CN105010307A - 一种肝原代细胞的冻存液及其冻存复苏方法 - Google Patents

Abstract

一种肝原代细胞的冻存液及其冻存复苏方法，它涉及生物技术领域。其中冻存液按如下配方制成：dH₂O1000g、DMEM/F12培养基粉末15.6g、碳酸氢钠1.2g、地塞米松300ng、肝原代细胞生长因子10μg、胰岛素25mg、谷氨酰胺0.3g、庆大霉素25mg、青霉素50mg、克拉霉素25mg、DMSO0.1g、PEG6000？10g、聚乙烯吡咯烷酮1g、1,3-丙二醇1g。本发明解决了肝原代细胞冻存复苏后存活率较低，无法贴壁进行药物代谢研究的问题，所开发新的细胞冻存液配方和相应的复苏方法可以使细胞冻存复苏的活率在80％以上。

Description

一种肝原代细胞的冻存液及其冻存复苏方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种肝原代细胞的冻存液及其冻存复苏方法。

背景技术

药物代谢主要是由肝脏中的Ⅰ相和Ⅱ相药物代谢酶来完成的，而CYP450酶在生物转化过程中扮演了重要的角色，90％以上的药物氧化是由CYP450酶催化的，是体内最重要的代谢酶，肝原代细胞保留了全部的CYP450酶，是研究药物代谢的最佳体外模型，体外运用肝原代细胞研究药物的代谢通路和清除速率，与体内生理条件下的肝脏代谢有可比性。多个实验室从不同种属(包括人)的体外肝原代细胞模型得到的数据表明，药物代谢的种属差异及细胞毒性的评价数据与体内结果吻合，也证明体外肝原代细胞模型的有效性。但由于肝原代细胞的获得不容易，每次都得通过两步灌流法分离获得而且所花费的试剂价格较高，所以剩余肝原代细胞的冻存是一个关键技术，如果能成功冻存新鲜分离的肝原代细胞，将减少对以研究为目的的新鲜分离肝原代细胞的需求，且肝原代细胞可以随时制备、保存和应用，便于进行药物代谢的研究，可以节省大量的人力、物力和财力。

细胞冻存液是可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，肝原代细胞的冻存复苏是一项比较难的技术，主要是由于肝原代细胞膜比较脆弱，很容易被冰晶机械损伤。传统的细胞冻存液由DMEM或RPMI-1640加入一定比例的二甲基亚砜和胎牛血清组成，然后采用程序降温法冻存细胞，用该配方冻存的肝原代细胞，复苏后肝原代细胞存活率较低，无法贴壁进行药物代谢研究，有待进一步改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝原代细胞的冻存液及其冻存复苏方法，以解决上述问题。

本发明的实施例提供了一种肝原代细胞冻存液，该冻存液按如下配方制成：dH₂O1000g、DMEM/F12培养基粉末15.6g、碳酸氢钠1.2g、地塞米松300ng、肝原代细胞生长因子10μg、胰岛素25mg、谷氨酰胺0.3g、庆大霉素25mg、青霉素50mg、克拉霉素25mg、DMSO0.1g、PEG6000 10g、聚乙烯吡咯烷酮1g、1,3-丙二醇1g。

本发明的实施例还提供了一种肝原代细胞冻存方法，包括如下步骤：

(a)按照两步分离法获得肝原代细胞，去除死细胞，细胞计数计算活细胞的数量，含细胞液离心管插入冰浴中待用；

(b)按照权利要求1的配方配制细胞冻存液，按照4～6﹡10⁶个细胞/mL冻存液进行冻存细胞，其中，细胞冻存液无菌；

(c)将含细胞液离心管在离心机上，4℃条件下离心40～50g，3min，去除上清液，加入细胞冻存液，混匀，加入到细胞冻存管中，每个细胞冻存管加入的体积为1.5～2mL；

(d)将装有肝原代细胞的冻存管放入逐级降温冻存盒中，放入冰箱在-80℃条件下冻存4～8小时后移至液氮罐中长期保存。

进一步，该方法可以应用于鼠、鸭、鸡、狗、兔、猪、羊、牛、猴和人肝脏分离的肝原代细胞的冻存。

本发明的实施例还提供了一种肝原代细胞复苏方法，包括如下步骤：

a)从液氮灌中取出肝原代细胞的冻存管并迅速放入38～40℃水浴锅中，不断晃动使其迅速融化；

b)用无菌吸管吸出溶化的细胞液加入到预先放置含10～20％胎牛血清的新鲜培养液的无菌试管中，混匀，插入到冰浴中，4℃条件下离心40～50g，3分钟，去除上清液，加入含10～90％Percoll新鲜培养液，4℃条件下离心90～100g，3min，去除上清液，再加入含10～20％胎牛血清的新鲜培养液，4℃条件下再离心40～50g，3min，去除上清液，最后用含10～20％胎牛血清的新鲜培养液重悬，插入到冰浴中待用；

