CN116210725B - 桑树桑黄菌yx2提取物在防治植物病害中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体公开了桑树桑黄菌YX2提取物在防治植物病害中的应用，所述提取物具体为桑树桑黄菌YX2发酵后菌丝体的乙醇提取物，所述桑树桑黄菌YX2已于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.21078；所述桑树桑黄菌YX2提取物用于防治植物炭疽病，仅需纳克级别即可明显提高作物对植物炭疽病的抗性，安全高效、对环境友好，成本低，具有广阔的应用前景。
Description
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，具体涉及桑树桑黄菌YX2提取物在防治植物病害中的应用。
【背景技术】
植物炭疽病大多数是由炭疽菌属(Colletotrichum Corda)内的一种或几种侵染引起的一种真菌性病害。目前已报道约有200余种植物均可被炭疽病菌侵染并发病，包括农作物、果树、花卉、林木等具有重要经济价值的植物。其症状表现为：产前植物死苗、叶斑、叶枯、落果，产后果实腐烂，严重影响植物生长发育和产品质量，每年由于炭疽病侵染造成的经济损失无法估量，其中包括由炭疽病属菌引起的辣椒炭疽病，严重时可造成辣椒40％～50％以上的产量损失；烟草炭疽病，严重时可给烟草种植产业带来毁灭性打击；咖啡豆浆果炭疽病，严重时可以导致50％～80％以上的经济损失，对非洲、东南亚等地咖啡产业的发展造成威胁；柑橘炭疽病，严重时造成40％以上的损失。当前生产上，化学药剂是防治植物炭疽病的主要手段，但其容易造成严重的农作物安全和环境问题；选育抗病品种也是防治炭疽病的重要手段，其具经济有效且对人、环境友好等优点，但抗病品种培育和抗性鉴定体系不健全且需要大量人力和物力是选育抗病品种面临的困难。
桑黄是大型真菌，作为传统中药在中国已有约两千年的历史记载。目前被认为是一类真菌的统称，且物种多样，仅东亚地区称之为桑黄的真菌种类有40种之多。其属担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomy-cetes)、锈革孔菌目(Hymenochaetales)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、桑黄孔菌属(Sanghuangporus)真菌。桑黄含有各种氨基酸、多糖高分子化合物、多种酶类、多酚类、三萜类、脂肪酸类和多种微量元素等成分，现有技术中对桑黄菌的研究主要在医学领域方面，暂没有在农业方面的研究。
【发明内容】
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供桑树桑黄菌YX2提取物在防治植物病害中的应用。
为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面在于，提供所述桑树桑黄菌YX2提取物在防治植物病害中的应用。
本发明所述桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)YX2采集于泰山森林野生桑树中，且已于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.21078。
所述桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)YX2的形态为：所述菌株菌落在PDA培养基上于25℃条件下培养一周，直径为75～80mm，菌落平坦，菌丝棕黄色，平铺，绳状，边缘羊毛状。两周后菌丝变成棕褐色。生殖菌丝具简单分隔，无色至浅黄色，薄壁至稍厚壁，多分枝，频繁分隔，直径为2～3.5μm；骨架菌丝金黄色，厚壁，具宽或窄内腔，少分枝，多分隔，近规则排列，直径为3～4.5μm。
优选地，所述提取物为桑树桑黄菌YX2发酵后菌丝体的乙醇提取物。
优选地，所述桑树桑黄菌YX2提取物的制备方法，包括发酵所述桑树桑黄菌YX2制备菌丝体的步骤，及将菌丝体采用乙醇进行提取的步骤；具体过程如下：
发酵培养：将桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)YX2的菌种接到PDA培养基上，25℃培养一周，琼脂挖块接种于装有50mL PDA培养液的250mL三角烧瓶，于25℃，160-180r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10％量接种于装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，得发酵液；
乙醇提取：将发酵液离心过滤，得菌丝体，将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液，即得桑树桑黄菌YX2提取物。
优选地，提取时，乙醇的加入量为菌丝体干燥后重量的20％，且每次提取加入乙醇的量相同。
优选地，所述植物病害为植物真菌性病害，具体为植物炭疽病。
具体地，所述植物炭疽病的病原菌为毁灭炭疽病菌(Colletotrichumdestructivum)。
具体地，所述桑树桑黄菌YX2提取物在防治植物炭疽病时的施用方式为叶面喷施。
具体地，所述桑树桑黄菌YX2提取物的施用时间为5～6叶期或果实成熟期。
具体地，所述桑树桑黄菌YX2提取物的施用浓度为250～1000ng/mL。
具体地，当所述提取物应用于烟草植株防治烟草炭疽病时，在烟草植株5～6叶期，将所述桑树桑黄菌YX2提取物喷施于叶面。
