CN100425693C - 一种保存体外肝细胞系统的方法 - Google Patents
一种保存体外肝细胞系统的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100425693C CN100425693C CNB2004100163433A CN200410016343A CN100425693C CN 100425693 C CN100425693 C CN 100425693C CN B2004100163433 A CNB2004100163433 A CN B2004100163433A CN 200410016343 A CN200410016343 A CN 200410016343A CN 100425693 C CN100425693 C CN 100425693C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell culture
- liquid
- dissolving
- culture fluid
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属生物技术领域，涉及生物材料保存技术，具体涉及一种体外哺乳动物肝细胞系统的保存方法。本发明体外哺乳动物肝细胞系统保存液，包括保存液A和保存液B，在常温下保存体外肝细胞系统。本发明方法易于掌握，方便存储、运输和使用，经体外药物代谢和相互作用评价试验的验证，所配制和生产的细胞保存液，降低了成本，增加了保存效果，特别是改善了受运输条件影响的细胞存活率和贴壁率，可满足日益发展的体外药物药效筛选和药物相互作用评价的需要。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及生物材料保存技术，具体涉及一种体外哺乳动物肝细胞系统的保存方法。
背景技术
在生物医药研究中，特别是体外药物代谢和相互作用研究中，常需要体外肝细胞系统的参与，体外肝细胞系统的保存效果，是影响上述研究结果的关键因素之一。体外肝细胞系统在运输过程中容易发生肝细胞死亡和贴壁肝细胞的脱落。目前常用的方法是应用UW保存液。根据中华器官移植学会主任委员夏穗生教授1994年10月在“中华器官移植杂志”上报导：UW是迄今为止最成功的器官保存液，可明显地延长器官冷冻保存时间，长达72小时之久。UW对于器官保存具划时代的贡献。然而，在细胞水平，特别对于贴壁肝细胞，以UW为主体的低温保存，常引起细胞在运输过程中的死亡和脱落。因此研制一种特异的肝细胞保存液对生物医药研究具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、有效的生物材料保存技术，具体涉及一种保存体外哺乳动物肝细胞系统的方法。本方法能提高体外肝细胞系统的存活率和贴壁率，方便存储、运输和使用。
本发明方法采用生物材料保存液在常温下保存体外肝细胞系统。
本发明所述的生物材料保存液可为体外哺乳动物肝细胞系统保存液，包括保存液A和保存液B。其中，保存液A的组分含量范围如下，
组分与浓度 含量(毫升)
谷氨酸(glutamine)200mM 500-600
亚麻酸/小牛血清白蛋白linoleic 250-300
acid/BSA
上皮促生长因子(EGF)1μg/mL 8-11
氢化可的松(Hydrocortisone)10mM 12-15
腺苷(Adenosine)50mM 8-10
硒(Selenium)10mM 1.5-2.5
别嘌呤醇(Allopurinol)10mM 8-10
霍乱毒素(Cholera toxin)1mg/ml 8-10
肝细胞生长因子(LCGF)0.5mg/ml 6-8
铁蛋白(Transferrin)25mg/ml 8-10
乙醇胺(Ethanolamine)100mM 1.5-2.5
催乳激素5mg/ml Prolactin 0.7-1
异博定(Isoptin)200μg/ml 8-10
保存液B的组分含量范围是，
组分与浓度 含量(毫升)
WEM细胞培养液Williams Emedium 780-820
胰岛素(insulin)10mg/ml 3-5
糖原(Glucagon)1mg/ml 40-50
青霉素/链霉素 40-50
(Penicillin/Streptomycin)，
(青霉素50,000单位，链霉素50mg/mL)
二性霉素(Fungizone)250μg/ml 50-75
上述组分配制如下：
1)谷氨酸glutamine 200mM：直接购自厂商(GIBCO 25030-0810)。
2)亚麻酸/小牛血清白蛋白Linoleic acid/BSA：直接购自厂商(Sigma L-9530)。
3)上皮促生长因子EGF 1μg/ml：溶解100μg(Sigma E-4127)于100mLWEM细胞培养液中。
4)氢化可的松Hydrocortisone 10mM：溶解18.13mg(Sigma H-0888)于5mL 100％的乙醇中。
5)腺苷Adenosine 50mM：溶解134mg(Sigma G9251)于100mL WEM细胞培养液中.
