CN113717904A - 一种页岩石油污染降解用的复合菌、菌剂、其制备方法和应用 - Google Patents

一种页岩石油污染降解用的复合菌、菌剂、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于石油降解微生物技术领域，具体涉及一种页岩石油污染降解用的复合菌、菌剂、其制备方法和应用。所述复合菌是由假单胞菌和黄孢原毛平革菌组成，所述假单胞菌为假单胞菌LD23，其菌种保藏号是CGMCC No.11679，所述黄孢原毛平革菌的菌种保藏号是CICC 40719。由所述复合菌制备而成的复合菌剂具有高效的石油降解能力，且通过二者的协同作用，将最适温度降低至18℃，在该温度下降解率高达86.84％。

Description

一种页岩石油污染降解用的复合菌、菌剂、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于石油降解微生物技术领域，具体涉及一种页岩石油污染降解用的复合菌、菌剂、其制备方法和应用。
背景技术
页岩石油是指以页岩为主的页岩层系中所含的石油资源。其中包括泥页岩孔隙和裂缝中的石油，也包括泥页岩层系中的致密碳酸岩或碎屑岩邻层和夹层中的石油资源。在页岩石油开采过程中，一旦发生泄露，则会污染土壤和水体，严重危害动植物以及人体健康，因此，对石油污染土壤的治理势在必行。
微生物治理技术以其环境友好和费用低的优势，引起了相关领域的极大关注。掌握更多高效石油降解菌是取得理想修复的关键，前期的研究，申请人发现了一株具有石油降解功能的假单胞菌，详见专利201610243117.1，一株假单胞菌LD23及其固定化微球的制备，该菌株虽然具有较优的降解效果，但由于石油组分较复杂，单一微生物的降解效果有限，如何通过石油降解微生物的选择和协同作用进一步提高降解效果，是本发明要解决的技术问题。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的第一个方面是，提供一种页岩石油污染降解用的复合菌，是由假单胞菌和黄孢原毛平革菌组成，所述假单胞菌为假单胞菌LD23，其菌种保藏号是CGMCC No.11679，所述黄孢原毛平革菌的菌种保藏号是CICC 40719。
本发明的第二个方面是，提供由所述复合菌制备的复合菌剂。
本发明的第三个方面是，提供制备所述复合菌剂的方法，包括以下步骤：
S1、将所述假单胞菌LD23接种到LB培养基中，在15-20℃下培养3-4d；
S2、将所述黄孢原毛平革菌接种到PDA培养基中，在28-30℃培养2-3d；
S3、培养结束后，在5-6℃下离心收集菌体，菌体洗涤后混合，用蒸馏水调节浓度，使假单胞菌LD23的质量百分比浓度在10-15％，黄孢原毛平革菌的质量百分浓度在7-8％，得到所述复合菌剂。
进一步的，所述LB培养基由以下组分制成：
氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，pH7.0。
进一步的，马铃薯200g，葡萄糖20-25g，琼脂15-18g，磷酸二氢钾2-4g，七水合硫酸镁1-2g，蒸馏水定容至1L，pH6.8-7.2。
本发明的第四个方面是，提供所述复合菌剂在降解石油中的应用。
本发明的第五个方面是，提供所述复合菌剂在原位修复页岩石油污染土壤中的应用。
本发明的第六个方面是，提供利用所述复合菌剂修复页岩石油污染土壤中的方法，将所述复合菌剂与污染土壤混合，且复合菌剂占污染土壤质量的3％-5％。
进一步的，降解过程中，保持污染土壤湿度为16-20％，温度16-22℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种页岩石油污染降解用的复合菌或菌剂，用于高效降解石油，该复合菌含有两种降解石油的单菌，由一种细菌和一种真菌组成，二者协同作用明显，与单一菌剂相比，能够在更低的温度下，具有更高的降解效率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为不同菌剂在16℃降解石油的能力比较。
图2为不同菌剂在18℃降解石油的能力比较。
图3为不同菌剂在20℃降解石油的能力比较。
图4为不同菌剂在22℃降解石油的能力比较。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
菌种来源：
假单胞菌(Pseudomonas sp.)LD23，于2015年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.11679。已在申请号201610243117.1的中国专利中公开。
黄孢原毛平革菌购买自中国工业微生物菌种保藏中心，菌种保藏号：CICC40719。
培养基：
LB培养基：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，pH7.0。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，磷酸二氢钾3g，七水合硫酸镁1.5g，蒸馏水定容至1L，pH6.8-7.2。
实施例1：复合菌剂I的制备
S1、将假单胞菌LD23接种到LB培养基中，在15℃下培养3d；
S2、将黄孢原毛平革菌接种到PDA培养基中，在28℃培养2d；
S3、培养结束后，在5℃下离心收集菌体，菌体洗涤后混合，用蒸馏水调节浓度，使假单胞菌LD23的质量百分比浓度在10％，黄孢原毛平革菌的质量百分浓度在7％，得到复合菌剂I。
实施例2：复合菌剂II的制备
S1、将假单胞菌LD23接种到LB培养基中，在18℃下培养4d；
S2、将黄孢原毛平革菌接种到PDA培养基中，在29℃培养3d；
S3、培养结束后，在6℃下离心收集菌体，菌体洗涤后混合，用蒸馏水调节浓度，使假单胞菌LD23的质量百分比浓度在13％，黄孢原毛平革菌的质量百分浓度在8％，得到复合菌剂II。
实施例3：复合菌剂III的制备
S1、将假单胞菌LD23接种到LB培养基中，在20℃下培养4d；
S2、将黄孢原毛平革菌接种到PDA培养基中，在30℃培养3d；
S3、培养结束后，在5℃下离心收集菌体，菌体洗涤后混合，用蒸馏水调节浓度，使假单胞菌LD23的质量百分比浓度在15％，黄孢原毛平革菌的质量百分浓度在8％，得到复合菌剂III。
对比例1：假单胞菌LD23单菌剂的制备
将假单胞菌LD23接种到LB培养基中，在18℃下培养4d；培养结束后，在6℃下离心收集菌体，菌体洗涤后混合，用蒸馏水调节浓度，使假单胞菌LD23的质量百分比浓度在21％，记作单剂I。
对比例2：黄孢原毛平革菌单菌剂的制备
将黄孢原毛平革菌接种到PDA培养基中，在30℃培养3d；培养结束后，在6℃下离心收集菌体，菌体洗涤后混合，用蒸馏水调节浓度，使黄孢原毛平革菌的质量百分浓度在21％，记作单剂II。
应用实施例：石油污染土壤修复实验
随机取样大庆具有代表性的石油污染土壤进行取样，混匀过2mm筛，灭菌，分成若干份，每份1kg，将实施例1-3以及对比例1-2制备的菌剂以4％的添加量添加到灭菌的石油污染土壤中，充分混匀，于16、18、20、22℃的培养箱中静置，期间添加蒸馏水，保持土壤湿度在16-20％，分别在第2、4、6、8、10、12和14d采用紫外分光光度法测定原油的降解率，利用石油醚萃取原油备用，将萃取液收集于50mL的容量瓶中，用石油醚定容至刻度，稀释50倍。用紫外分光光度计测定吸光度。
降解率计算公式：降解率(％)＝(A-B)/A×100％
式中：A为对照上清液的吸光度，B为样品上清液的吸光度。
结果如图1-4所示，本发明采用假单胞菌LD23和黄孢原毛平革菌制备的复合菌剂协同作用明显，二者配合大大提高了石油降解能力，降解率随时间和温度变化的趋势与前期研究《产表面活性剂石油降解菌的筛选及其降解率的测定》基本相符，虽然效率值在第10d才达到最大，但是通过二者的协同作用，将最适温度降低至18℃，在该温度下，复合菌剂II的降解率第10d的降解率高达86.84％，从而弥补了单一的假单胞菌LD23最适温度较高的缺点，进一步提高了其应用范围。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (9)

