CN105861365A - 一株假单胞菌ld23及其固定化微球的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD23，其菌种保藏号是CGMCC No.11679。本发明还涉及了上述菌在石油降解中的应用以及含有上述菌的海藻酸钠‑活性炭固定化微球的制备。本发明的假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD23是从石油污染较为严重的土壤中分离筛选出来的菌株，能够在低温条件下保持较高的石油降解率，为将来治理石油污染土壤奠定了基础；同时对生物碳固化条件进行优化，初步考察了固定化石油降解菌对原油的降解效果，为利用生物碳固定化微球修复石油土壤提供科学依据。

Description

一株假单胞菌LD23及其固定化微球的制备

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株假单胞菌LD23及其固定化微球的制备。

背景技术

随着全球工业进入快速发展的时期，对石油及其产品的需求量日益增大。由于大量的开采和使用以及一些地下输油管线的爆裂和地下储油罐泄漏事故的发生，使大量的石油及其加工产品进入土壤，给生物和人类带来了危害。石油进入土壤会影响土壤通透性，减少土壤肥力，阻碍植物生长，而且石油烃中不易被土壤吸附的污染物成分可以随地面降水渗透到地下水，直接影响饮用水的水质；石油中所含的多环芳烃具有致癌、致畸、致突变的“三致”性，可通过食物链在动、植物体内逐级富集，威胁到粮食质量和人类健康。

目前，生物修复技术是治理石油污染土壤应用最广泛的方法。生物修复技术是通过利用微生物的生长代谢达到对污染物彻底矿化的效果，无二次污染产生，在近年来的一些溢油事故中取得良好的应用效果。然而，游离态的微生物用于含油废物处理尚存在一定缺陷，如单位体积内优势菌浓度低、启动慢、菌体易流失、抗毒性侵害能力差、对环境条件变化敏感等。因此，需要一种使微生物固定的方法。固定化微生物技术是用化学或者物理的手段和方法将游离微生物限制或定位在某一特定空间范围内，保留其固有的催化活性，使其能够成为重复和连续使用的生物技术。关于石油降解菌的固定化技术已有报道，如刘虹等人以泥岩为载体对石油微生物固定化条件进行了研究，何丽媛等人分别以稻草秸秆，玉米秸秆和蒙脱石为载体进行的石油微生物固化载体优化的研究。生物碳的多孔隙结构使具有较好吸附石油污染物的能力，并且其拥有机械强度大，对微生物无毒性，不易被微生物分解，耐酸碱，成本低，寿命长等特性而成为微生物固定化的良好载体。但目前对以生物碳为载体固定石油降解菌的研究尚少。并且温度是影响生物修复石油污染物的降解率的重要因素之一。我国大部分的油田开采区10月至次年2、3月平均气温均在15℃以下，冬季冰期较长，微生物修复石油污染物效率较低，因此筛选耐低温石油降解微生物逐渐成为研究热点。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株假单胞菌LD23，能够在低温条件下对石油进行降解。

本发明的第二目的的提供上述假单胞菌LD23的用途。

本发明的第三目的是提供含有上述假单胞菌LD23的海藻酸钠-活性炭固定化微球。

本发明的第四目的是提供上述的海藻酸钠-活性炭固定化微球的制备方法，对生物碳固化条件进行优化。

本发明的第五目的是提供上述的海藻酸钠-活性炭固定化微球的用途。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD23，其菌种保藏号是CGMCC No.11679。

二、上述的假单胞菌LD23在石油降解中的应用。

三、一种海藻酸钠-活性炭固定化微球，含有上述的假单胞菌LD23。

四、一种上述的海藻酸钠-活性炭固定化微球的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)配制质量百分比浓度为5％的海藻酸钠溶液；

(2)添加活性炭至活性炭的质量百分比浓度为7％，121℃灭菌25min；

(3)待温度降至室温后，加入处于生长对数期的假单胞菌LD23的菌液，使得假单胞菌LD23的最终质量百分比浓度为25％；

(4)用无菌注射器挤入质量百分比浓度为5％的CaCl₂溶液中成形，4℃交联36h，用生理盐水或无菌水冲洗3遍，4℃保存。

五、上述的海藻酸钠-活性炭固定化微球在石油降解中的应用。

采用上述技术方案的积极效果：本发明的假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD23是从石油污染较为严重的土壤中分离筛选出来的菌株，能够在低温条件下保持较高的石油降解率，为将来治理石油污染土壤奠定了基础；同时对生物碳固化条件进行优化，初步考察了固定化石油降解菌对原油的降解效果，为利用生物碳固定化微球修复石油土壤提供科学依据。