6)硒Selenium 10mM：溶解67mg(Sigma S-5261)于39mL无菌水中。
7)别嘌呤醇Allopurinol 10mM：溶解13.6mg(Sigma A-8003)于100mLWEM细胞培养液中。
8)霍乱毒素Cholera toxin 1 mg/ml：溶解100mg(Sigma C-3012)于100mLWEM细胞培养液中。
9)肝细胞生长因子LCGF 0.5mg/mL：溶解(Sigma G-1887)25mg于50mLWEM细胞培养液中。
10)铁蛋白Transferrin 25mg/mL：溶解(Sigma T-8158)50mg于2mL WEM细胞培养液中。
11)乙醇胺Ethanolamine 100mM：溶解0.30mL(Sigma E-0135)于50mL无菌水中。
12)催乳激素Prolactin 5mg/ml：溶解1000个国际单位(Sigma L-6520)于6.25mL WEM细胞培养液中。
13)异博定Isoptin 200μg/mL：加入(Knoll AG D6700)0.2mL于100mLWEM细胞培养液中。
14)WEM细胞培养液Williams E medium：直接购自厂商(WME，GIBCO12551-032)。
15)胰岛素insulin 10mg/mL：溶解100mg(Sigma I-5500)于10mL酸性水(pH2-3)中。
16)糖原(Glucagon)1mg/mL：溶解5mg(Sigma G-3157)于5mL酸性水(pH2-3)中。
17)青霉素/链霉素Penicillin/Streptomycin：直接购于厂商(GIBCO15140-122)。
18)二性霉素Fungizone 250μg/mL：直接购于厂商(GIBCO 15290-018)按上述组分含量范围分别配制保存液A和保存液B，
使用时，将上述保存液A和保存液B按下列配比配制：
取保存液A 20毫升，保存液B 40毫升，加入940毫升WEM细胞培养液，调节酸硷度(pH)为7.45±0.10，渗透压(Permeate pressure)调节至310±10mOsm/L。制成本发明生物材料细胞保存液。保存细胞的使用浓度为1百万贴壁肝细胞/毫升，
使用温度为15-25℃。
本发明经过体外药物代谢和相互作用评价试验的验证，结果证实，肝细胞在经过了48小时的运输后仍然保持其存活率和细胞贴壁能力。本发明方法易于掌握，配制和生产的细胞保存液，降低了成本，增加了保存效果，特别是改善、提高了受运输条件影响的细胞存活率和贴壁率，方便存储、运输和使用，可满足日益发展的体外药物药效筛选和药物相互作用评价的需要。
具体实施方式
实施例1
按各组分浓度配制后，取谷氨酸200mM500mL，亚麻酸/小牛血清白蛋白250mL，上皮促生长因子EGF 1μg/ml8mL，氢化可的松10mM 12mL，腺苷50mM8mL，硒10mM 1.5mL，别嘌呤醇10mM8mL，霍乱毒素1mg/ml8mL，肝细胞生长因子0.5mg/mL6mL，铁蛋白25mg/mL8mL，乙醇胺100mM1.5mL，催乳激素5mg/ml0.7mL，异博定200μg/mL8mL，配制保存液A；
取WEM细胞培养液780mL，胰岛素10mg/mL3mL，糖原1mg/mL40mL，青霉素/链霉素(青霉素50,000单位，链霉素50mg/mL)40mL，二性霉素250μg/mL50mL，配制保存液B；
使用时，将上述保存液A和保存液B按下列配比配制：
取保存液A 20毫升，保存液B 40毫升，加入940毫升WEM细胞培养液，调节酸硷度(pH)为7.55，渗透压调节至320mOsm/L，保存细胞的使用浓度为1百万贴壁肝细胞/毫升，使用温度为25℃。
实施例2
按各组分浓度配制后，取谷氨酸200mM600mL，亚麻酸/小牛血清白蛋白300mL，上皮促生长因子EGF 1μg/ml11mL，氢化可的松10mM 15mL，腺苷50mM10mL，硒10mM 2.5mL，别嘌呤醇10mM10mL，霍乱毒素1mg/ml10mL，肝细胞生长因子0.5mg/mL8mL，铁蛋白25mg/mL10mL，乙醇胺100mM 2.5mL，催乳激素5mg/ml1mL，异博定200μg/mL10mL，配制保存液A；
取WEM细胞培养液820mL，胰岛素10mg/mL5mL，糖原1mg/mL50mL，青霉素/链霉素(青霉素50,000单位，链霉素50mg/mL)50mL，二性霉素250μg/mL75mL，配制保存液B；
使用时，将上述保存液A和保存液B按下列配比配制：
取保存液A 20毫升，保存液B 40毫升，加入940毫升WEM细胞培养液，调节酸硷度(pH)为7.55，渗透压调节至300mOsm/L，保存细胞的使用浓度为1百万贴壁肝细胞/毫升，使用温度为15℃。
Claims (4)
1、一种保存体外肝细胞系统的方法，其特征是采用生物材料保存液在常温下保存体外肝细胞系统，所述的生物材料保存液为体外哺乳动物肝细胞系统保存液，包括保存液A和保存液B，其中保存液A的组分含量范围是，
组分与浓度 含量：毫升
谷氨酸200mM 500-600
亚麻酸/小牛血清白蛋白 250-300
上皮促生长因子1μg/mL 8-11
氢化可的松10mM 12-15
腺苷50mM 8-10
硒10mM 1.5-2.5
别嘌呤醇10mM 8-10
霍乱毒素1mg/ml 8-10
肝细胞生长因子0.5mg/ml 6-8
铁蛋白25mg/ml 8-10
乙醇胺100mM 1.5-2.5
催乳激素5mg/ml 0.7-1
异博定200μg/ml 8-10
保存液B的组分含量范围是，
WEM细胞培养液 780-820
胰岛素10mg/ml 3-5
糖原1mg/ml 40-50
青霉素/链霉素 40-50
二性霉素250μg/ml 50-75
所述生物材料保存液按下述配比配制：
取保存液A 20毫升，保存液B 40毫升，加入940毫升WEM细胞培养液，调节pH为7.45±0.10，渗透压为310±10mOsm/L，其中，所述的亚麻酸/小牛血清白蛋白选自Sigma L-9530，WEM细胞培养液选自GIBCO 12551-032，青霉素/链霉素为青霉素50,000单位/链霉素50mg/mL。
2、按权利要求1所述的保存体外肝细胞系统的方法，其特征是所述组分如下配制，
上皮促生长因子1μg/mL：溶解100μg于100mLWEM细胞培养液中；
氢化可的松10mM：溶解18.13mg于5mL 100％的乙醇中；
腺苷50mM：溶解134mg于100mL WEM细胞培养液中；
硒10mM：溶解67mg于39mL无菌水中，其中硒选自Sigma S-5261；