c)采用台盼兰染色方法进行细胞计数，计算活细胞总数，按照10⁶个细胞/mL铺于鼠尾胶处理过的6、12和24孔培养板中，放入到培养板每孔体积分别为2mL、1mL和0.5mL；

d)培养板放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，培养4～6小时后吸除含血清的培养液，加入含0.2～0.3mg/mL Matrigen胶进行培养，24～36小时培养后，得到复苏的肝原代细胞。

与现有技术相比本发明的有益效果是：本发明提供的肝原代细胞的冻存液及其冻存复苏方法，可以使细胞冻存复苏的存活率在80％以上，显著提高了复苏后肝原代细胞的存活率。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种新的细胞冻存液配方和相应的复苏方法可以使细胞冻存复苏的活率在80％以上，进一步使冻存复苏的细胞可以与新鲜分离的细胞具有同等的代谢功能，可以使冻存复苏的细胞能够同新鲜分离的一样贴壁做药物代谢酶的诱导研究。

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

1、肝原代细胞冻存液配制

肝原代细胞冻存液配方组分为：dH₂O1000g、DMEM/F12培养基粉末15.6g、碳酸氢钠1.2g、地塞米松300ng、肝原代细胞生长因子10μg、胰岛素25mg、谷氨酰胺0.3g、庆大霉素25mg、青霉素50mg、克拉霉素25mg、DMSO0.1g、PEG6000 10g、聚乙烯吡咯烷酮1g、1,3-丙二醇1g。配制完成后，过滤分装冻存于-20℃冰箱。使用前预先在冰上融化。

2、肝原代细胞冻存与复苏

(a)按照两步分离法获得肝原代细胞，去除死细胞，细胞计数计算活细胞的数量，含细胞液离心管插入冰浴中待用；

(b)按照权利要求1的配方配制细胞冻存液，按照4～6﹡10⁶个细胞/mL冻存液进行冻存细胞，其中，细胞冻存液无菌；

(c)将含细胞液离心管在离心机上，4℃条件下离心40～50g，3min，去除上清液，加入细胞冻存液，混匀，加入到细胞冻存管中，每个细胞冻存管加入的体积为1.5～2mL；

(d)将装有肝原代细胞的冻存管放入逐级降温冻存盒中，放入冰箱在-80℃条件下冻存4～8小时后移至液氮罐中长期保存。

该冻存方法可以应用于鼠、鸭、鸡、狗、兔、猪、羊、牛、猴和人肝脏分离的肝原代细胞的冻存。

(e)从液氮灌中取出肝原代细胞的冻存管并迅速放入38～40℃水浴锅中，不断晃动使其迅速融化；

(f)用无菌吸管吸出溶化的细胞液加入到预先放置含10～20％胎牛血清的新鲜培养液的无菌试管中，混匀，插入到冰浴中，4℃条件下离心40～50g，3分钟，去除上清液，加入含10～90％Percoll新鲜培养液，4℃条件下离心90～100g，3min，去除上清液，再加入含10～20％胎牛血清的新鲜培养液，4℃条件下再离心40～50g，3min，去除上清液，最后用含10～20％胎牛血清的新鲜培养液重悬，插入到冰浴中待用；

(g)采用台盼兰染色方法进行细胞计数，计算活细胞总数，按照10⁶个细胞/mL铺于鼠尾胶处理过的6、12和24孔培养板中，放入到培养板每孔体积分别为2mL、1mL和0.5mL；

(h)培养板放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，培养4～6小时后吸除含血清的培养液，加入含0.2～0.3mg/mL Matrigen胶进行培养，24～36小时培养后，得到复苏的肝原代细胞，即可进行药物诱导研究。

本发明的冻存液同时含渗透性和非渗透性低温保护剂，尤其采用DMSO、PEG6000、聚乙烯吡咯烷酮和1,3-丙二醇，可以明显阻止冰晶生长，可以有效形成低温玻璃化冻存结果。

