CN111979151B - 一种生防菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种生防菌株及其应用，属于农业微生物技术领域，分类命名为高地芽孢杆菌JYW26，保藏号：CGMCC NO.20442。本发明可应用于防治稻瘟病中，也可应用于提高水稻种子发芽率、促进水稻幼苗株高、鲜重中，本发明对稻瘟病菌丝的抑制率可达到56.92%，对稻瘟病的温室防效可达60%以上，同时本发明生防菌株可有效提高水稻的发芽率，促进水稻幼苗株高和鲜重，并且完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于水稻绿色生产，对人、畜安全及无环境污染，并且其制备方法简单、成本低，可以不用或减少田间其他化学农药的用量，减少化学药剂的残留。

Description

一种生防菌株及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及水稻稻瘟病的防治技术以及水稻促生长技术。
背景技术
水稻是草本稻属中的一种，全球近50%人口以此为主粮作物。由真菌病原菌Magnaporthe oryzae (M. oryzae)引起的稻瘟病（Blast Fungus）是水稻生产上的一种毁灭性病害，被列为水稻三大病害之首，每年可造成10%～20%的产量损失，危害严重的地区产量损失达到40%～50%。
目前对稻瘟病防治主要采取选育抗病品种和化学防治。由于稻瘟病是由真菌引发的水稻病害，变异与分化的速度快，多样性程度高，新的生理小种层出不穷，而常规育种方法选育周期长，而育出的抗病品种抗性单一，抗性丧失比较快，很难实现抗病品种的广谱抗性和持久抗性，使得育种行业发展举步维艰。
对于化学防治，田间试验确实取得了明显的效果。化学农药的出现使用虽然一定程度上解决了稻瘟病防治难的问题，但随着公众食品安全意识的提高，其过量使用带来了病原菌抗性增强、环境污染加重、稻米残留等新问题。化学方法防治带来了植物抗药性及食品安全问题，而传统的农业防治很难达到预期的控制效果。在这种形式下，利用有益微生物来防治该病成为一种新的防治方向。微生物种类繁多，主要包含了细菌、真菌、放线菌和部分病毒。由于细菌结构简单、繁殖快、定殖能力强等特征，因此利用微生物细菌防治植物病害越来越多得到植病学家的重视，也是最具生防潜力和应用价值的生防菌。
种子是农业生产中一个十分重要的基础资料，其自身质量的优良对农业生产产量造成严重影响。影响水稻种子发芽的主要因素包括水质、贮藏、浸种催芽等。近年来，一方面出现水稻种子发芽率不高，另一方面随着水稻病虫害的频发，水稻抗逆性越来越差，从而导致秧苗成苗率大大降低。针对这种现象，在播种水稻时，通过使用药剂对其进行浸泡、催芽，不仅可以加快种子发芽，提高水稻幼苗成活率，而且能降低水稻幼苗病虫害的发生。使用药剂浸泡催芽的方法成本比较低，但是也存在一定的缺陷，如药剂量使用不当易导致种子死亡以及现在市面上的药剂处理大多数为化学药剂，会造成农残、病原菌抗性增强等问题。利用有益微生物对种子进行预先处理，既能提高水稻发芽率，同时对水稻幼苗长度、鲜重等产生促进作用，最重要的减少水稻病虫害的发生，因此利用有益微生物细菌越来越得到推崇。
芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌，在植物病害生物防治上已发现的18个属的细菌应用潜力最大，早已在国内外进行了广泛的研究。其广泛得到关注的原因是由于芽胞杆菌易于分离和纯化，同时产生耐热、抗逆性强的芽孢，且制剂稳定、抑菌能力、施用方便、便于运输。因此，寻找一株芽孢杆菌用于解决稻瘟病难以防治的难题是新型的途径。
发明内容
为了更好地促进水稻生长、防治稻瘟病，本发明的第一目的在于提供一种生防菌株。
本发明生防菌株的分类命名为高地芽孢杆菌JYW26（Bacillus altitudinis），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2020年7月24日，保藏号：CGMCC NO. 20442。