具体地，当所述提取物应用于辣椒防治辣椒炭疽病时的施用方法为：在辣椒果实成熟期，将所述桑树桑黄菌YX2提取物喷施于叶面。
本发明的第二方面在于，提供一种用于上述应用的菌剂，包括桑树桑黄菌YX2提取物。
本发明的第三方面在于，提供一种组合物，所述组合物包括上述菌剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)YX2已于2020年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCCNO.21078；
本发明所述桑树桑黄菌YX2提取物仅需极少的用量即可对炭疽病有很好地防效，可以将其用于所述炭疽病菌侵染的烟草、辣椒、茄子、番茄、黄瓜、南瓜等多种作物，提高其对炭疽病的抗性；因此，本发明提供了一种新的生物源制剂，安全高效、对环境友好，且成本低，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
图1为所述桑树桑黄菌YX2的菌落形态；
图2为所述桑树桑黄菌YX2于显微镜下观察的菌丝形态(左侧放大倍数为40×0.65，右侧放大倍数为100×1.4)；
图3为所述桑树桑黄菌YX2通过ITS序列分析建立的系统发育进化树；
图4为不同处理组烟草叶片的发病情况；
图5为不同处理组辣椒的发病情况。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1菌株的分离与鉴定
1、菌株的分离：
本发明所述桑树桑黄菌YX2从泰山森林中野生桑树上分离得到；
(1)取新鲜桑黄子实体，用干净刷子刷去子实体表面的杂质，用75％乙醇进行表面消毒，然后置于无菌烧杯中备用；
(2)将已消毒的子实体在无菌超净工作台上切开，用已灭菌的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织块，接入无菌的PDA培养基表面，倒置于25℃恒温箱中培养；
(3)待长出菌丝后，取生长快的菌丝，移入另一无菌PDA平板培养皿表面培养，待长出菌丝后，取生长快、无杂菌污染的菌丝块，移入PDA平板培养基表面培养，如此反复几次分离、纯化；直至每个平板上只含有统一特征的单一菌落，最后得到一株菌，编号为YX2。
2、菌株的鉴定
(1)菌株的形态特征
将所述菌株YX2在PDA培养基上，25℃培养一周，直径75～80mm，菌落平坦，菌丝棕黄色，平铺，绳状，边缘羊毛状，两周后菌丝变成棕褐色，如图1所示；
在显微镜下可见生殖菌丝具简单分隔，无色至浅黄色，薄壁至稍厚壁，多分枝，频繁分隔，直径为2～3.5μm；骨架菌丝金黄色，厚壁，具宽或窄内腔，少分枝，多分隔，近规则排列，直径为3～4.5μm，如图2所示(左图放大倍率为40×0.65，右图放大倍率为100×1.4)。
(2)菌株的分子生物学鉴定
以ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC为引物，对所述菌株YX2进行扩增，并对扩增产物进行测序分析，具体序列见序列表；
基于blast搜索，选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对，利用Mega6.0软件通过ML算法，利用bootstrap 1000次建树结果建立进化树如图3所示；NCBI数据库对比分析，发现其与桑树桑黄菌的同源相似性达98％。
最终通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，确定该菌株为桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)。
实施例2桑树桑黄菌YX2提取物的制备
所述桑树桑黄菌YX2提取物具体为其发酵后菌丝体的乙醇提取物，具体制备过程如下：
1.发酵培养：
将实施例1分离、纯化得到的桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)YX2的菌种接到PDA培养基上，25℃培养一周，琼脂挖块接种于装有50mL PDA培养液的250mL三角烧瓶，于25℃，160-180r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10％量接种于装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，得种子液。
2.乙醇提取：
将发酵液离心过滤，得菌丝体，将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液，即得所述桑树桑黄菌YX2提取物。所述乙醇的加入量为菌丝体干燥后重量的20％；每次提取加入乙醇的量相同。
实施例3桑树桑黄菌YX2提取物在室内烟草炭疽病防效试验中的应用
1、试验方法：
以烟草(品种：三生烟)为供试植物，将其培养至5～6叶期，挑选大小相近、长势一致、无病无虫的幼苗开展试验；
活化炭疽病菌(Colletotrichum destructivum)至PDA平板上，培养7d，用5mm的打孔器在平板上打取菌块(从菌落的边缘处打一圈)，以进行病原菌的接种试验；
在接种病原菌前2小时，分别使用无菌水及浓度为62.50ng/mL、125.00ng/mL、250.00ng/mL、500.00ng/mL、1000.00ng/mL的桑树桑黄菌YX2提取物喷施烟草叶面，每个处理重复3次；