附图说明

图1是石油降解菌的生长曲线；

图2是石油降解菌血平板的溶血圈直径；

图3是紫外分光光度法测定不同菌株对石油的降解率；

图4是不同固定化条件对石油降解率的影响；

图5是固定化微球的示意图。

本发明所涉及的假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD23，于2015年11月17日在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏，保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.11679。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明菌株筛选。

随机采取大庆具有代表性的石油污染样地土壤进行混匀过筛，称取混合土样于无机盐液蜡培养基中进行富集培养；吸取该菌液接于LB固体培养基进行梯度稀释涂布，于15℃恒温培养箱中培养3-5d。挑取长势良好的单菌落进行菌株纯化，共筛选到低温细菌13株。

1菌体生长曲线的测定

选取长势较好、具有代表性的四株低温菌(LD23、DDX82、DD4与DD6)，以10％的接菌量接于LB液体培养基中，在15℃下培养，每隔12h分别取接菌和不接菌的培养基测定其OD₆₀₀值，绘制生长曲线。如图1所示，所筛选出的石油降解菌株在36h～48h之间菌体数量相对较高，菌株具有较好的活性，故选择培养时间在36h～48h内的石油降解菌株进行后续实验。

2血平板法测表面活性剂

参照方法(丁立孝等，2004)将所纯化的菌株接种于血平板之上(2个平行处理)，分别在菌株对应的培养温度下培养一定时间，观察并记录在血平板上出现溶血圈直径。如图2所示，在石油降解菌中，低温菌株LD23的血平板产生的溶血圈为19.47mm，相比于其他低温菌株具有显著性差异(*P＜0.05)。

3紫外分光光度法测石油降解率

将纯化的菌株以10％的菌量制作菌悬液并接于100mL石油发酵培养基中(每株菌接3瓶平行样)，以不接菌液的为对照，15℃在摇床中160r/min培养7d；将培养液和10mL石油醚一并倒入分液漏斗中，加盖充分振摇并注意放气，静置分层；将培养基层反复萃取2次，萃取液用放有无水硫酸钠的漏斗过滤并收集于50mL的容量瓶中，用石油醚定容至刻度，稀释后用紫外分光光度计在350nm处测定吸光度。

降解率计算公式：降解率(％)＝(A-B)/A×100％

式中：A为对照上清液的吸光度，B为样品上清液的吸光度

如图3所示，低温菌株LD23和DDX82具有较好的降解能力，其降解率分别为60.69％和53.37％。张娜等筛选出的产表面活性剂的石油降解菌株降解石油达30.04％。章慧等筛选出的可高效产表面活性剂的石油降解菌株对石油的降解率为54.70％。本实验中得到的LD23石油降解率均高于上述研究中的实验成果。

观察本实验中的培养液，可以明显的看出，降解率高的菌株其培养液上石油以分散状态存在，降解能力较强的LD23、DDX82和DD6其培养液中石油乳化现象明显，在培养液表面不形成油膜，培养液较为混浊。而未接菌的培养液表面具有由石油形成的一层质地均匀的油膜，且培养液清澈透明。出现这种现象是由于微生物降解石油的活动主要在油-水界面进行。研究指出表面活性剂能增大石油烃类物质在水相中的溶解度，降低表面张力，促进微生物的吸收，有利于石油的降解。一般来说，产表明活性剂较多的菌株其降解能力往往较强。因此本实验中产溶血圈较大的石油降解菌株LD23其降解率相对于其它菌株高，降解效果较明显。

4分子生物学鉴定及序列分析

PCR引物对序列:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR反应体系:超纯水16μL、10×Buffer 2.5μL，Mg Cl₂ 1.5μL，d NTP(2.5mmol·L^-1)0.7μL，上、下游引物(25pmol.μL^-1)各0.5μL，DNA模板2.3μL，TaqDNA Polymerase 1μL。

PCR程序:94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃再延伸12min，4℃保存。

PCR产物经电泳，回收，纯化，再与T载体连接，转化后的阳性菌提取质粒进行酶切鉴定，送深圳华大基因科技服务有限公司完成。

降解率较高的低温石油降解菌LD23、DDX82以及DD6经分子生物学鉴定，3株菌株分别为LD23为假单胞菌P8(Pseudomonas sp.P8)，DDX82为蒙氏假单胞菌(pseudomonas monteilii)，DD6为假单胞菌SJH-007(Pseudomonas sp.SJH-007)。

5菌浓-吸光度曲线

取生长对数期的菌，12000r/min离心10min，无菌水冲洗两次，离心10min。将得到的菌体用无菌水配制成不同吸光度梯度的菌液，在600nm处测定各自吸光度值(用OD₆₀₀表示)，然后用各自的菌浓(10⁶cell/mL)为纵坐标，以吸光度为横坐标，得到各自的菌浓-吸光度标准曲线：C＝3.6515OD₆₀₀-2.5419(R²＝0.9968) (1)