本发明生防菌株对稻瘟病菌丝的抑制率可达到56.92%，对稻瘟病的温室防效可达60%以上，同时本发明生防菌株可有效提高水稻的发芽率，促进水稻幼苗株高和鲜重，并且完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于水稻绿色生产，对人、畜安全及无环境污染，并且其制备方法简单、成本低，使用简单。可以不用或减少田间其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少化学药剂的残留。
本发明的第二目的是提出以上生防菌株在防治稻瘟病中的应用。实验表明，该高地芽孢杆菌JYW26能显著降低稻瘟病病的发生。
具体地，将生防菌株接种到LB培养液中28℃、200 rpm振荡培养至在600 nm处的OD值为0.6时结束培养，得高地芽孢杆菌JYW26种子菌液；将高地芽孢杆菌JYW26种子菌液以1∶100的体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，继续28℃、200 rpm培养24 h，用灭菌水进行稀释制成活菌总浓度为1×10 8～1×109 CFU/mL的高地芽孢杆菌JYW26生防制剂；以高地芽孢杆菌JYW26生防制剂喷雾水稻。
本发明防治稻瘟病的方法简单、有效，仅需对水稻采用高地芽孢杆菌JYW26生防制剂进行喷雾即可达到防治稻瘟病的效果。
本发明的第三目的是提出以上生防菌株在提高水稻种子发芽率、促进水稻幼苗株高、鲜重中的应用。实验表明，该高地芽孢杆菌JYW26能有效促进水稻种子萌发，提高水稻幼苗长度、鲜重等。
具体地，将生防菌株接种到LB培养液中28℃、200 rpm振荡培养至在600 nm处的OD值为0.6时结束培养，得高地芽孢杆菌JYW26种子菌液；将高地芽孢杆菌JYW26种子菌液以1∶100的体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，继续28℃、200 rpm培养24 h，用灭菌水进行稀释制成活菌总浓度为1×10 8～1×109 CFU/mL的高地芽孢杆菌JYW26生防制剂；将水稻种子置于高地芽孢杆菌JYW26生防制剂中浸泡 1 d后，再置于清水中催芽，然后播种。
仅需以高地芽孢杆菌JYW26生防制剂作为种子的浸泡剂，经浸泡后再于清水中催芽播种即可实现其对水稻幼苗的促生效果。
具体实施方式
一、生防菌株的获得：
1、菌株分离：
高地芽孢杆菌JYW26由健康水稻叶围分离得到，具体分离方法：
剪取用自来水洗净的健康未发病的水稻叶片3g，用1％的次氯酸钠浸泡5min，70％酒精浸泡1～2 min，无菌水清洗3次，然后置于无菌100 mL三角瓶中，加入27 mL无菌水，加少许直径2 mm的玻璃珠，常温下置于200 rpm摇床振荡30 min后，分别取振荡液系列稀释（10-1、10-2、10-3和10-4四个浓度）涂0.1 mL于R2A平板，每个浓度涂6个R2A平板（R2A培养基（1L）：酵母粉0.5g，酪蛋白胨0.25g，肉蛋白胨0.25g，水解酪蛋白0.5g，葡萄糖0.5g，淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，水合硫酸镁0.024g，琼脂15g，pH = 7.2），28℃培养48 h，选取菌落数在 50～300 之间的平板，用芽签挑取所有不同菌落形态的菌株，经反复转接得到纯化菌株。将纯化后的菌株用40％甘油保存于-70℃超低温冰箱中。
2、菌种鉴定：
