CN108260586A

CN108260586A - 一种原代小鼠肝实质细胞的冻存方法

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Publication number: CN108260586A
Application number: CN201611253844.2A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: CHI SCIENTIFIC Inc
Current assignee: CHI SCIENTIFIC Inc
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2018-07-10

Abstract

本发明提供了一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，包括以下步骤：1）小鼠肝实质细胞冻存液的配制；（2）两步灌流法分离小鼠肝实质细胞；（3）冻存液重悬小鼠肝实质细胞后加入冻存管中；（4）采用逐级降温法冻存小鼠肝实质细胞（5）小鼠肝实质细胞的复苏；（6）TB拒染法测定小鼠肝实质细胞成活率；（7）酶指标活性测定；（8）小鼠肝实质细胞形态观察；（9）ELISA法检测；（10）RT‑PCR检测。本发明提供的一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，操作简单，冻存复苏后所得细胞数量多，成活率高，是一种理想的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，为实验提供可靠的细胞资源。

Description

一种原代小鼠肝实质细胞的冻存方法

技术领域

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法。

背景技术

肝实质细胞作为细胞移植治疗慢性肝衰竭的种子细胞以及作为药物筛选的靶细胞，制备和培养大规模的、高活力的肝细胞是这些研究的最基本环节。因此肝实质细胞的分离、培养和冻存技术正日益受到人们关注，成为当前研究的热点。

肝实质细胞对外界条件非常敏感，对冻存耐受力差，冻存及复苏的过程造成的各种化学及物理损伤均可能影响肝细胞的活力及功能。肝实质细胞低温保存技术已研究多年，目前还未探索一种理想的肝实质细胞冻存方法。合适的冻存液将有效帮助肝实质细胞在冻存过程中抵抗渗透压的变化，减少肝实质细胞冻存过程中的损伤。目前有人用UW液冻存肝实质细胞，但UW液价格昂贵，只能短期低温保存肝实质细胞，长期冻存效果欠理想。因此，急需建立一种简单、高效的冻存小鼠原代肝实质细胞的技术。

本发明在传统低温保存肝细胞技术基础上，旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，建立一套完善可靠的小鼠原代肝实质细胞体外冻存技术。

发明内容

根据上述问题，本发明提供了一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，该方法操作简单，细胞复苏活性好，成活率高，是一种较为理想的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法步骤包括：（1）小鼠肝实质细胞冻存液的配制；（2）两步灌流法分离小鼠肝实质细胞；（3）用配制好的冻存液重悬小鼠肝实质细胞后加入冻存管中；（4）采用逐级降温法冻存小鼠肝实质细胞（5）小鼠肝实质细胞的复苏；（6）TB拒染法测定小鼠肝实质细胞成活率；（7）酶指标活性测定；（8）小鼠肝实质细胞形态观察；（9）ELISA法检测；（10）RT-PCR检测。

其中，步骤（1）小鼠肝实质细胞冻存液含30%~90%H-DMEM培养基，40%~80%胎牛血清，5%~20%二甲基亚砜，1~4 mM谷氨酰胺，20~60 ng/ml地塞米松，100~200 ng/ml肝原代细胞生长因子，1.0~2.0 mmol CaCl₂。

其中，步骤（3）所述冻存液按照4~6×10⁶个细胞/ml重悬细胞，每个冻存管加入1~2 ml冻存液。

其中，步骤（4）所述逐级降温法是将冻存管放入逐级降温冻存盒中，在-80 ℃冰箱冻存4~8h，再置于液氮罐保存冻存15 d、30 d、45 d、60 d。

其中，步骤（5）所述小鼠肝实质细胞的复苏是将各组冻存的肝细胞置于37 ℃水浴锅中迅速晃动使其快速融化。

有益效果

与现有冻存技术相比，本发明建立了一种简单、高效的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，所得原代细胞复苏后经细胞形态学观察与酶活测定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率均达85%以上，细胞纯度均达96%以上。

本发明采用自制的冻存液，采用逐级降温法冻存细胞，减小了在冷冻过程中保护剂对细胞造成的细胞毒性伤害，复苏后获得的细胞数量多，细胞损伤性小，细胞纯度更高。对细胞的损伤降到最低，有利于肝细胞贴壁和后期生长。得到的肝细胞纯度96%以上，本发明所得肝细胞数量多、质量稳定、重复性好。

本发建立的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究肝细胞的特性，为细胞移植和药物筛选等研究提供高质量的肝细胞。

附图说明

图1复苏15 d的小鼠肝实质细胞图片，100×

图2复苏30 d的小鼠肝实质细胞图片，100×

图3复苏45 d的小鼠肝实质细胞图片，100×

图4复苏60 d的小鼠肝实质细胞图片，100×

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合附图和实例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不限于下述实施例。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

本实验所用的实验仪器与试剂如下：

外科手术器械一套，CCK-8细胞计数盒（Sigma，美国），倒置显微镜（XDS -1A，上海），荧光显微镜（Leica，美国），低温离心机（TD24B-WS，上海），超低温冰箱（中科美菱），移液枪（Eppendorf，美国），电子分析天平（Sartorius，美国），超净工作台（HJ-CJ-1D，上海），CO₂细胞培养箱（SANYO MCO-17AI，日本），细胞冻存盒（NALGENE，美国）。

