CN105063006A - 一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球及其制备方法和应用，属于生化技术领域。本发明以海藻酸钠、膨润土、壳聚糖和氯化钙为固定化材料，对邻苯二甲酸二丁酯降解菌进行固定，从而得到邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球。考察固定化微球在28天的修复过程中对土壤中DBP去除效果，在28d时固定化微球处理组中，DBP的残留量小于20％；相比之下空白对照组DBP残留量最高为70.76％，游离菌处理组介于两者之间，DBP残留量在50％以上。本发明邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定，避免了土著微生物的竞争以及不利于微生物生存的土壤条件的侵害，为有效解决DBP污染土壤提供理论基础以及技术支持。

Description

一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球及其制备方法和应用，属于生化技术领域。

背景技术

邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是邻苯二甲酸酯(PAEs)的一种，是全球性的有机污染物，被美国国家环保局列为优控污染物。DBP具有较高的毒性，通过食物链进入生物体内并富集，从而引起生殖、神经、肝脏等器官的不适。DBP是一种重要的增塑剂，是塑料农膜的重要成分，为了保证粮食生产具有较高的水平，塑料农膜被大量使用，由于DBP在聚合物质中不能稳定的存在，使DBP在土壤中残留量大，通过迁移转化等作用，造成土壤、水体、和大气严重污染，进而引发多种环境危害。

生物修复技术因其二次污染少、效果好以及费用低等特点成为治理PAEs污染的主要方法。游离菌从原来营养丰富的液体培养基中添加到土壤中时，生长环境反差较大，造成细菌对氧气、水分和营养物质的获取难度增加，并且由于没有保护性的壁垒易于被土壤中的原生动物捕食，因而生长较为缓慢，甚至出现部分死亡，另一方面由于游离菌长期在土壤环境中，土著微生物或土壤自身的环境造成降解菌的性质发生改变，使其死亡，从而对DBP不再有降解的能力。

固定化微生物技术能够有效的避免游离菌的不足，游离菌在载体所形成的微环境保护下可免受土壤环境的不利影响和高浓度污染物的直接侵害，还可吸收利用载体中的营养物质，从而保持较高的生一长繁殖基数与活性，同时，由天然多糖性物质组成的载体材料可在土壤中渐渐被微生物降解，使得载体中的降解菌缓慢释放到土壤中，发挥对DBP的降解作用，并且能够持续的增长繁殖。

发明内容

本发明针对游离邻苯二甲酸二丁酯降解菌在土壤修复中的问题，提供一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球。

为达到上述目的本发明采用了以下技术手段：

一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球，包括固定化材料和邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液，其特征在于，所述固定化材料由以下按重量份计的组分制备而成：

海藻酸钠1.00-1.33份，膨润土0.67-1.50份，壳聚糖0.10-0.30份，氯化钙0.20-0.60份；

其中，海藻酸钠和膨润土的混合溶液是由以下方法制备得到：

将所述重量份的海藻酸钠和膨润土溶于蒸馏水中，搅拌均匀，即得海藻酸钠与膨润土的质量分数分别为2.5％～3.3％和1.7％～3.8％的混合溶液；

所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液与所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液的体积比为1:10～1:20。

在本发明中，优选的，所述固定化材料由以下按重量份计的组分制备而成：

海藻酸钠1.33份，膨润土0.67份，壳聚糖0.20份，氯化钙0.60份；

其中，所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液中海藻酸钠与膨润土的质量分数分别为3.3％和1.7％；所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液与所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液的体积比为1:10。

在本发明中，优选的，所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌为假单胞菌属(Pseudomonassp.)DNB-S1，已被专利公开，专利申请号为201410798113.0，专利名称为邻苯二甲酸二丁酯降解菌；所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液的OD₆₀₀＝2。

进一步的，本发明还提供了制备所述的固定化微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)溶液的配制

壳聚糖溶液：将壳聚糖和乙酸按质量体积比2:5～6:5的比例溶于蒸馏水中，静置4h，然后用1mol〃L^-1NaOH调节pH至5.5，最终配制成质量分数为0.25～0.75％的壳聚糖溶液；

氯化钙溶液：将氯化钙溶于蒸馏水中，制备成质量分数为为0.5％～1.5％的氯化钙溶液；

(2)邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球制备

①将培养24h的邻苯二甲酸二丁酯降解菌培养液装入无菌离心管中，离心并去上清，留下菌体，用与无菌生理盐水冲洗菌体并摇匀，制成细菌悬液，使细菌悬液的OD₆₀₀＝2；

②将步骤①的细菌悬液按照体积比为1:10～1:20的比例加入到海藻酸钠和膨润土的混合溶液，混匀；

③用注射器吸取适量步骤②混匀后的混合液，悬空逐滴匀速滴入到氯化钙溶液中，固化30min，固定成球后将其转入壳聚糖溶液中覆膜30min，之后将小球用无菌水清洗三次，即得到硬化的邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球。

