CN103027032B - 一种鼠李糖脂作为细胞低温或超低温保存的保护剂应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠李糖脂作为细胞低温或超低温保存的保护剂应用，含5-100mg/L的鼠李糖脂用量可显著提高冻存和低温保存后的细胞活率和功能，作用效果显著。

Description

一种鼠李糖脂作为细胞低温或超低温保存的保护剂应用

技术领域

本发明涉及生物表面活性剂技术领域，尤其涉及一种鼠李糖脂作为细胞低温和超低温保存保护剂的应用。

背景技术

生物表面活性剂是一种具有复杂结构和多样化基团的表面活性物质，其主要由微生物产生。生物表面活性剂在环境保护、医药化工、食品以及农业等各领域相比于化学表面活性剂更受青睐，因为其具有易被降解且本身无毒等特点，使其具有较大的环境友好性及生物相容性。生物表面活性剂还因为其相对特殊的结构而使其具有一般化学表面活性剂未能体现的作用。由亲水的1-2个鼠李糖与亲脂的1-2个脂肪酸链连接构成的鼠李糖脂是目前研究最为广泛的生物表面活性剂。其研究遍及采油、环境生物修复、化妆品、食品及医药等多个领域，最近还见报道因其独特结构而具有特异性杀死癌细胞的作用。

活的动物细胞在组织工程，细胞移植和基因工程领域都是极为重要的研究和治疗工具，但是因为来源有限限制了其应用。活细胞保存技术可以有效促进其实际临床应用。活细胞主要是采用液氮进行超低温冷冻或者温度处于0-4度的低温保存，此技术也适合于组织、器官的保存。目前，新的保护剂诸如海藻糖等被用于细胞冻存或者低温保存，但是还都存在保存效果不佳、保存条件要求苛刻和操作较为复杂等问题。

虽然鼠李糖脂具有潜在的广泛用途，但未出现作为细胞低温或超低温保存的保护剂的应用报道。本发明采用环境、友好的生物表面活性剂鼠李糖脂，用于细胞的低温或超低温保存。

发明内容

本发明的目的在于针对海藻糖作用不显著的缺陷，提供一种鼠李糖脂在细胞低温或超低温保存中的作用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种鼠李糖脂作为细胞低温或超低温保存的保护剂应用，将鼠李糖脂与海藻糖一起添加到细胞低温或超低温保护剂中，作用于活细胞，使细胞维持较高的活率和极好的功能；所述鼠李糖脂的质量百分比浓度高于90%，鼠李糖脂的用量为5-100mg/L，海藻糖的用量为0.1-1M。

本发明具有的有益效果是：本发明所提出的鼠李糖脂作为超低温或低温保护剂，可显著提高细胞的存活率和功能。

具体实施方式

鼠李糖脂的使用方法见如下步骤：

1.所用的鼠李糖脂具有高于90%以上的纯度（质量百分比浓度）。

2.细胞的低温保存：细胞先在37℃预培养12-18小时后，被转移至0-4℃进行低温培养24-36小时，其中低温培养过程中培养基添加了0.1-1M海藻糖和5-100mg/L的鼠李糖脂。低温保存结束后，将细胞复温至37℃，并进行培养，观察细胞活率及功能。

3.细胞的冻存:由冻存培养液再添加0.1-1M海藻糖和5-100mg/L鼠李糖脂组成细胞冻存液，将待冻存的细胞加入到上述的细胞冻存液中，然后迅速转移到程序降温盒中，最后将冷冻管转移至液氮中保存。细胞复温后进行活率测定并通过培养测定细胞功能。

下面结合具体实施例详述本发明具体内容及其所带来的显著效果。

实施例1、大鼠肝细胞冻存中使用鼠李糖脂

大鼠肝细胞作为哺乳动物细胞具有体积大、易敏感的特点，因而冻存难度较大。对自行分离得到的大鼠肝细胞采用冻存的方法。为了考察鼠李糖脂和海藻糖联用的作用，细胞冻存采用了三种保护剂配方。

配方1：1640低碳培养基70%，DMSO10%，FBS20%，再添加580μM甘草酸二铵,2mM维生素E，0.1M海藻糖和不同浓度的鼠李糖脂。

配方2：1640低碳培养基70%，DMSO10%，FBS20%，再添加580μM甘草酸二铵,2mM维生素E，1M海藻糖和不同浓度的鼠李糖脂。

配方3：1640低碳培养基70%，DMSO10%，FBS20%，再添加0.1M海藻糖和不同浓度的鼠李糖脂。

细胞冻存一段时间后水浴复温，用台盼蓝染色的方法测定细胞活率,结果见表1.

