液:800mM NaH2PO4水溶液を用い、ZORBAX NH2(アジレント・テクノロジー(株)製、カラムサイズφ4.6×250mm、粒子径5μm)順相HPLCカラムを用いて、流速1.0mL/min、カラム温度40℃、検出波長210nmで、成分を分離した。グラジエント条件は、移動相B濃度0%(0分)→移動相B濃度100%(60分)とした。結果を図11A〜Cに示す。また、標品として、0.2wt%の濃度で、二糖であるHA02、四糖であるHA04、六糖であるHA06、八糖であるHA08および十糖であるHA10(全てイズロン社製)のヒアルロン酸のオリゴ糖をそれぞれ含む水溶液を調製し同様にHPLC分析を行った。この結果が図11Dに示されている。
実施例1の試験用試料(亜臨界処理により得られた粘度平均分子量が約1万のヒアルロン酸試料)について、上述の製造例1〜3の試験用試料のHPLC分析と同じ条件を用いて、HPLC分析した。結果を図12に示す。
Claims (13)
- 水性溶媒と水溶性高分子またはその塩とを含有するマトリクスおよび生体試料を含む固化体であって、
前記生体試料が、固化する前と比べて1より小さく1/3.5以上に縮小された正射影面積を有し、
可視光を透過させた場合に光射出側から見て、前記生体試料が占める領域のマンセル表色系における明度および前記マトリクスが占める領域のマンセル表色系における明度の差が3以下であり、
前記マトリクスの、示差走査熱量計(DSC)を用いた下記(1)〜(2)の測定条件によって得られる昇温過程のDSC曲線において、吸熱ピークが確認されないか、または吸熱ピークが確認される温度が−1.4℃を超え、1.1℃以下であることを特徴とする固化体。
(DSC測定条件)
(1)20℃で1分間保持後、5℃/minの降温速度で−80℃まで降温。
(2)−80℃で1分間保持後、10℃/minの昇温速度で20℃まで昇温。 - 固体凍結物である請求項1記載の固化体。
- 前記水溶性高分子またはその塩を0.1〜20w/v%以下の含有量で含む請求項1または2記載の固化体。
- 前記(1)〜(2)の測定条件によって得られる昇温過程のDSC曲線において、前記昇温過程における、吸熱ピークの吸熱量が、0J/g、または水からなる基準液の対応する吸熱量の65%以下である請求項1〜3のいずれか1項に記載の固化体。
- 前記生体試料が細胞であり、前記細胞が、哺乳動物細胞である請求項1〜4のいずれか1項に記載の固化体。
- 前記生体試料が細胞であり、前記細胞が、哺乳動物間葉系幹細胞、哺乳動物血球細胞、または哺乳動物内皮細胞である請求項5記載の固化体。
- 融解されて生体試料投与用溶液として用いられる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の固化体。
- 前記生体試料投与用溶液中に含有される生体試料によるHGFの産生量が、前記水溶性高分子またはその塩の代わりにDMSOを含む固化体中の生体試料が融解後に産生するHGFの産生量と比較して抑制されている、請求項7記載の固化体。
- 前記生体試料投与用溶液中に含有される生体試料によるIL−10の産生量が、前記水溶性高分子またはその塩の代わりにDMSOを含む固化体中の生体試料が融解後に産生するIL−10の産生量と比較して増大されている、請求項7記載の固化体。
- 生体試料を含んだ固化体を製造する方法であって、
水溶性高分子またはその塩を水性溶媒中に溶解させて
−80℃に凍結させた際、前記生体試料が、固化する前と比べて1より小さく1/3.5以上に縮小された正射影面積を有し、
−80℃に凍結させた際、可視光を透過させた場合に光射出側から見て、前記生体試料が占める領域のマンセル表色系における明度および前記生体試料が占める前記領域以外の領域のマンセル表色系における明度の差が3以下であり、
示差走査熱量計(DSC)を用いた下記(1)〜(2)の測定条件によって得られる昇温過程のDSC曲線において、吸熱ピークが確認されないか、または吸熱ピークが確認される温度が−1.4℃を超え、1.1℃以下となる性質をもつように調整された高分子水溶液を準備する工程と、
前記高分子水溶液中に前記生体試料を含ませる工程と、
前記生体試料を含む前記高分子水溶液を冷却および凍結する工程とを備えることを特徴とする固化体を製造する方法。
(DSC測定条件)
(1)20℃で1分間保持後、5℃/minの降温速度で−80℃まで降温。
(2)−80℃で1分間保持後、10℃/minの昇温速度で20℃まで昇温。 - 前記生体試料を含む前記高分子水溶液を冷却および凍結する工程が、冷却速度10℃/min以下の緩慢凍結法で−27℃以下の温度まで冷却および凍結することで行われる請求項10記載の固化体を製造する方法。
- 前記固化体が、前記水溶性高分子を0.1〜20w/v%以下の含有量で含む請求項10または11記載の固化体を製造する方法。
- 前記(1)〜(2)の測定条件によって得られる昇温過程のDSC曲線において、前記昇温過程における、吸熱ピークの吸熱量が、0J/g、または水からなる基準液の対応する吸熱量の65%以下である請求項10〜12のいずれか1項に記載の固化体を製造する方法。
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