本发明通过提供了一种肝原代细胞的冻存液及其冻存复苏方法，具有以下有益效果：

1)本发明可以使细胞冻存复苏的活率在80％以上，进一步使冻存复苏的细胞可以与新鲜分离的细胞具有同等的代谢功能，可以使冻存复苏的细胞能够同新鲜分离的一样贴壁做药物代谢酶的诱导研究。

2)本发明的冻存液同时含渗透性和非渗透性低温保护剂，尤其采用DMSO、PEG6000、聚乙烯吡咯烷酮和1,3-丙二醇，可以明显阻止冰晶生长，可以有效形成低温玻璃化冻存结果。

3)本发明的玻璃化冻存液体系同时考虑了保护剂毒性、渗透性和玻璃化能力，而且利用低温冻存盒保证了慢速降温的效果，使肝原代细胞不至于被迅速冰晶化而影响肝原代细胞的复苏活率。

4)本发明减少了对以研究为目的的新鲜分离肝原代细胞的需求，且肝原代细胞可以随时制备、保存和应用，便于进行药物代谢的研究，可以节省大量的人力、物力和财力。

下面通过具体实例对该发明作进一步说明：

实例1

SD大鼠肝原代细胞冻存复苏试验

(a)按照两步分离法获得肝原代细胞，去除死细胞，细胞计数计算活细胞的数量，含细胞液离心管插入冰浴中待用；

(b)按照权利要求1的冻存液配方配制的细胞冻存液，按照6﹡10⁶个细胞/mL冻存液进行冻存细胞，细胞冻存液是无菌的；

(c)先在离心机上4℃，45g离心3min，去除上清液，加入细胞冻存液，混匀，每个细胞冻存管加入的体积为1.5mL；

(d)把装好肝原代细胞的冻存管放入逐级降温冻存盒中，放入-80℃冰箱冻存6小时后移至液氮罐中长期保存。

(e)从液氮灌中取出冻存管迅速放入39℃水浴锅中，不断晃动使其迅速融化。

(f)用无菌吸管吸出溶化的细胞液加入到预先放置含15％胎牛血清的新鲜培养液的无菌试管中，轻轻混匀，插入到冰浴中，4℃条件下离心45g，3分钟，去除上清液，加入含60％Percoll新鲜培养液4℃条件下离心100g，3分钟，去除上清液，再加入含15％胎牛血清的新鲜培养液4℃条件下再离心45g，3分钟，去除上清液，最后用含15％胎牛血清的新鲜培养液重悬，插入到冰浴中待用。

(g)采用台盼兰染色方法进行细胞计数，计算活细胞总数，根据10⁶个细胞/mL铺于鼠尾胶处理过的12孔培养板中，放入到培养板每孔体积为1mL。

(h)放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，培养6小时后吸除含血清的培养液，加入含0.3mg/mL Matrigen胶进行培养，36小时培养后即可进行药物诱导研究。

(i)用含CYP3A或1A探针底物(咪达唑仑5μmol/L、非那西丁20μmol/L)的细胞培养液孵育冻存复苏SD大鼠肝原代细胞酶活性，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育1小时，取上清液进样LC-MS/MS定量分析各探针底物代谢产物的生成量，得到酶活性，参见表1。

表1冻存复苏大鼠肝细胞CYP1A和CYP3A酶活性

实例2

SD大鼠肝原代细胞冻存复苏后TCAS诱导试验

1.试验方法

1.1.大鼠原代肝细胞的分离培养

采用两步灌流法分离获得大鼠肝原代细胞。分离获得的肝原代细胞以台盼蓝染色检测细胞活力，将肝细胞密度调整为每毫升10⁶个，悬于含15％血清的完全培养基中。“三明治”夹心培养法培养分离获得的肝原代细胞。将密度为10⁶个/mL的肝原代细胞悬液，按每孔0.5mL的体积接种于经鼠尾胶处理过的24孔板中。将其置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养4小时。待细胞贴壁后，改用含有Matrigen胶(浓度为0.3mg·mL^-1)的无血清培养液培养，使之形成“三明治”夹心状态。

1.2大鼠肝细胞诱导试验

将新鲜分离的大鼠肝原代细胞按“三明治”培养法接种于24孔细胞培养板，置二氧化碳培养箱中培养，分别设对照组、实验组和阳性诱导剂组，对照组加溶解剂，实验组加不同浓度的TCAS，终浓度分别为1、5、10、50和100μmol/L，阳性诱导剂组含(CYP1A，3-甲基胆蒽2.5μmol/L；CYP3A，地塞米松50μmol/L)，连续诱导3天，每天换液一次(每孔0.5mL)。3天诱导期结束后，吸去含药培养液，换用等体积含CYP3A或1A探针底物(咪达唑仑5μmol/L、非那西丁20μmol/L)的细胞培养液继续孵育1h。在孵育终点每孔取孵育液200μL，用200μL含内标的甲醇/乙腈(1﹕1)终止反应，13,800×g、4℃离心10min，取上清液进样LC-MS/MS定量分析各探针底物代谢产物的生成量，得到酶活性。每组设3个平行孔。