表1：鼠李糖脂对大鼠肝细胞冻存后活率的影响

从以上结果可以看出，冻存液的组成对鼠李糖脂的作用没有明显影响，鼠李糖脂的加入都可以显著提高细胞的活率，特别是较低浓度（10mg/L）的鼠李糖脂就可以产生较为显著的效果。细胞复温后铺板培养24和120小时候进行形态观察,加入了鼠李糖脂的细胞能够形成更多更大的岛状结构，而且细胞形态也更为立体。

实施例2：鼠李糖脂对大鼠肝细胞冻存后的肝细胞功能的影响

大鼠肝细胞一般都是用于药物在肝脏中行为的研究，所以细胞肝功能是一个极为重要的指标，因此我们采用自行分离得到的大鼠肝细胞并采用优化的冻存配方进行冻存，复温后将细胞进行平板培养并测定其相关功能，结果见表2。其中，白蛋白分析采用Elisa试剂盒检测，药物代谢酶CYP1A2、CYP2E1则分别以醋胺酚、4-硝基酚为底物进行检测，谷胱甘肽则使用DTNB法检测，尿素则采用南京建成试剂盒检测。

本实施例中采用的冻存配方为：1640低碳培养基70%，DMSO10%，FBS20%，再添加580μM甘草酸二铵,2mM维生素E，0.2M海藻糖和10mg/L的鼠李糖脂。

表2：

从以上结果可以看出，10mg/L的鼠李糖脂处理过后的细胞功能已经基本接近新鲜细胞的水平。这说明鼠李糖脂在较低浓度时就可以显著提高细胞冻存后的活率，并能够很好的维持细胞的形态和功能，作用极为显著。

实施例3、大鼠肝细胞低温保存中使用鼠李糖脂

对于器官移植来说，生物器官需要能够经历一段时间的低温保存，所以我们采用组织化培养的大鼠肝细胞模拟器官进行低温保存，在保护液中加入鼠李糖脂.具体如下：将肝细胞通过与大鼠鼠尾胶原混合后培养于中空纤维内，先在37℃预培养12-18小时，在预培养的过程中细胞是培养在添加了58μM甘草酸二铵和0.2mM维生素E的WME培养基中。然后将细胞转移至4℃进行低温培养24-36小时，低温培养的过程中细胞是培养在添加了0.2M海藻糖和5-30mg/L的鼠李糖脂的WME培养基中。最后将细胞复温至37℃，此时细胞是培养在添加了58μM甘草酸二铵，0.2mM维生素E和苦参碱的WME培养基中。复温培养24小时后用MTT法测定细胞活率，预培养的时间长短对活率没有明显影响，低温培养不同时间的细胞活率结果见表3。

表3：鼠李糖脂对大鼠肝细胞低温保存后的活率影响

从以上结果可以看出，5mg/L的鼠李糖脂的加入对细胞活率有轻微的提高，10mg/L的鼠李糖脂处理后基本已经达到较高的细胞活率，鼠李糖脂浓度再增加细胞活率也没有再显著增加了。说明较低浓度的鼠李糖脂的加入就可以明显提高细胞低温保存后的活率，作用效果显著。

实施例4、大鼠肾细胞冻存中使用鼠李糖脂

因为肾细胞在药物的肾代谢的研究中是比较重要的体外研究模型，而且肾细胞也是人工肾的重要活细胞来源，因而考察鼠李糖脂对肾细胞冻存的影响，对自行分离得到的大鼠肾细胞采用冻存的方法。用细胞冻存液将肾细胞制成一定浓度的细胞悬液，然后添加10%的DMSO，20%的FBS和0.2M海藻糖。为了考察鼠李糖脂在冻存中是否能产生效果，所以在上述冻存液的基础上加入5-100mg/L的鼠李糖脂，然后液氮冻存一段时间后水浴复温，用台盼蓝染色的方法测定细胞活率,结果见表4

表4：鼠李糖脂对大鼠肾细胞冻存后活率的影响

从上述结果可以看出，鼠李糖脂的加入对于大鼠肾细胞冻存来说也是极为有效的，可以让大鼠肾细胞经过冻存后的活率从69.1%增加到92.3%，对于开展肾细胞相关研究有很大的意义。

实施例5、血红细胞冻存中使用鼠李糖脂

现有的血库存在血液告急就是因为细胞冻存中存在细胞活率明显降低的现象，所以将鼠李糖脂运用关于血红细胞的冻存中。细胞冻存液由培养基再添加10%的DMSO、20%的FBS和0.2M海藻糖组成。为了考察鼠李糖脂在冻存中是否能产生效果，所以在上述冻存液的基础上分别加入0、20和30mg/L的鼠李糖脂，然后液氮冻存一段时间后水浴复温，用台盼蓝染色的方法测定细胞活率。在上述冻存方法中，添加20和30mg/L鼠李糖脂的细胞活率分别达到86.7%和93.3%，大大高于不加鼠李糖脂组的81.2%活率。

表5：鼠李糖脂对血红细胞冻存后活率的影响

编号

鼠李糖脂浓度,mg/L

细胞活率（相对于新鲜细胞活率

		的百分比，%）
			1	0	56.8
2	5	65.1
			3	10	71.3
4	20	86.7
			5	30	93.3

上述结果可以看出，血红细胞在30mg/L鼠李糖脂存在的情况下基本上可以达到接近新鲜细胞活率的水平，大大的改善了细胞冻存中存在的问题，突出了鼠李糖脂在冻存中的作用

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种鼠李糖脂作为细胞低温或超低温保存的保护剂应用，其特征在于，将鼠李糖脂、海藻糖、维生素E与甘草酸二铵一起添加到细胞低温或超低温保护液中，作用于活细胞；所述鼠李糖脂的质量百分比浓度高于90%，鼠李糖脂的用量为5-100 mg/L，海藻糖的用量为0.1-1M，甘草酸二铵的用量为580μM , 维生素E的用量为2 mM，所述细胞为肝细胞、肾细胞或血红细胞。