CN116855390A - 一株防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌swu b077r1及其应用 - Google Patents

一株防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌swu b077r1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWU B077R1及其应用。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2023年6月30日，保藏编号为CGMCC No.40719。本发明得到的菌株为棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)SWU B077R1，该菌株从浙江省嘉兴市海宁市杨渡基地枇杷根腐病病根中分离获得，试验结果表明，本发明得到的棘孢木霉菌SWU B077R1能够有效地抑制枇杷根腐病菌腐皮镰孢菌(Fusarium solani)和尖孢镰孢菌(F.oxysporum)的生长，不仅对枇杷根腐病的显症幼苗表现出良好的防治效果，还能维持枇杷植株的生长活力。

Description

一株防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWU B077R1及其应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一株防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWUB077R1及其应用。
背景技术
枇杷根腐病是枇杷产业重要病害之一，严重阻碍产业的可持续发展，影响农民的收入。该病害在各产区均有不同程度发生，云南、福建和浙江产区尤甚，重病地块病株率在25％以上。该病害症状表现为地上部分叶片变黄、枯萎，地下部分主根腐烂，侧根出现开裂和断损，最终导致落叶和植株死亡。由于根腐病是土传病害，待植株显症后已错过最佳治疗时机。
迄今关于枇杷根腐病研究工作主要围绕病原菌鉴定、田间综合防治措施、常规化学药剂筛选等方面开展，目前已筛选到化学药剂氟菌·霜霉威(银法利)对枇杷根腐病具有良好的防控效果，但由于其价格昂贵、存在环境和健康风险难以推广应用。因此，迫切需要探索一种经济有效且对环境安全友好的生物防治方法。木霉菌(Trichoderma spp.)是一类具有广泛适应性、抗菌广谱性、拮抗机制多样性的真菌，不仅能够抑制病原菌生长还能促进植物生长。在发展环境保护型农业的背景下，一些基于木霉菌及其次生代谢产物开发的菌剂或菌肥产品已成功应用于部分农作物、经济作物生产中。在枇杷上，仅有关于深绿木霉(T.atroviride)和钩状木霉(T.hamatum)能够有效抑制小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospore)生长的报道。虽然小孢拟盘多毛孢能够引起枇杷根腐病，但迄今已报道的我国枇杷根腐病主要病原菌为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)和尖孢镰孢菌(F.oxysporum)，目前尚无针对由上述两种根腐菌引起的枇杷根腐病生防技术，该技术有望成为防控枇杷根腐病的重要来源。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一株防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWU B077R1及其应用，以解决现有的枇杷根腐病防治方法效果不理想、污染环境等问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一株防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWU B077R1，其特征在于，菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2023年6月30日，保藏编号为CGMCC No.40719。
一种微生物制剂，包括上述防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWU B077R1。
上述防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWU B077R1或微生物制剂在防治枇杷根腐病中的应用。
进一步地，上述应用包括对感染根腐病的枇杷植株施用上述的棘孢木霉菌SWUB077R1或微生物制剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种防治由枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWU B077R1，可以有效地抑制枇杷根腐病菌腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌的生长，试验证明，本发明不仅对枇杷根腐病的显症幼苗表现出良好的防治效果，还明显提高了其根系活力。
