CN103305497A - 一种用于固定化酶修复有机污染土壤的微胶囊及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于固定化酶修复有机污染土壤的微胶囊及其制备方法。所述的微胶囊由壳聚糖3-5份、海藻酸钠2-8份、羧甲基纤维素钠2-8份、CoCl₂·6H₂O0.2-0.6份制备而成。本发明提高了对酶包埋率；降低了生产成本；提升了酶的抗逆性指标。并且本发明的制备均在常温下进行，与现有技术相比，本发明可以大大减少原材料的损失，成品率高达79%，此外，本发明的固定化酶较游离酶更加稳定。

Description

一种用于固定化酶修复有机污染土壤的微胶囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种可修复有机污染土壤的微胶囊，尤其涉及一种用于固定化酶修复有机污染土壤的微胶囊及其制备方法，属于微胶囊领域。

背景技术

固定化酶（immobilized enzyme）是指水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。

微胶囊是一种采用高分子聚合物或其他成膜材料将物质的微粒或微滴包覆所形成的微小容器，其粒径一般在微米至毫米级范围，通常为5-400μm。被包覆的物质成为囊心，壁壳称囊壁，构成囊壁的成膜材料称为壁材或囊材。

将酶用微胶囊包覆后形成的微胶囊固定化酶，由于被催化物质和产物可自由通过囊壁，因而能起到酶催化剂的作用，酶经过微胶囊固定化后，使酶具有如下的优点：1、提高了酶的稳定性，使其可以在恶劣的条件下存活。微胶囊囊壁可将对酶活性和稳定性有影响的抑制因子、有害因子等排除在外，同时还可与一定量的稳定剂、整合剂等一起包埋，进一步增加其耐极端条件的能力；2、通过选择合适的胶囊，可控制酶的释放时间。这对于多阶段加工过程中酶的活力要在后一阶段发挥的情况来说，尤为有用；3、改变微胶囊的表面活性，可使酶具有靶向作用；4、微胶囊固定化酶易于与产物分离可以回收反复使用，改善了后处理过程，提高了利用效率，降低了成本；5、包覆多种酶及其它物质，构成复合酶系统，形成能模拟生物细胞的人造细胞。在选择微胶囊固定化酶的囊壁材料时应考虑所得囊壁孔径的大小，既要能允许被催化物质顺利通过，又要能避免酶的渗透损失。此外，还要着重考虑囊材的毒性，与酶的相容性，以及制备方法对包囊材料的要求。目前，常见的微胶囊固定化酶的囊材有：聚赖氨酸/海藻酸钠、羧甲基纤维素/海藻酸钙、脱乙酰几丁酯/海藻酸钠、聚赖氨酸/脱乙酰几丁酯/海藻酸钠双层膜、脱乙酰几丁酯/羧甲基纤维素、甲基丙烯酸乙酯/甲基丙烯酸甲酯共聚物、海藻酸钠/聚赖氨酸/海藻酸钠等海藻酸钠类，还有壳聚糖类、聚丙烯酸酸脂类和琼脂类，以及新壁材有孔淀粉、脂质体、改性β-环状糊精等（张黎黎等,微胶囊固定化酶的制备及应用,云南大学学报（自然科学版）,2003,25（增刊）：246-250）。

自从A.M.Sun发明海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）微胶囊以来，微胶囊技术广泛用于动植物细胞、微生物及酶的固定化、药物控释等领域。王娜等以海藻酸钠、壳聚糖为载体，用微胶囊法固定化木聚糖酶，使得固定化木聚糖酶的贮藏稳定性和重复操作稳定性都有明显提高（王娜等,壳聚糖-海藻酸钠微胶囊固定化木聚糖酶的研究,安徽农业科学,200937(16)7318-73197325）。

利用微胶囊固定化载体材料提供的有利微环境作为缓冲体系，屏蔽土著微生物对酶分解（Cunningham C J,Ivshina I B,Lozinsky V I,et al．Bioremediation ofdiesel-contaminated soil by microorganisms immobilised in polyvinyl alcohol[J]．International Biodeterioration and Biodegradation，2004，54(2-3):167-174．）和不利土壤条件的侵害作用（Pritchard P H．Use of inoculation inbioremediation[J]．Current Opinion Biotechnology,1992,3(3):232-243．），从而保证酶长时间保持高效性；同时，微胶囊固定化载体作为吸附剂还可以有效地富集土壤中的有机污染物，提高其在载体上的生物有效浓度，从而提升修复效果（钱林波，元妙新，陈宝梁．固定化微生物技术修复PAHs污染土壤的研究进展[J]．2012,33(5):1767-1776）。另外，微胶囊固定化材料还可以起到疏松剂的作用，加快氧气的输送，因而加速有机污染物的矿化作用（Su D,Li P J,Wang X,et al．Biodegradationof benzo[a]pyrene in soil by immobilized fungus［J］．Environmental EngineeringScience,2008,25(8):1181-1188．）。因此，微胶囊固定化酶技术以其独特的优势和巨大的应用潜力在土壤有机污染修复中的应用特征非常明显。