在本发明中，优选的，所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液中海藻酸钠与膨润土的质量分数分别为3.3％和1.7％；所述的壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为0.5％；所述的氯化钙溶液中氯化钙的质量分数为1.5％；所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液与所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液的体积比为1:10。

更进一步的，本发明还提供了所述的固定化微球在生物降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。

本发明为了确定固定化载体材料的最优配比，选择不同的海藻酸钠/膨润土质量比例、CaCl₂溶液浓度、壳聚糖溶液浓度以及包菌量(邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液与海藻酸钠和膨润土的混合溶液的体积比)为组分，以固定化微球对DBP的降解率为考察目标，优化固定化成球条件。正交实验的结果表明固定化成球的最佳条件为海藻酸钠/膨润土的质量比为2:1，壳聚糖浓度为0.5％，氯化钙浓度为1.5％，包菌量为10％。

用傅里叶变换红外光谱仪分别对海藻酸钠/膨润土复合凝胶微球、海藻酸钙凝胶以及膨润土的官能团进行观测，利用扫描电镜以及比表面积分析仪对固定化微球的孔径以及比表面积进行表征。

考察固定化微球在28天的修复过程中对土壤中DBP去除效果，在28d时固定化微球处理组中，DBP的残留量小于20％；相比之下空白对照组DBP残留量最高为70.76％，游离菌处理组介于两者之间，DBP残留量在50％以上。

本发明邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化，避免了土著微生物的竞争以及不利于微生物生存的土壤条件的侵害，为有效解决DBP污染土壤提供理论基础以及技术支持。

附图说明

图1为本发明邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的照片；

图2为邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的红外光谱分析结果图；

图3为邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的扫描电镜分析结果图；

图4为邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的比表面积以及孔径分析结果图；其中，(a)吸附-脱附等温线，(b)孔径分布，(c)BET直线图；

图5为邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的土壤修复效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明邻苯二甲酸二丁酯降解菌为假单胞菌属(Pseudomonassp.)DNB-S1，已被专利公开，专利申请号为201410798113.0，专利名称为邻苯二甲酸二丁酯降解菌。

实施例1邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的制备方法

一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球，包括固定化材料和邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液，固定化材料由以下按重量份计的组分制备而成：

海藻酸钠1.33份，膨润土0.67份，壳聚糖0.20份，氯化钙0.60份；

海藻酸钠和膨润土的混合溶液中海藻酸钠与膨润土的质量分数分别为3.3％和1.7％；邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液与海藻酸钠和膨润土的混合溶液的体积比为1:10。

按照以下正交试验获得上述组分的组成比例：

本发明邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化载体材料为海藻酸钠、膨润土、氯化钙以及壳聚糖，以不同海藻酸钠/膨润土质量比例、CaCl₂溶液浓度、壳聚糖溶液浓度以及包菌量(邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液与海藻酸钠和膨润土的混合溶液的体积比)为组分，以固定化微球对DBP的降解率为考察目标，优化固定化成球条件。固定化微球正交设计如表1所示。正交实验的结果表明固定化成球的最佳条件为海藻酸钠/膨润土为质量比2:1，壳聚糖浓度为0.5％，氯化钙浓度为1.5％，包菌量为10％。其固定化微球正交设计结果如表2所示。

表1.固定化微球正交设计表

表2.固定化微球正交设计结果

从表2可以看出四种因素对固定化微球的包埋率有明显的影响。比较极差R大小可知影响固定化微球降解率的组分依次为海藻酸钠与膨润土的质量比例(A)>包菌量(D)>壳聚糖浓度(B)>氯化钙浓度(C)。由正交表实验所显示的最佳组合为A₂B₂C₃D₁。

根据正交试验的结果得出优化材料的最优配比及其制备工艺(以120ml反应体系制备本发明的固定化微球)如下：

(1)溶液的配制

壳聚糖溶液：将0.2g壳聚糖和250μL乙酸溶于40ml蒸馏水中，静置4h，然后用1mol〃L^-1NaOH调节pH至5.5，最终配制成质量分数为0.5％的壳聚糖溶液；

海藻酸钠和膨润土的混合溶液：分别将1.33g海藻酸钠和0.67g膨润土溶于40ml蒸馏水中，搅拌均匀，海藻酸钠与膨润土的质量分数分别为3.3％和1.7％；

氯化钙溶液：将0.60g氯化钙溶于40ml蒸馏水中，制备成质量分数为1.5％的氯化钙溶液。

(2)邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球制备

①将培养24h的邻苯二甲酸二丁酯降解菌培养液装入无菌离心管中，离心并去上清，留下菌体，用与无菌生理盐水冲洗菌体并摇匀，制成细菌悬液，使细菌悬液的OD₆₀₀＝2；

②将步骤①的细菌悬液按照体积比为1:10～1:20的比例加入到海藻酸钠和膨润土的混合溶液，混匀；

③用注射器吸取适量步骤②混匀后的混合液，悬空逐滴匀速滴入到氯化钙溶液中，固化30min，固定成球后将其转入壳聚糖溶液中覆膜30min，之后将小球用无菌水清洗三次，即得到硬化的邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球。