实施例2

本实施例说明海藻酸钠-活性炭固定化微球的制备。

配制一定浓度的海藻酸钠(SA)溶液45mL，添加适量活性炭，混匀，121℃灭菌25min，当温度降至室温时，加入5mL处于生长对数期的种子菌液并混匀，用无菌注射器挤入5％浓度的CaCl₂溶液中成形，在4℃冰箱中交联一定时间，用生理盐水或无菌水冲洗3遍，4℃冰箱中保存，用来测定物理性能和石油的降解率(各因素正交试验比例见表1)。将制备好的固定化微球以10％的量加入到石油发酵培养基中，在15℃摇床中160r/min培养7d后用紫外分光光度法测降解率，其方法同上。

通过测定LD23石油降解菌在不同的固化条件下的降解率，得出本株菌的最佳固定化条件。由图4-A所示，以不同的SA浓度为变量制作微球，其中SA浓度为5％时微球大小规则，没有拖尾现象，硬度适宜，微球的降解率最高为60.8％，与浓度为3％和4％的微球相比，降解率显著性差异(*P>0.05)。SA浓度低于5％时制备的微球降解率较低，由于SA浓度较低，机械强度较小，不足以抵抗外界的破坏，使菌体受到伤害。本文中SA浓度为5％的微球降解率较高，与黄达明，包蔚等人的结论不一致。其原因可能是实验菌株不同，本实验的菌株取自较为致密的土壤，固定化菌株时SA的浓度越大，微球内部空隙越小，该生存环境与其原生环境相拟合，菌株可能已适应于较为致密的环境，以至出现SA浓度偏高时降解率反而上升的现象。

如图4-B和4-C所示，分别以活性炭浓度为7％和接菌量为25％制备的微球降解效果最好，降解率分别为73.8％和60.0％，而分别以的5％接菌量和10％的活性炭浓度制作备的微球降解效果不理想，其原因可能是菌液和活性炭相对比例较小，菌浓度较低，活性炭内部空隙没完全填满，较高浓度的石油对降解菌产生毒害作用，导致降解率降低。当活性炭浓度较低时，接菌量与活性炭之间的比例变大，菌体较多无处吸附，抑制菌体生长，同样影响了降解效果。在固定化微球中，确定接菌量和活性炭含量之间的相对比例对降解率有着较为关键的作用。

交联时间是指细菌-海藻酸钠混合液滴入交联剂CaCl₂溶液后的反应时间。由图4-D可知，当交联时间为36h时制作出的微球对石油的降解能力较强，降解率为56.9％。交联时间为12h～24h之间时，固定化微球的降解率为54.0％和45.2％，由于微球内部骨架逐渐成形，凝胶微球的机械强度逐渐增加，微球没有形成稳定的结构，因此其降解率较低。代鹏飞和雷生姣等人研究表明随着交联时间的增加，载体的传导性会降低，长时间低温下的交联反应也会降低固定化微生物的活性，但是本实验得到的结论与此不同，原因是本实验所用的菌株为低温菌，即使长时间在较低的温度下也会保持较高的活性。因此本实验的最佳交联时间为36h。

石油降解菌的生长都有最适的pH值，由图4-E可知，在pH值为9.0时，微球对石油的降解率最高为56.4％，且具有显著性差异(*P>0.05)。当pH值为7.0时，固定化微球在中性条件下，不会影响微生物对石油的降解能力，其降解率为47.0％。pH值升高时，过高的pH值抑制了菌体生长和降解酶的分泌，使降解率下降，但是本实验中pH值为9.0时石油的降解率达到最大值，此结果与关晓燕和张秀霞等人研究的结果有所不同，原因是本实验菌种采集地多为碱性土壤，pH值大于8.0，菌种较适应碱性环境。因此微球处于pH值为9.0时，微生物活性最强，降解率最高。

制备好的固定化微球如图5所示，对固定化微球相关性能的测定：

1弹性系数

选取3颗形态完好、粒径相同的固定化微球，呈品字形置于载玻片上并放上盖玻片，测量此时载玻片与盖玻片之间的高度H_l，往盖玻片上加50g砝码，计时60s，测量被压缩后载玻片与盖玻片之间的高度H₂，根据公式计算固定化微球的弹性系数：弹性系数＝砝码质量×g/3(H₁-H₂)；其中g为重力常数，取9.8N/kg。