发明内容

本发明针对土壤中有机物污染问题，提供了一种用于固定化酶修复有机污染土壤的微胶囊及其制备方法。

由以下按重量份计的组分组成：

壳聚糖3-5份、海藻酸钠2-8份、羧甲基纤维素钠2-8份、CoCl₂·6H₂O0.2-0.6份。

优选的，壳聚糖4份、海藻酸钠6份、羧甲基纤维素钠6份、CoCl₂·6H₂O0.2-0.4份。

制备上述微胶囊的方法，包括以下步骤：

1溶液的配制

壳聚糖溶液：将壳聚糖和乙酸按质量体积比为1：1的比例溶于蒸馏水中，静置4h，然后用1mol·L^-1NaOH调节pH至5.5，最终配制成质量百分浓度为0.5%的壳聚糖溶液；

羧甲基纤维素钠和海藻酸钠混合溶液：取羧甲基纤维素钠，溶于蒸馏水中，静置12h后，加入等同质量的海藻酸钠，加入蒸馏水搅拌均匀，在高压锅内121℃灭菌20min，羧甲基纤维素钠与海藻酸钠的质量浓度均为1%；

CoCl₂溶液：将CoCl₂·6H₂O溶于蒸馏水中，制备CoCl₂的物质的量浓度为0.05mol·L^-1。

2微胶囊的制备

①将上述羧甲基纤维素钠和海藻酸钠混合溶液冷却至室温，按1-15mg·L^-1的最终浓度加入酶液；

②用灭菌后的注射器吸入羧甲基纤维素钠和海藻酸钠酶溶液，将其均匀涂布在45-50目的筛片表面；

③将步骤②中筛片表面的羧甲基纤维素钠和海藻酸钠酶溶液鼓入到步骤1制备的壳聚糖乙酸溶液中，静置30min形成微胶囊酶；

④转移步骤③制备的微胶囊酶到CoCl₂溶液中，常温固化30min后，经纱布过滤获得微胶囊，滤过的CoCl₂溶液可以重复使用；

⑤用去离子水洗去表面的金属钴离子溶液，然后抽滤得到硬化的微胶囊酶凝胶体。

本发明取得的技术效果：

1、提高了对酶的包埋率

本发明中添加了羧甲基纤维素钠，使得微胶囊内部出现了多孔复膜，减小了孔隙度，本发明微孔孔径小于5nm的比例约为60%，孔径小于20nm的比例高达75%，微胶囊的比表面积为76.471m²·g^-1；而没有加入羧甲基纤维素钠的微胶囊，孔径小于20nm的比例仅为25%，孔径大于150nm的高达25%，孔径难以达到对酶的包埋，微胶囊的比表面积为43.34m²·g^-1。

2、降低了生产成本

现有技术中选用的聚赖氨酸，市场售价每千克1250元；硫酸纤维素钠，市场售价7387.77每千克元；聚二甲基二烯丙基氯化铵，市场售价每千克15300元，而本发明选用的壳聚糖，市场售价每千克88元；海藻酸钠，市场每千克80.0元；羧甲基纤维素钠，市场售价每千克16元。此外，羧甲基纤维素钠的加入将减少海藻酸钠的用量，不仅优化了微胶囊的内部结构，同时也大大降低了材料的成本。