固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌成球效果较好，形态规则，易于成球。邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的照片如图1所示。

试验例1本发明制备的固定化微球的物理性能和应用

(一)固定化微球的红外光谱分析

邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球中加入的膨润土的表面存在大量的-OH，与海藻酸钙的羧基发生了离子化，二者形成离子键，产生了微弱的静电引力。而膨润土含有大量的羟基，在水介质中能与海藻酸钠形成氢键作用，可有效抑制海藻酸钠的大量溶胀。邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的红外光谱如图2所示。

(二)固定化微球的扫描电镜分析

该固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌成球有大量的微孔存在，有利于固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌有效的获取营养物质和溶解氧，并有效的阻止了大分子有毒有害物质对包埋在载体内的邻苯二甲酸二丁酯降解菌的毒害，能及时的排出代谢产物和有毒物质，这种结构对维持固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌良好的内部环境起到了决定性的作用，是保证固定化邻苯二甲酸二丁酯降解菌较高降解率的重要因素。邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的扫描电镜分析如图3所示。

(三)固定化微球的比表面积以及孔径分析

BET分析结果表明，孔径主要分布在3.88nm左右，部分分布在12.26nm左右，平均孔径为7.5nm，该邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的比表面积为59.369m²/g。邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的比表面积以及孔径分析如图4所示。

(四)固定化微球的土壤修复效果

在28天的修复过程中对土壤中DBP去除效果表明，14d时，各处理组DBP残留量均在66％以上，其中空白对照组高达90.93％；在28d时固定化微球处理组中，DBP的残留量小于20％；相比之下空白对照组DBP残留量最高为70.76％，游离菌处理组介于两者之间，DBP残留量在50％以上(图5)。

Claims (6)

1.一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球，包括固定化材料和邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液，其特征在于，所述固定化材料由以下按重量份计的组分制备而成：

海藻酸钠1.00-1.33份，膨润土0.67-1.50份，壳聚糖0.10-0.30份，氯化钙0.20-0.60份；

其中，海藻酸钠和膨润土的混合溶液是由以下方法制备得到：

将所述重量份的海藻酸钠和膨润土溶于蒸馏水中，搅拌均匀，即得海藻酸钠与膨润土的质量分数分别为2.5%～3.3%和1.7%～3.8%的混合溶液；

所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液与所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液的体积比为1:10～1:20。

2.根据权利要求1所述的固定化微球，其特征在于，所述固定化材料由以下按重量份计的组分制备而成：

海藻酸钠1.33份，膨润土0.67份，壳聚糖0.20份，氯化钙0.60份；

其中，所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液中海藻酸钠与膨润土的质量分数分别为3.3%和1.7%；所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液与所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液的体积比为1:10。

3.根据权利要求1或2所述的固定化微球，其特征在于，所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌为假单胞菌属（Pseudomonassp.）DNB-S1，已被专利公开，专利申请号为201410798113.0，专利名称为邻苯二甲酸二丁酯降解菌；所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液的OD₆₀₀=2。

4.制备权利要求1所述的固定化微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）溶液的配制

壳聚糖溶液：将壳聚糖和乙酸按质量体积比2:5～6:5的比例溶于蒸馏水中，静置4h，然后用1mol·L^-1NaOH调节pH至5.5，最终配制成质量分数为0.25～0.75%的壳聚糖溶液；

氯化钙溶液：将氯化钙溶于蒸馏水中，制备成质量分数为为0.5%～1.5%的氯化钙溶液；

（2）邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球制备

①将培养24h的邻苯二甲酸二丁酯降解菌培养液装入无菌离心管中，离心并去上清，留下菌体，用与无菌生理盐水冲洗菌体并摇匀，制成细菌悬液，使细菌悬液的OD₆₀₀=2；

②将步骤①的细菌悬液按照体积比为1:10～1:20的比例加入到海藻酸钠和膨润土的混合溶液，混匀；

③用注射器吸取适量步骤②混匀后的混合液，悬空逐滴匀速滴入到氯化钙溶液中，固化30min，固定成球后将其转入壳聚糖溶液中覆膜30min，之后将小球用无菌水清洗三次，即得到硬化的邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液中海藻酸钠与膨润土的质量分数分别为3.3%和1.7%；所述的壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为0.5%；所述的氯化钙溶液中氯化钙的质量分数为1.5%；所述的邻苯二甲酸二丁酯降解菌悬液与所述的海藻酸钠和膨润土的混合溶液的体积比为1:10。

6.权利要求1-3任一项所述的固定化微球在生物降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。