附图说明
图1为棘孢木霉菌SWU B077R1的形态学鉴定结果图，其中，A为菌落形态(正面)，B为菌丝形态，C为孢子形态；
图2为棘孢木霉菌SWU B077R1基于ITS构建的贝叶斯系统发育树图；
图3为棘孢木霉菌SWU B077R1对腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌的平板对峙法抑菌活性测定结果图。
图4为棘孢木霉菌SWU B077R1对枇杷根腐病的防治效果图(接种60d后)，其中，A为空白对照(无菌水)，B为单一接种腐皮镰孢菌，C为单一接种尖孢镰孢菌，D为接种腐皮镰孢菌+棘孢木霉菌，E为接种尖孢镰孢菌+棘孢木霉菌。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：菌株的分离纯化
本研究供试材料为枇杷的根腐病病根，采自浙江省嘉兴市海宁市杨渡基地。采用组织分离法对病样进行分离，样品洗净后，使用无菌刀片将其切成5mm×5mm的小块，使用质量分数为75％酒精浸泡4min，无菌水冲洗3次，转入质量分数为10％次氯酸钠溶液中悬浮8min，然后用无菌水冲洗3次，转入PDA平板培养基中，于25℃暗培养3d。3d后使用真菌菌落边缘挑取法对存在明显生长形态差异的真菌进行纯化培养，重复纯化3次，获得纯化菌株，编号为SWU B077R1。纯化菌株于-20℃条件下，在质量分数为30％的甘油中保存备用。
实施例2：菌株鉴定
1.形态学鉴定
将实施例1纯化后的棘孢木霉菌株SWU B077R1接种至PDA培养基上，25℃培养5d，观察其形态学特征(菌落形态、分生孢子、菌丝)，结果如图1所示。
由图1可知，该菌在PDA培养基上生长速率较快(25℃日均生长速度为28mm/d)，气生菌丝紧贴平板表面呈短绒毛状；产孢簇离散分布于培养基表面，初期为白色，后期转绿，菌落形成暗绿色同心环；分生孢子梗顶端通常具有两个或多个瓶梗，近安瓿形；分生孢子球形至卵圆形，孢子大小范围为3.53-3.81×2.90-3.00μm。依据杨合同等《木霉分类与鉴定》方法，将其初步鉴定为棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)。
2.ITS序列分析
将纯化后的棘孢木霉菌株SWU B077R1接种至PDA培养基上，25℃培养5d，采用改良CTAB法对纯化菌株进行DNA提取，以DNA原液作为扩增模板，采用真菌通用引物内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)ITS1，ITS4(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCG CTTATTGATATGC)进行PCR扩增；PCR体系为:2×TaqPCR Master Mix20μL，正反引物各2μL，DNA模板1μL，加入ddH2O补齐至40μL体系；PCR扩增条件为：94℃预变性5min；95℃变性40s；56℃退火40s，72℃延伸45s，共30个循环，补充延伸72℃10min。扩增产物经质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京擎科生物有限公司重庆分公司进行测序，获得长度为585bp的基因片段，测序结果如SEQ ID No.1所示。测序序列经DNAstar软件包中的SeqMan工具拼接后，上传至NCB I(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)核酸比对网站进行Blastn比对，获得分离菌株的相关信息；使用MEGA X软件构建系统发育树，基于ITS的系统发育树如图2所示。序列比对发现，棘孢木霉菌株SWU B077R1与已报道的T.asperellumCBS 433.97(登录号：X93981)、T.asperellum G.J.S.04-217(登录号：DQ381957)序列一致性为99％。
将上述棘孢木霉菌株SWU B077R1于2023年6月30日保藏至中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.40719。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3：棘孢木霉菌株SWU B077R1的抑菌活性测定
采用平板对峙法测定棘孢木霉菌株SWU B077R1对枇杷根腐病病原菌(腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌)的离体拮抗作用。用直径5mm的打孔器分别取在PDA培养基上培养5d的棘孢木霉SWU B077R1和枇杷根腐病病原菌(腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌)菌饼，在距离病原菌菌饼30mm处放置木霉菌饼。以单一接种病原菌(腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌)为对照，设置2个处理(腐皮镰孢菌+棘孢木霉菌；尖孢镰孢菌+棘孢木霉菌)，每个处理设置3次重复，28℃恒温培养8d，每天测量菌落直径，计算其生长抑制率：抑制率(％)＝(单一接种病原菌菌落半径-对峙接种病原菌菌落半径)/单一接种病原菌菌落半径×100％。棘孢木霉菌SWU B077R1对枇杷根腐病菌的抑制率结果如下表1所示。