2机械强度

将制备好的固定化微球各取出数颗，用滤纸吸干，放在电子天平上调零，用平板缓慢压小球，以小球破碎时电子天平示数作为小球机械强度的指标(测3组取平均值)。

由表1可以看出，不同浓度的SA处理的微球机械强度随其浓度的增加而呈增大的趋势，由序号1-3实验结果得出SA为5％时机械强度最大为(1.78±0.03)N，而弹性系数为(100.62±0.72)N/m。可能是由于溶液粘性与适当的海藻酸钠浓度成正比，在适当的海藻酸钠浓度范围内有利于微球成形，在较低的海藻酸钠浓度下，不利于微球规则成形^[16]；由序号4-6实验结果得出，不同浓度活性炭处理的微球，其弹性系数随活性炭浓度的增加而呈先减小后增大的趋势，最大弹性系数为(104.26±1.02)N/m，机械强度为(1.78±0.03)N，可能由于在微球中加入适量的活性炭会增大载体的传质效率，并加速石油和溶解氧在微球表面的吸附平衡，更利于菌种保持活性^[24]。由序号7-9实验结果得出，菌浓度25％时微球的机械强度最大为(1.78±0.03)N，可能是加入微球的微生物细胞的生长和繁殖在一定程度上改善了微球的内部结构^[17]。交联时间36h时微球的机械强度最大为(1.78±0.02)N，这可能与菌体的生长繁殖有关，当菌体到达最佳生长时期时，细菌生长与繁殖导致微球的内部结构发生变化^[24]。

表1 4个固定化因素的正交试验水平及结果

Tab.1 Orthogonal experimental level and results of four immobilization factors

3破碎率

将空白微球放入装有100mL无菌水的锥形瓶中(加菌微球放入已灭菌的发酵培养基中)置于15℃、160r/min恒温摇床中震荡，48h后开始记录破碎颗数，此后每隔24h记录一次，计算7d时间微球的破碎率。

由表2可知，在整个固定化实验过程中，未发现空白微球和经过不同的固定化条件处理的微球的破碎，只有在溶液pH9.0时，经过处理的加菌微球发生破碎。微球在1d时无破碎现象，但在2d时开始破碎，破碎率为42％，而4d时全部破碎；微球在破碎后完全成粉末状或微小的颗粒状，无连在一起的片状或块状状态。这说明制备的微球的机械强度不够大，细菌的生长与繁殖导致微球的内部结构发生了变化，从而使其破碎，菌泄漏出来。

表2 不同pH下微球破碎率的测定

Tab.2 The determination of microspheres breakage rate under different pH

4活性炭吸附量测定

将菌液离心，制备成相同浓度的菌液，一份以无菌水为空白对照测定OD₆₀₀，根据公式(1)，得出菌浓c₁；另一份加入3g活性炭，于15℃摇床中动态吸附6h后取菌液过滤测定OD₆₀₀，得出菌浓c₂，忽略吸附前后菌液体积的变化，计算单位质量的活性炭对菌的表面吸附量Γ(cell/g)。

计算公式为：Γ＝V×(c₁-c₂)/m (2)

式(2)中：m为吸附剂的质量(g)；V为菌液的体积(mL)；c₁、c₂为吸附前后的菌浓度(cell/mL)。

由实验可知，活性炭对菌的吸附饱和时间约为6h，所以选用6h为活性炭对菌的最大吸附量时间并用其测定活性炭对菌的吸附量。根据实验方法1.6测得活性炭对菌吸附前后的OD₆₀₀，由表3可见活性炭对菌的最大吸附量为4.618×10⁷cell/g。

表3 活性炭最大吸附量的测定

Tab.3 The determination of the maximum adsorption capacity of carbon

本发明的假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD23是从石油污染较为严重的土壤中分离筛选出来的菌株，能够在低温条件下保持较高的石油降解率，为将来治理石油污染土壤奠定了基础；同时对生物碳固化条件进行优化，初步考察了固定化石油降解菌对原油的降解效果，为利用生物碳固定化微球修复石油土壤提供科学依据。

Claims (5)

1.一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD23，其菌种保藏号是CGMCC No.11679。

2.权利要求1所述的假单胞菌LD23在石油降解中的应用。

3.一种海藻酸钠-活性炭固定化微球，其特征在于：含有权利要求1所述的假单胞菌LD23。

4.一种权利要求3所述的海藻酸钠-活性炭固定化微球的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)配制质量百分比浓度为5％的海藻酸钠溶液；

(2)添加活性炭至质量百分比浓度为7％，121℃灭菌25min；

(3)待温度降至室温后，加入处于生长对数期的假单胞菌LD23的菌液，使得假单胞菌LD23的最终质量百分比浓度为25％；

(4)用无菌注射器挤入质量百分比浓度为5％的CaCl₂溶液中成形，4℃交联36h，用生理盐水或无菌水冲洗3遍，4℃保存。

5.权利要求3所述的海藻酸钠-活性炭固定化微球在石油降解中的应用。