对分离得到的命名为JYW26的菌株进行16S rDNA基因片段序列测序。将JYW26菌株在LB培养基中28℃培养至对数期，以12000 r/min离心5 min收集菌体来提取细菌的基因组DNA。以提取的DNA产物为模板，用细菌16S rDNA基因扩增通用引物U8-27、L1494-1514扩增出16S rDNA基因片段。PCR产物送通用生物系统（安徽）有限公司进行测序。通过BLAST软件对测定16S rRNA基因序列进行同源性比较，该菌株JYW26鉴定为高地芽孢杆菌属(Bacillus altitudinis)。
表1为高地芽孢杆菌JYW26测序比对结果表。
Figure 110028DEST_PATH_IMAGE001
将鉴定后的高地芽孢杆菌JYW26（Bacillus altitudinis）于2020年7月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO. 20442。
二、制备高地芽孢杆菌JYW26生防制剂：
将高地芽孢杆菌JYW26菌株接种到LB培养液中28℃、200 rpm振荡培养，每隔2h在超净工作台中取样测其在600 nm处的OD值，当OD值为0.6时结束培养，此菌液即为高地芽孢杆菌JYW26种子菌液。
将高地芽孢杆菌JYW26种子菌液以1∶100的体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，继续28℃、200 rpm培养24h，用灭菌水进行稀释制成高地芽孢杆菌JYW26活菌总浓度为1×10 8～1×109 CFU/mL的生防制剂。
三、平板对峙培养法测定高地芽孢杆菌JYW26对稻瘟病菌的抑菌效果：
将保存于4℃中的稻瘟病斜面接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为8mm的圆形菌块。将菌丝块接种在PDA平板的中心，在其四周距中心约35mm处分别接种高地芽孢杆菌JYW26。25℃培养，待菌丝长满平板后，记录抑菌圈的半径大小（cm）。
表2显示了高地芽孢杆菌JYW26对稻瘟病的平板拮抗活性。
Figure 189979DEST_PATH_IMAGE002
结果显示，当高地芽孢杆菌JYW26与稻瘟病菌对峙培养7d 后，高地芽孢杆菌JYW26对稻瘟病菌菌丝抑制率在56.92%，说明其具有很好的防治稻瘟病的潜力。
四、离体叶片法测定高地芽孢杆菌JYW26对稻瘟病的生防效果：
选取健康南粳5055水稻叶片，剪成5 cm长叶段，放入高地芽孢杆菌JYW26生防制剂中振荡浸泡1h，阴性对照为在无菌水中浸泡1 h；在9 cm培养皿底部铺一张滤纸，再在湿润的滤纸上放置灭菌牙签，在牙签上放置以高地芽孢杆菌JYW26生防制剂或清水浸泡后的叶片，每个处理5个叶段，重复3个培养皿；然后将培养皿放在人工气候箱培养24h后用灭菌牙签轻刺叶段表面，不伤及叶段角质层，每个叶段刺伤10个点等待接种稻瘟病菌；稻瘟病孢子悬浮液制备菌液浓度为 10倍显微镜下每个视野有 20到60个孢子。用移液枪吸取10微升稻瘟病菌抱子悬浮液分别接种在刺伤的10个点上；在人工气候箱培养5d后调查接种点稻瘟病病斑数量和测量病斑面积，根据病斑扩展面积计算病情指数。离体叶片室内调査依据接种点病斑面积扩展：0：无病斑；1：褐色小病斑；3：10％病斑面积＜30％；5：30％＜病斑面积＜50％；7：50％＜病斑面积＜70％；9：70%>病斑面积。
表3为离体叶片法测定分别用高地芽孢杆菌JYW26生防制剂或清水处理后对稻瘟病的生防效果对比结果表。
Figure 215704DEST_PATH_IMAGE003
由表3可知，稻瘟病接种5d后，离体叶片法测定高地芽孢杆菌JYW26对稻瘟病的防效可达100%。而以清水处理的对照组中有93.2%发生稻瘟病，周围有明显的黄色晕圈，而采用高地芽孢杆菌JYW26生防制剂处理后并没有看到明显的病斑。由此可见，高地芽孢杆菌JYW26对稻瘟病具有明显的生防效果。
五、温室试验测定高地芽孢杆菌JYW26对稻瘟病的生防效果：
挑选健康南粳5055水稻种子，先以1%次氯酸钠水溶液消毒 10 min后，以70%酒精冲洗3次，无菌水冲洗5次，28℃人工气候箱催芽，待种子露白时播种于一次性塑料杯里，每个塑料杯里播种5粒种子。