H-DMEM购于Hyclone公司，BSA购于Sigma公司，ELISA试剂盒购于RD公司，青霉素-链霉素双抗于Gibco购买，胎牛血清购买于Bioind公司，多聚赖氨酸购买于美国Gibco公司，PBS自制（8.0 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH₂PO₄、1.44 g Na₂HPO₄溶于1000 ml去离子水中，调整PH为7.2~7.4，非特殊指出，本专利所用的PBS皆为此配方），HBSS自制（8 g/L NaCl，0.4 g/L KCl， 1 g/L 葡萄糖，0.06 g/L KH₂ PO₄，0.0475 g/L Na₂ HPO₄，调整PH为7.2~7.4，非特殊指出，本专利所用的HBSS皆为此配方），Ⅳ型胶原酶购买于德国Serva公司，细胞培养板、离心管购于美国Corning公司，锥虫蓝购买于美国Biofer。

本发明提供的技术方案包括如下步骤：

1.小鼠肝实质细胞冻存液的配制：小鼠肝实质细胞冻存液含30%~90% H- DMEM培养基，40%~80%胎牛血清，5%~20%二甲基亚砜，1~4 mM谷氨酰胺，20~60 ng/ml地塞米松，100~200 ng/ml肝原代细胞生长因子，1.0~2.0 mmol CaCl₂；

2.两步灌流法分离小鼠肝实质细胞：下腔静脉灌注预热的前灌注液HBSS缓冲液，小鼠肝脏完全变黄，无血丝流出时改用37~38 ℃预热的0.1%~0.5%的Ⅳ型胶原酶溶继续灌注；

3.加入完全培养基重悬，细胞计数板计数，在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片，用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止，置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数，细胞数/mL=四大格细胞总数/4×10⁴；

4.小鼠肝实质细胞的冻存：将两步灌流法获得的肝实质细胞计数，用冻存液按照4~6×10⁶个细胞/ml重悬细胞，每个冻存管加入1~2 ml冻存液；

5.将装有小鼠肝实质细胞的冻存管放入逐级降温冻存盒中，置于-80 ℃超低温冰箱放置6~8 h，再转移至液氮罐中长期保存；

6.小鼠肝实质细胞的复苏：冻存15 d、30 d、45 d、60 d，分别取出各组冻存的肝细胞迅速置于37 ℃水浴锅震荡1~2 min使细胞悬液快速完全融化，吸出冻存液于15 ml离心管中，加入5 ml含10%胎牛血清、双抗（100 u/ml的青霉素，100 u/ml的链霉素）、5 μg/ml胰岛素的H-DMEM完全培养基（简称完全培养基）,40~60 g离心5 min，去上清液，沉淀用H-DMEM完全培养基重悬后接种于培养板；

7.TB拒染法测定小鼠肝实质细胞成活率：取90 μL细胞悬液移入小试管中，加入10 μL0.4%的TB染色液混匀，静置，1~2 min，分别计数活细胞与死细胞，镜下死细胞被染成蓝色，而活细胞不着色，计算细胞成活率：活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%；

8.肝实质细胞血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）测定：冻存前和复苏后的肝细胞培养24h后分别取细胞上清液用生化分析仪测定测定ALT、AST、LDH的浓度；

9.细胞形态及生长情况观察：倒置显微镜下复苏后培养的肝细胞，细胞透亮、呈球形边界清晰，多数呈单个均匀散在分布，接种2 h后部分肝细胞开始贴壁，4 h后镜下观察肝细胞的形态逐渐向多边形转变，可明显观察到细胞核，部分肝细胞可以看到双核甚至多核，培养24 h后所有肝细胞牢固贴壁，形态扁平，呈多边形或不规则形，细胞内可见大量颗粒及少量脂滴，7 d后细胞均质透明，胞体清亮，折光性好，可见双核和多核肝细胞；

10.ELISA法检测复苏后培养的小鼠原代肝细胞培养上清中白蛋白的含量，白蛋白含量在第三天达到最高峰，以后逐渐下降；

11.RT-PCR检测检测原代培养的小鼠肝实质细胞中AlbmRNA和细胞色素P450酶系中的CYP2E1mRNA的表达，分别在374 bp和338 bp处出现明亮条带。

高倍显微镜下计数300个细胞，小鼠肝实质细胞纯度为96%以上。

本发明冻存复苏所得小鼠肝实质细胞数量多，细胞成活率均达85%以上，细胞纯度均达96%以上，为生物人工肝、细胞移植和药物筛选等研究提供高质量的细胞资源。

以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）小鼠原代肝实质细胞冻存液的配制；（2）两步灌流法分离小鼠肝实质细胞；（3）冻存液重悬小鼠肝实质细胞后加入冻存管中；（4）采用逐级降温法冻存小鼠肝实质细胞（5）小鼠肝实质细胞的复苏；（6）TB拒染法测定小鼠肝实质细胞成活率；（7）酶指标活性测定；（8）小鼠肝实质细胞形态观察；（9）ELISA法检测；（10）RT-PCR检测。

2.根据权利要求1所述的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（1）所述冻存液含30%~90%H-DMEM培养基，40%~80%胎牛血清，5%~20%二甲基亚砜，1~4 mM谷氨酰胺，20~60 ng/ml地塞米松，100~200 ng/ml肝原代细胞生长因子，1.0~2.0 mmol CaCl₂。

3.根据权利要求1所述的小鼠肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（2）所述两步灌流法为HBSS缓冲液和胶原酶溶液原位两步灌流法，灌流速度5~15 ml/min。

4.根据权利要求3所述的小鼠肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（2）所述两步灌流法中胶原酶溶液为0.1%~0.5%的Ⅳ型胶原酶溶液。

5.根据权利要求1所述的小鼠肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（3）所述冻存液重悬肝实质细胞浓度为4~6×10⁶个细胞/ml，每个冻存管加入1~2 ml冻存液。

6.根据权利要求1所述的小鼠肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（4）所述逐级降温法是将冻存管放入逐级降温冻存盒中，在-80 ℃冰箱冻存4~8 h，再置于液氮罐保存冻存15 d、30 d、45 d、60 d。