参照美国FDA2012年2月发布的《药物相互作用研究指导原则草案》，以受试药组酶活性相对于阳性诱导剂组酶活性的百分比评价受试药物对CYP1A和CYP3A酶活性的诱导作用，由公式1计算相对于阳性组的百分比。

$E_{r.ind.}=\frac{C_{test}-C_{control}}{C_{pos}-C_{control}}\×100\%---\left(1\right)$

式中Er.ind.代表受试药的相对诱导百分比，C_test、C_control和C_pos分别代表受试药组、空白对照组和阳性对照组探针底物代谢产物生成量。酶诱导作用的评判标准为受试药组的酶活性改变≥阳性对照组的40％。

2.结果

CYP1A和CYP3A的阳性诱导剂3-甲基胆蒽和地塞米松分别与“三明治”夹心培养大鼠肝原代细胞孵育3天后，均能显著诱导两个同工酶的活性，与不加诱导剂的阴性对照组相比，CYP1A的酶活性诱导倍数为25.6倍，CYP3A酶活性的诱导倍数为4.8倍，均高于2倍，表明所建立的鼠肝细胞诱导模型可用于评价候选药物的CYP酶诱导活性。

将5个浓度水平的TCAS与大鼠原代肝细胞孵育3天后，加入探针底物，测定对CYP1A和3A酶活性的诱导作用，结果见表2。

表2. TCAS对大鼠CYP1A和CYP3A的诱导作用

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (4)

1.一种肝原代细胞冻存液，其特征在于，按如下配方制成：dH₂O1000g、DMEM/F12培养基粉末15.6g、碳酸氢钠1.2g、地塞米松300ng、肝原代细胞生长因子10μg、胰岛素25mg、谷氨酰胺0.3g、庆大霉素25mg、青霉素50mg、克拉霉素25mg、DMSO0.1g、PEG600010g、聚乙烯吡咯烷酮1g、1,3-丙二醇1g。

2.一种肝原代细胞冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)按照两步分离法获得肝原代细胞，去除死细胞，细胞计数计算活细胞的数量，含细胞液离心管插入冰浴中待用；

(b)按照权利要求1的配方配制细胞冻存液，按照4～6﹡10⁶个细胞/mL冻存液进行冻存细胞，其中，细胞冻存液无菌；

(c)将含细胞液离心管在离心机上，4℃条件下离心40～50g，3min，去除上清液，加入细胞冻存液，混匀，加入到细胞冻存管中，每个细胞冻存管加入的体积为1.5～2mL；

(d)将装有肝原代细胞的冻存管放入逐级降温冻存盒中，放入冰箱在-80℃条件下冻存4～8小时后移至液氮罐中长期保存。

3.如权利要求2所述一种肝原代细胞冻存方法，其特征在于，该方法可以应用于鼠、鸭、鸡、狗、兔、猪、羊、牛、猴和人肝脏分离的肝原代细胞的冻存。

4.一种肝原代细胞复苏方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)从液氮灌中取出肝原代细胞的冻存管并迅速放入38～40℃水浴锅中，不断晃动使其迅速融化；

b)用无菌吸管吸出溶化的细胞液加入到预先放置含10～20％胎牛血清的新鲜培养液的无菌试管中，混匀，插入到冰浴中，4℃条件下离心40～50g，3分钟，去除上清液，加入含10～90％Percoll新鲜培养液，4℃条件下离心90～100g，3min，去除上清液，再加入含10～20％胎牛血清的新鲜培养液，4℃条件下再离心40～50g，3min，去除上清液，最后用含10～20％胎牛血清的新鲜培养液重悬，插入到冰浴中待用；

c)采用台盼兰染色方法进行细胞计数，计算活细胞总数，按照10⁶个细胞/mL铺于鼠尾胶处理过的6、12和24孔培养板中，放入到培养板每孔体积分别为2mL、1mL和0.5mL；

d)培养板放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，培养4～6小时后吸除含血清的培养液，加入含0.2～0.3mg/mL Matrigen胶进行培养，24～36小时培养后，得到复苏的肝原代细胞。