别嘌呤醇10mM：溶解13.6mg于100mLWEM细胞培养液中；
霍乱毒素1mg/ml：溶解100mg于100mLWEM细胞培养液中；
肝细胞生长因子0.5mg/mL：溶解25mg于50mLWEM细胞培养液中；
铁蛋白25mg/mL：溶解50mg于2mLWEM细胞培养液中；
乙醇胺100mM：溶解0.30mL于50mL无菌水中；
催乳激素5mg/ml：溶解1000个国际单位于6.25mL WEM细胞培养液中；
异博定200μg/mL：加入0.2mL于100mL WEM细胞培养液中；
胰岛素10mg/mL：溶解100mg于10mL酸性水中；
糖原1mg/mL：溶解5mg于5mL酸性水中。
3、按权利要求1所述的保存体外肝细胞系统的方法，其特征是所述细胞的使用浓度为1百万贴壁肝细胞/毫升，使用温度为15-25℃。
4、按权利要求2所述的保存体外肝细胞系统的方法，其特征是所述酸性水为pH2-3。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100163433A CN100425693C (zh) | 2004-02-16 | 2004-02-16 | 一种保存体外肝细胞系统的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2004100163433A CN100425693C (zh) | 2004-02-16 | 2004-02-16 | 一种保存体外肝细胞系统的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1657609A CN1657609A (zh) | 2005-08-24 |
| CN100425693C true CN100425693C (zh) | 2008-10-15 |
Family
ID=35007319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2004100163433A Expired - Fee Related CN100425693C (zh) | 2004-02-16 | 2004-02-16 | 一种保存体外肝细胞系统的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100425693C (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102210889A (zh) * | 2010-04-02 | 2011-10-12 | 瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司 | 一种用于人工肝透析的体外生物材料及其制备方法 |
| CN106472483A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-03-08 | 宁波华莱斯医疗器械有限公司 | 一种液基细胞保存液及其制备方法 |
| CN108260586A (zh) * | 2016-12-30 | 2018-07-10 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种原代小鼠肝实质细胞的冻存方法 |
| CN114958724A (zh) * | 2022-06-26 | 2022-08-30 | 依雨大健康科技(广州)有限公司 | 一种稳定的原代肝细胞试剂盒的生产方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993004578A1 (en) * | 1991-09-12 | 1993-03-18 | Mount Sinai Hospital Corporation | Composition for the preservation of organs |
| CN1276152A (zh) * | 1999-06-02 | 2000-12-13 | Mg制药株式会社 | 动物细胞或器官的保存剂及其保存方法 |
| WO2002049428A1 (en) * | 2000-12-20 | 2002-06-27 | University College Cardiff Consultants Limited | Preservation of cells |
| CN1396951A (zh) * | 2000-12-04 | 2003-02-12 | 胡曼泰克有限公司 | 细胞保存液和使用该保存液的细胞保存方法 |
-
2004
- 2004-02-16 CN CNB2004100163433A patent/CN100425693C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993004578A1 (en) * | 1991-09-12 | 1993-03-18 | Mount Sinai Hospital Corporation | Composition for the preservation of organs |
| CN1276152A (zh) * | 1999-06-02 | 2000-12-13 | Mg制药株式会社 | 动物细胞或器官的保存剂及其保存方法 |
| CN1396951A (zh) * | 2000-12-04 | 2003-02-12 | 胡曼泰克有限公司 | 细胞保存液和使用该保存液的细胞保存方法 |
| WO2002049428A1 (en) * | 2000-12-20 | 2002-06-27 | University College Cardiff Consultants Limited | Preservation of cells |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Comparative effects of UW and SLS solutions onconcentrative proline uptake in cold preserved rathepatocytes.. Serrar-H, et al.Therapie-London.,Vol.54 No.5. 1999 |
| Comparative effects of UW and SLS solutions onconcentrative proline uptake in cold preserved rathepatocytes.. Serrar-H, et al.Therapie-London.,Vol.54 No.5. 1999 * |