1.一种页岩石油污染降解用的复合菌，其特征在于，是由假单胞菌和黄孢原毛平革菌组成，所述假单胞菌为假单胞菌LD23，其菌种保藏号是CGMCC No.11679，所述黄孢原毛平革菌的菌种保藏号是CICC 40719。
2.由权利要求1所述复合菌制备的复合菌剂。
3.制备权利要求2所述复合菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将所述假单胞菌LD23接种到LB培养基中，在15-20℃下培养3-4d；
S2、将所述黄孢原毛平革菌接种到PDA培养基中，在28-30℃培养2-3d；
S3、培养结束后，在5-6℃下离心收集菌体，菌体洗涤后混合，用蒸馏水调节浓度，使假单胞菌LD23的质量百分比浓度在10-15％，黄孢原毛平革菌的质量百分浓度在7-8％，得到所述复合菌剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB培养基由以下组分制成：
氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，pH7.0。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PDA培养基由以下组分制成：
马铃薯200g，葡萄糖20-25g，琼脂15-18g，磷酸二氢钾2-4g，七水合硫酸镁1-2g，蒸馏水定容至1L，pH6.8-7.2。
6.权利要求2所述复合菌剂在降解石油中的应用。
7.权利要求2所述复合菌剂在原位修复页岩石油污染土壤中的应用。
8.利用权利要求2所述复合菌剂修复页岩石油污染土壤中的方法，其特征在于，将所述复合菌剂与污染土壤混合，且复合菌剂占污染土壤质量的3％-5％。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，降解过程中，保持污染土壤湿度为16-20％，环境温度16-22℃。
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