表1棘孢木霉菌SWU B077R1对枇杷根腐病菌的抑制率
处理方式 菌落半径(cm) 抑制率(％)
腐皮镰孢菌 6.98±0.13 —
尖孢镰孢菌 6.96±0.34 —
腐皮镰孢菌+棘孢木霉菌 3.69±0.3 47.07±4.28
尖孢镰孢菌+棘孢木霉菌 3.25±0.12 53.32±1.76
由表1可得，与单一接种病原菌处理相比，病原菌和木霉菌共培养8d时，腐皮镰孢和尖孢镰孢菌落半径分别是其对照处理的0.47和0.52倍，结果表明棘孢木霉菌株更快地占据了生长空间，显示了其竞争优势。本发明分离纯化得的棘孢木霉菌株SWU B077R1对腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌具有较强的抑制效果，生长抑制率分别为47.07％和53.32％。
实施例4：棘孢木霉菌株SWU B077R1对枇杷根腐病的防治效果
采用灌根法评价棘孢木霉菌株SWU B077R1对枇杷根腐病的防治效果。在PDA培养基上分别接种棘孢木霉菌株SWU B077R1与枇杷根腐病病原菌(腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌)，28℃黑暗培养7d，待大量产孢后，用无菌水冲洗平板刮取分生孢子，双层无菌纱布过滤收集孢子，调整孢悬液浓度为1×107cfu/mL。接种时使用灭菌刀切断枇杷幼苗部分须根后将孢悬液灌入。试验共设5个处理：(1)20mL清水对照；；(2)20mL腐皮镰孢菌；(3)20mL尖孢镰孢菌；(4)10mL腐皮镰孢菌+10mL棘孢木霉菌；(5)10mL尖孢镰孢菌+10mL棘孢木霉菌。每个处理设置3个生物学重复，接种60d后观察、统计和计算不同处理枇杷幼苗的病情指数、棘孢木霉菌的相对防效、植株生长活力。病情指数＝∑(各级发病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)×100；相对防效(％)＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100。
枇杷根腐病分级标准：0级，根系发育良好，无任何腐烂坏死；1级，根系有少量腐烂病斑，呈微棕色或根部变色，腐烂褐变面积占总面积25％以下；2级，根系腐烂褐变面积占25％-50％；3级，根系腐烂褐变面积占50％-75％；4级，根系腐烂褐变面积大于75％；5级，所有根部腐烂，植株完全死亡。
植株生长活力分级标准：4级，植物完全健康；3级，细茎短高；2级，茎部褐变，叶尖变黄；1级，茎叶枯萎；0级，表示植物完全死亡。
棘孢木霉菌对枇杷根腐病的防治效果如下表2所示。
表2棘孢木霉菌对枇杷根腐病的防治效果
处理方式 病情指数 相对防效(％) 植株生长活力
清水对照 0.00 — 4
腐皮镰孢菌 80.00 — 1
尖孢镰孢菌 73.33 — 1
腐皮镰孢菌+棘孢木霉菌 34.00 57.50 4
尖孢镰孢菌+棘孢木霉菌 40.00 45.45 3
盆栽试验结果如图4所示，结果表明，不同处理60d后枇杷幼苗生长和发病情况存在明显差异。单一接种病原菌的植株表现出茎基弯曲变细，叶尖枯萎和叶片脱绿等症状，单一接种腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌的病情指数分别为80.00和74.00。相较于单一接种病原菌，混合接种处理的植株长势健壮，叶片深绿，无萎蔫枯萎现象，处理4(腐皮镰孢菌+棘孢木霉菌)和处理5(尖孢镰孢菌+棘孢木霉菌)的防控效果分别为57.50％和45.94％。此外，在病原菌侵染的情况下，接种棘孢木霉菌还能维持枇杷植株的生长活力。本发明分离纯化的棘孢木霉菌株SWU B077R1对腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌引起的枇杷根腐病防效显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一株防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)，其特征在于，命名为SWU B077R1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2023年6月30日，保藏编号为CGMCC No.40719。
2.一种微生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWU B077R1。
3.权利要求1所述的防治枇杷根腐病的棘孢木霉菌SWU B077R1或权利要求2所述的微生物制剂在防治枇杷根腐病中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，对感染根腐病的枇杷植株施用权利要求1所述的棘孢木霉菌SWU B077R1或权利要求2所述的微生物制剂。
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