3、提升了酶的抗逆性指标

羧甲基纤维素钠的加入在对酶的抗逆性能有了较大的提升。具体如下：

（1）低温条件下（4℃）在28d时，固定化酶处理组对土壤有机污染物（阿特拉津）的修复效果比游离酶提升了25%以上；

（2）微胶囊固定化酶（阿特拉津降解酶）在经过5次重复使用后，对阿特拉津修复能力依然维持在45%以上；

（3）微胶囊固定化酶比游离酶活力保持时间延长了4倍以上，极大地增加了酶的修复时间。

4、本发明的制备过程均在常温下进行，成品率高达79%，与现有技术相比，本发明可以大大减少能耗和原材料的损失。

5、微胶囊固定化酶在修复土壤的同时，对土壤中的微生物群落几乎没有影响，表明了本发明制备的固定化酶具有生态安全性。

附图说明

图1为含羧甲基纤维素钠的微胶囊结构扫描电镜图；

图2为不含羧甲基纤维素钠微胶囊结构扫描电镜图；

图3为含有羧甲基纤维素钠的吸附-脱附等温线图；

图4为含有羧甲基纤维素钠的孔径分布图；

图5为不含有羧甲基纤维素钠的吸附-脱附等温线图；

图6为不含有羧甲基纤维素钠的孔径分布图；

图7为不同酶处理对阿特拉津残留量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一种用于固定化酶修复有机污染土壤的微胶囊，由以下按重量份计的组分组成：

壳聚糖4份、海藻酸钠6份、羧甲基纤维素钠6份、CoCl₂·6H₂O0.2-0.4份。

按以下正交试验获得上述组分的组成比例：

选择壳聚糖质量百分浓度、金属离子物质的量浓度、壳聚糖溶液的pH、羧甲基纤维素钠和海藻酸钠的质量比例（其中酶的含量为10:1）这四个因素，进行四因素三水平（L(9)3⁴）的正交试验，以微胶囊固定化酶包埋率为考察目标，优化微胶囊制备条件。正交试验设计见表1。对其进行正交试验，正交试验结果如表2所示。

表1.微胶囊化酶的正交试验设计表

表2.L(9)3⁴正交试验结果

从表2可以看出四种因素对微胶囊的包埋率有明显的影响。比较极差R大小可知影响微胶囊包埋率的组分依次为壳聚糖pH值(D)＞羧甲基纤维素钠和海藻酸钠的比例(A)＞CoCl₂物质的量浓度(C)＞壳聚糖质量百分浓度(B)。由试验结果可以确定理论上的最佳组合为A₂B₂C₁D₂，而正交表实验所显示的最佳工艺组合为A₂B₃C₁D₂。将理论组合重新做验证试验，包埋率为78%，综合理论和实际确定最佳组合为：A₂B₂C₁D₂即羧甲基纤维素钠和海藻酸钠的质量比例为1:1，壳聚糖初始质量百分浓度为0.5%，并由1mol·L^-1的NaOH调节壳聚糖溶液pH至5.5，CoCl₂物质的量浓度为0.05mol·L^-1。

结合正交试验获得的最佳比例组合，以1L反应体系制备本发明用于固定化酶修复有机污染土壤的微胶囊，具体步骤如下：

1.溶液的配制

壳聚糖溶液：称取壳聚糖2g，加入2ml乙酸，先溶于350ml的蒸馏水中，大约放置4h后，用1mol·L^-1NaOH调节pH至5.5，并最终用蒸馏水配制成质量分数浓度为0.5%，配制的壳聚糖溶液最终体积为400ml；

羧甲基纤维素钠和海藻酸钠混合溶液：称取羧甲基纤维素钠3g，溶于200ml蒸馏水中，放置12h后，加入3g海藻酸钠，并加入100ml蒸馏水，搅拌均匀后，在高压锅内121℃灭菌20min；