种植 28d后，喷施高地芽孢杆菌JYW26生防制剂，使每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准，均匀喷雾，每个处理 20个重复；同时以清水喷施为对照。
5d后喷施接种稻瘟病菌孢子悬浮液，7d后调查叶瘟发生情况，计算病情指数和防治效果。清水对照喷施只接种稻瘟病菌不进行生防菌处理，病情指数参照表4。
表4为叶瘟病成株期病情指数分级标准及症状描述表。
Figure 872950DEST_PATH_IMAGE004
表5为采用不同处理喷施后对稻瘟病的温室防效结果对比表。
Figure 603009DEST_PATH_IMAGE005
由表5可知，采用高地芽孢杆菌JYW26生防制剂喷施较以清水喷施后对稻瘟病的防效达到69.08%。
六、高地芽孢杆菌JYW26对水稻的促生长作用：
从水稻种子样品中取样，品种为南粳5055，随机数取 100 粒，4次重复。
水稻种子经表面消毒后，置于高地芽孢杆菌JYW26生防制剂中浸泡 1d；同时以清水浸泡处理为对照。再分别放入清水中催芽，5d后计测发芽种子数。
发芽试验结束时（15d），测定幼苗长度及鲜重（随机取16株求平均值）。
相对发芽率(RGP)=（JYW26生防制剂浸泡发芽率/清水浸泡发芽率）×100%；
简易活力指数（SVI） SVI=G×S 。
上式中：G为发芽率，S为定时期内正常幼苗单株长度（单位：cm）或鲜重（单位：g）。
表6为以不同材料浸泡种子的发芽率、幼苗长度及鲜重对比表。
Figure 475150DEST_PATH_IMAGE006
由表6可见，以高地芽孢杆菌JYW26生防制剂处理后，相对发芽率为106.81%，水稻种子发芽率提高7%，并且水稻幼苗长度及鲜重分别能提高9.81%和24.79%。由此说明，高地芽孢杆菌JYW26能明显提高水稻种子发芽率，水稻幼苗长度及鲜重，对水稻生长具有一定的促进作用。

Claims (5)

1.一种生防菌株，其特征在于所述生防菌株为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）JYW26，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2020年7月24日，保藏号：CGMCC NO. 20442。
2.如权利要求1所述生防菌株在防治稻瘟病中的应用。
3.根据权利要求2所述生防菌株在防治稻瘟病中的应用，其特征在于：将所述生防菌株接种到LB培养液中28℃、200 rpm振荡培养至在600 nm处的OD值为0.6时结束培养，得高地芽孢杆菌JYW26种子菌液；将高地芽孢杆菌JYW26种子菌液以1∶100的体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，继续28℃、200 rpm培养24 h，用灭菌水进行稀释制成活菌总浓度为1×10 8 ～1×109 CFU/mL的高地芽孢杆菌JYW26生防制剂；以高地芽孢杆菌JYW26生防制剂喷雾水稻。
4.如权利要求1所述生防菌株在提高水稻种子发芽率、促进水稻幼苗株高、鲜重中的应用。
5.根据权利要求4所述生防菌株在提高水稻种子发芽率、促进水稻幼苗株高、鲜重中的应用，其特征在于：将所述生防菌株接种到LB培养液中28℃、200 rpm振荡培养至在600 nm处的OD值为0.6时结束培养，得高地芽孢杆菌JYW26种子菌液；将高地芽孢杆菌JYW26种子菌液以1∶100的体积比接种至LB发酵培养液中发酵培养，继续28℃、200 rpm培养24 h，用灭菌水进行稀释制成活菌总浓度为1×10 8 ～1×109 CFU/mL的高地芽孢杆菌JYW26生防制剂；将水稻种子置于高地芽孢杆菌JYW26生防制剂中浸泡 1 d后，再置于清水中催芽，然后播种。
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