待处理两小时后将烟草底部第二片剪下，放入干净的150mm玻璃培养皿中，叶柄处用湿润纱布保湿，离体叶片用菌块接种的方法每个叶片接种3个菌块(确保菌丝贴在叶片)，盖上培养皿盖，放于人工培养室中培养，观察其发病情况，并在第5d时，采用十字交叉法测量叶片病斑直径大小(cm)，挑选防效区分最为明显的处理进行拍照，并根据病斑直径计算不同浓度的真菌提取物对烟草炭疽病的防效，计算公式如下：
防效(％)＝(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/对照组病斑直径×100％
2、试验结果
不同处理组烟草叶片的发病情况如表1和图4所示：
表1不同浓度的YX2提取物对烟草抗炭疽病的影响
| 处理编号 | 浓度/ng·mL-1 | 叶片病斑直径/cm | 防效/％ |
| CK | 0 | (1.63±0.09)a | - |
| 1 | 62.5 | (0.89±0.04)b | (45.25±3.85)c |
| 2 | 125 | (0.83±0.01)b | (48.73±2.46)c |
| 3 | 250 | (0.46±0.04)c | (71.31±4.21)b |
| 4 | 500 | (0.20±0.02)d | (88.03±1.15)a |
| 5 | 1000 | (0.30±0.04)cd | (81.49±3.27)ab |
注：表1中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。
由表1和图4可以看出，叶喷所述桑树桑黄菌YX2提取物可有效提高烟草抗炭疽病菌侵染的能力，当所述提取物的使用浓度为250～1000ng/mL时，对炭疽病的防效达到71％以上，当使用浓度为500ng/mL时，叶片病斑直径最小，防效最高，达88.03％。
实施例4桑树桑黄菌YX2提取物在室内辣椒炭疽病防效试验中的应用
1、试验过程：
以辣椒(品种：王者线椒)为供试植物，挑选大小一致且无病的果实，然后将辣椒果实表面用75％的酒精擦拭干净，无菌水清洗2～3次，晾干后分别将浓度为62.50ng/mL、125.00ng/mL、250.00ng/mL、500.00ng/mL、1000.00ng/mL的桑树桑黄菌YX2提取物喷洒在辣椒表面，待晾干后，用针刺接种法将辣椒表皮刺破，接种1mL浓度为3×105个孢子/mL的炭疽病菌(Colletotrichum destructivum)分生孢子悬浮液；以加无菌水的处理作为空白对照，每处理3个重复。
放于人工培养室中培养，观察其发病情况，并在第5天时，采用十字交叉法测量叶片病斑直径大小(cm)，并根据病斑直径计算不同浓度的真菌提取物对辣椒炭疽病的防效。
2.试验结果：
不同处理组辣椒的发病情况如表2和图5所示；
表2不同浓度的YX2提取物对辣椒抗炭疽病的影响
| 处理编号 | 浓度/ng·mL-1 | 果实病斑直径cm | 防效％ |
| CK | 0 | (5.25±0.26)a | - |
| 1 | 62.5 | (3.90±0.06)b | (25.30±4.32)d |
| 2 | 125 | (3.37±0.12)bc | (35.41±4.91)cd |
| 3 | 250 | (0.97±0.09)e | (81.52±1.67)a |
| 4 | 500 | (1.67±0.08)d | (67.99±2.51)b |
| 5 | 1000 | (2.90±0.16)c | (44.39±4.90)c |
注：表2中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。
由表2和图5可以看出，叶喷所述桑树桑黄菌YX2提取物可有效提高辣椒对炭疽病菌的抗性，当所述提取物的使用浓度为250～1000ng/mL时，对炭疽病的防效达到44％以上，当使用浓度为250ng/mL时，辣椒果实病斑直径最小，防效最高，达81.52％。
综上，本申请所述桑树桑黄菌YX2提取物可用于所述炭疽病菌能够侵染的烟草、辣椒、茄子、番茄、黄瓜、南瓜等多种作物，提高其对植物炭疽病的抗性，且所述提取物可与其他杀菌剂同时施用。
以上实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (7)
1.桑树桑黄菌YX2提取物在防治植物炭疽病中的应用，所述桑树桑黄菌YX2已于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCCNO.21078。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取物为桑树桑黄菌YX2发酵后菌丝体的乙醇提取物，其制备过程包括发酵所述桑树桑黄菌YX2制备菌丝体的步骤，及将菌丝体采用乙醇进行提取的步骤。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桑树桑黄菌YX2提取物的施用方法为叶面喷施。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述桑树桑黄菌YX2提取物的喷施时间为植株5~6叶期或果实成熟期。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述桑树桑黄菌YX2提取物的使用浓度为250~1000ng/mL。
6.一种用于权利要求1所述应用的菌剂，其特征在于，包括桑树桑黄菌YX2提取物。
7.一种组合物，其特征在于，包括权利要求6所述的菌剂。
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