CoCl₂溶液：称取CoCl₂·6H₂O3.570g，溶于300ml蒸馏水中，在后期制备微胶囊时可以重复使用15次以上。

2.微胶囊的制备

①将上述羧甲基纤维素钠和海藻酸钠混合溶液冷却至室温，加入酶液，酶最终物质的量浓度为10mg·L^-1；

②用灭菌后的注射器吸入羧甲基纤维素钠和海藻酸钠酶溶液，将其均匀涂布在45-50目的筛片表面；

③将步骤②中筛片表面的羧甲基纤维素钠和海藻酸钠酶溶液鼓入到步骤1制备的壳聚糖乙酸溶液中，静置30min形成微胶囊酶；

④转移步骤③制备的微胶囊酶到CoCl₂溶液中，常温固化30min后，经纱布过滤获得微胶囊，滤过的CoCl₂溶液可以重复使用；

⑤用去离子水洗去表面的金属钴离子溶液，然后抽滤得到硬化的微胶囊酶凝胶体。

在微胶囊的制备过程中，CoCl₂溶液溶液可重复使用，因此，本发明中CoCl₂·6H₂O的含量为平均值。

试验例1本发明制备的微胶囊与不含羧甲基纤维素钠微胶囊进行比较

试验资料：不含羧甲基纤维素钠微胶囊制备过程同本发明方法基本相同，差别仅在于用海藻酸钠等量替代了羧甲基纤维素钠。

对实施例1制备的微胶囊和不含羧甲基纤维素钠微胶囊进行扫描电镜观察和比表面积及孔径分析测定，结果见图1-图6。

图1-图2说明，本发明制备的微胶囊与海藻酸钠-壳聚糖材料所制备的微胶囊相比，本发明内部构造在扫描电镜下观察到了多层膜的特殊结构，这一结构可以实现将酶限制在微胶囊内，同时大量的小孔保证了有机污染物降解产物的有效转移。

吸附-脱附等温线是计算比表面积和孔径分布最基本的数据，对于多孔材料，在吸附等温线上会出现滞后现象，及脱附时与吸附的等温线并不重合，形成一个滞后圈。吸附等温线和滞后圈的形状可以反映多孔材料的孔结构。图3上出现了一个闭合的滞后环，此等温线属IUPAC[Sing K S W,Everett D H,Haul R A W,et al.Reporting physisorption data for gas/solid systems with with Special Reference to theDetermination of Surface Area and Porosity［J］.International Union of Pure and AppliedChemistry,1985,57(4):603-619．]分类中的IV型，H4滞后环。从图中可看出，在低压段吸附量平缓增加，此时N₂分子以单层到多层吸附在介孔的内表面，并得出样品的比表面积为76.471m²·g^-1可以使有机污染物与酶有更大的接触机会，即保证酶能够高效降解有机污染物。

另外通过比表面积分析仪对微胶囊内部孔径进行测定，得出其内部的孔径大部分集中在7-25nm之间如图4所示，证实了本发明所制备的微胶囊能够保证一定大小的酶的固定。

由图5中出现的一个没有闭合的滞后环，说明毛细孔形状和大小变化范围很大，即此类型微胶囊的孔径不均匀，从图6中看到大部分孔分布在120-130nm之间，此外，样品在15nm和50nm附近也分布着大量的孔。

试验例2本发明制备的微胶囊对阿特拉津的降解效果

取10ml离心管若干支，每管中放置5ml含20mg·L^-1阿特拉津的0.05mol·L^-1的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，按1%（v/v)的投加量量加入游离阿特拉津降解酶（含可溶性蛋白135μg）。另取与上述投加至离心管中相同体积的游离酶，按本发明所述的方法将游离酶进行微胶囊化处理，并将制备好的酶分别投加至0.05mol·L^-1的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中(阿特拉津初始浓度同前)。同时以不投加任何形式降解酶的模拟污染溶液为空白对照处理。上述各处理设置3个平行。反应2h后，用20μL1.0mol·L^-1HCl溶液终止酶反应，用气相色谱仪测定溶液中阿特拉津的残留量，计算其降解率。

1低温条件下，阿特拉津的降解效果

将上述离心管置于4℃冰箱中，测定不同形态阿特拉津降解酶对阿特拉津的降解率，研究极端温度对固定化酶降解阿特拉津效果的的影响。试验结果见表3，结果显示：在4℃，28d时，固定化酶处理组，阿特拉津的残留率均在50%以下，与游离状态下酶的对照组中85%以上的残留率相比，得出固定化酶较游离酶在4℃温度下可以实现对阿特拉津的降解，尤其在东北阿特拉津污染严重的黑土区，可以实现阿特拉津污染土壤的修复。

表3低温4℃条件下不同形态阿特拉津降解酶对溶液中阿特拉津降解量的影响

2固定化酶重复使用稳定性

将固定化酶加入底物中进行反应，反应后分离出反应液，在保证固定化酶完整的前提下重复将固定化酶进行上述反应，并分别测定阿特拉津降解率。试验结果见表4，结果显示：微胶囊固定化阿特拉津降解酶在经过5次重复使用后，对阿特拉津降解率依然维持在45%以上，固定化酶技术的出现一方面保留了酶本身作为一种生物催化剂所具有的高度专一性、催化条件温和、无污染等催化作用，将有效克服游离酶不能重复使用的劣势。