| 器官保存液最新进展. 董岩等.化学世界，第9期. 2001 |
| 器官保存液最新进展. 董岩等.化学世界，第9期. 2001 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1657609A (zh) | 2005-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Guyomard et al. | Influence of alginate gel entrapment and cryopreservation on survival and xenobiotic metabolism capacity of rat hepatocytes | |
| KR20190031588A (ko) | 세포의 동결보존 및 캡슐화 방법 | |
| CA2798458A1 (en) | Method of engrafting cells from solid tissues | |
| CN100425693C (zh) | 一种保存体外肝细胞系统的方法 | |
| US20190269123A1 (en) | Systems and Methods For Natural Cryoprotectants For Preservation Of Cells | |
| US20130017606A1 (en) | Method of separating pancreatic islet | |
| Hang et al. | In vitro analysis of cryopreserved alginate–poly‐l‐lysine–alginate‐microencapsulated human hepatocytes | |
| da Fonseca Cardoso et al. | Cryopreservation of rat hepatocytes with disaccharides for cell therapy | |
| Hernández et al. | Serum-free culturing of mammalian cells-adaptation to and cryopreservation in fully defined media | |
| Di et al. | Development and evaluation of a trehalose‐contained solution formula to preserve HUC‐MSCs at 4 C | |
| Eipel et al. | Erythropoietin as additive of HTK preservation solution in cold ischemia/reperfusion injury of steatotic livers | |
| Bessems et al. | Machine perfusion preservation of the pig liver using a new preservation solution, polysol | |
| Mukherjee et al. | Effects of cryopreservation on cell viability and insulin secretion in a model tissue-engineered pancreatic substitute (TEPS) | |
| Magalhaes et al. | Vitrification successfully preserves hepatocyte spheroids | |
| Lloyd et al. | Development of a protocol for cryopreservation of hepatocytes for use in bioartificial liver systems | |
| Lee et al. | Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation | |
| Avolio et al. | Comparative evaluation of two perfusion solutions for liver preservation and transplantation | |
| Huang et al. | Cryopreservation of human T lymphocytes under fast cooling with controlled ice nucleation in cryoprotective solutions of low toxicity | |
| AU2021204797A1 (en) | Method of engrafting cells from solid tissues | |
| Taniguchi et al. | Effects of cryoprotectant agents and equilibration methods on developmental competence of porcine oocytes | |
| EP3651576B1 (en) | Preservation solutions | |
| Fischer et al. | Adenine nucleotide levels of canine kidneys during hypothermic aerobic or anaerobic storage in Collins’ solution | |
| KR20140132648A (ko) | 간세포 동결 보존용 무혈청 용액 및 이를 이용한 간세포 동결 보존방법 | |
| Rodriguez et al. | Current advancements in pancreatic islet cryopreservation techniques | |
| Leuvenink et al. | Abdominal Organ Preservation and Resuscitation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20081015 Termination date: 20170216 |