3酶贮存稳定性

将固定化酶在14°C下分别密封保存于多个离心管中，分别于第0,7,14,21,28d取出1个离心管降解浓度为含20mg·L^-1阿特拉津的0.05mol·L^-1的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，并测定阿特拉津降解率。试验结果见表5，结果显示：游离阿特拉津降解酶对阿特拉津的降解率在第7d时仅维持在50%的水平，微胶囊固定化阿特拉津降解酶对阿特拉津的降解率在第28d时依然维持在45%以上，即此微胶囊固定化阿特拉津降解酶有较高的贮存稳定性。

表5游离酶和微胶囊固定化阿特拉津降解酶贮存稳定性

试验例3通过土壤试验测定阿特拉津的降解率

土壤试验：将物质的量浓度为135mg·L^-1的游离态降解酶溶液按1%(v/w)和5%(v/w)的量投加入向300g预先配制好的模拟阿特拉津污染土壤(阿特拉津的初始浓度为20mg·kg^-1中。另取实施例1制备的微胶囊按1%(w/w)和5%(w/w)的量投加至300g模拟污染土壤中(阿特拉津初始浓度同前)。同时以不投加任何形式降解酶的模拟污染土壤为空白对照处理。上述各处理设置3个平行，所有样品置于30℃的恒温培养箱中，利用称重法保持各处理土壤含水率供试土壤最大持水量的60%。在修复开始的第7，14，21和28d取样测定各处理土壤样品中阿特拉津的剩余浓度，分别计算两种形态降解酶对土壤中阿特拉津的去除率，结果见表6。

表6不同形态酶处理对阿特拉津残留量的影响

本发明制备的微胶囊对阿特拉津的降解效果见图6，结果显示：空白对照中30d内阿特拉津然降解的过程是十分缓慢的，土壤中阿特拉津的残留量相对较大，对阿特拉津的降解率还不到20%；而在游离酶存在的环境中，阿特拉津的降解率也只有35%左右，但在利用微胶囊化阿特拉津降解酶进行生物修复的污染土壤中，阿特拉津的残留量会随着取样时间的增加逐渐递减，在第28d时土壤中阿特拉津的残留量不到30%，降解率高达70%。

Claims (4)

1.一种用于固定化酶修复有机污染土壤的微胶囊，由以下按重量份计的组分制备而成：

壳聚糖3-5份、海藻酸钠2-8份、羧甲基纤维素钠2-8份、CoCl₂·6H₂O0.2-0.6份。

2.根据权利要求1所述的微胶囊，其特征在于，由以下按重量份计的组分制备而成：

壳聚糖4份、海藻酸钠6份、羧甲基纤维素钠6份、CoCl₂·6H₂O0.2-0.4份。

3.制备权利要求1或2所述的微胶囊的方法，包括以下步骤：

（1）溶液的配制

壳聚糖溶液：将壳聚糖和乙酸按质量体积比为1：1的比例溶于蒸馏水中，静置4h，然后用1mol·L^-1NaOH调节pH至5.5，最终配制成质量分数为0.5%的壳聚糖溶液；

羧甲基纤维素钠和海藻酸钠混合溶液：取羧甲基纤维素钠，溶于蒸馏水中，静置12h后，加入等同质量的海藻酸钠，加入蒸馏水搅拌均匀，在高压锅内121℃灭菌20min，羧甲基纤维素钠与海藻酸钠的质量浓度均为1%；

CoCl₂溶液：将CoCl₂·6H₂O溶于蒸馏水中，制备CoCl₂物质的量浓度为0.05mol·L^-1。

（2）微胶囊的制备

①将上述羧甲基纤维素钠和海藻酸钠混合溶液冷却至室温，按1-15mg·L^-1的最终浓度加入酶液；

②用灭菌后的注射器吸入羧甲基纤维素钠和海藻酸钠酶溶液，将其均匀涂布在45-50目的筛片表面；

③将步骤②中筛片表面的羧甲基纤维素钠和海藻酸钠酶溶液鼓入到步骤（1）制备的壳聚糖乙酸溶液中，静置30min形成微胶囊酶；

④转移步骤③制备的微胶囊酶到CoCl₂溶液中，常温固化30min后，经纱布过滤获得微胶囊，滤过的CoCl₂溶液可以重复使用；

⑤用去离子水洗去表面的金属钴离子溶液，然后抽滤得到硬化的微胶囊酶凝胶体。

4.权利要求1或2所述的微胶囊在修复有机污染土壤中的应用。

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