CN109788752A - 用糖脂增强细胞冷冻保存 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及保存活细胞材料的方法，包括：将所述细胞材料暴露于含有至少一种糖脂和冷冻保护剂的培养基经过预定的时间；并且在暴露之后，使所述细胞材料经过冷冻保存方案，所述冷冻保存方案包括在约‑80℃或更低的冷冻保存温度下的冷冻保存。

Description

用糖脂增强细胞冷冻保存
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月22日提交的美国临时申请号62/365,512的权益。在先申请的公开内容均通过引用其全部内容纳入本文。
背景技术
本公开涉及低温下细胞，组织和器官保存的领域(例如，冷冻保存)。更具体地，本公开涉及用糖脂，例如，已从冷冻耐受/冷冻避免的生物体和/或植物中分离的抗冻糖脂(AFGL)处理细胞材料的方法，并提供保存后细胞存活增强的细胞群-即使在次优的冷却条件，例如快速冷却下。
常规的冷冻保存方法通常包括向冷冻小瓶中悬浮的细胞中加入10％DMSO和慢速冷却，有或没有诱导成核，以及在-80℃或低于-135℃下储存。只要在解冻时存在活细胞，细胞产量通常是常规方法中的次要考虑因素。然而，存在难以保存的细胞类型和组织以及细胞产量至关重要的情况，例如细胞治疗应用。提供改善细胞活力和产量(即使在次优的冷却条件下)并且允许保存传统上难以保存的细胞类型的替代方案和解决方案。
大自然已经发展出各种各样的替代策略，允许生物体/植物耐受/生存于极端温度。关于生物体/植物如何在极端温度下存活的研究表明它们产生各种抗冻化合物，这有助于它们避免冷冻或耐受冷冻，直到温度升高为止。例如，鱼类和昆虫中抗冻蛋白的发现为探索替代保存策略提供了一条途径。
在这方面，已经发现抗冻蛋白的存在降低了溶液的凝固点并且还改变了冰的形状和形成。例如，抗冻肽(AFP)可以吸附到冰晶表面，阻止水分子添加到生长位点，从而将晶体生长的温度(称为滞后冰点)降低多达13℃。AFP还可以与初期冰晶结合，从而抑制冰成核并允许远低于冰点的广泛过冷。它们还被认为能够改变冰结构，抑制重结晶并改变溶液的流体性质，从而延长了零下环境中生物体的存活。以这种方式，可以使用可能较少的冷冻保护剂来保存细胞，从而减少潜在的细胞毒性。
尽管抗冻肽(AFP)已知且已被广泛研究，但在几种生物体/植物，包括昆虫(耐冻昆虫和防冻昆虫)和耐冻性植物中也发现了各种抗冻糖脂(AFGL)。然而，在本公开的方法之前，在保存哺乳动物细胞的背景下使用这种较大分子的情况有所限制(部分原因是认为哺乳动物细胞膜对较大分子是不可渗透的(Castro，A.G.，Lapinski，J.，Tunnacliffe，A.Nature Biotechnology 18：473，2000)并且先前认为，对于有效增强存活的分子，这种分子需要同时存在于细胞膜的内侧和外侧)。这种AFGL的分离为开发/增强各种细胞和组织类型的保存方法提供了机会。
发明概述
提供该概述是为了介绍将在以下详细描述中进一步描述的一些概念。该概述并不旨在识别所要求保护主题的关键或必要特征，也不旨在单独用作帮助限制所要求保护的主题的范围。
发现在存在糖脂，例如从一种或多种生物体分离的AFGL的情况下在各种条件下孵育细胞材料导致在各种条件(包括例如次优的冷却条件，例如快速冷却)下的细胞存活增加。
因此，本申请提供了用糖脂(例如AFGL)处理细胞材料的方法，其增强了这些细胞材料在冷冻保存过程中存活的能力，即使在次优的冷却条件下，例如快速冷却。
附图说明
图1是关于冷冻保存后细胞活力获得的数据的说明，其中角质形成细胞在小瓶中或在RPMI中的10％DMSO中的培养板中冷冻保存。
图2是用在DMSO中的三带大蚊(Tipula trivittat)AFGL的连续稀释液冷冻保存后获得的关于细胞存活的数据的图示，其中细胞在冷冻保存之前暴露于1M DMSO中的AFGL。
图3是在冷冻保存后获得的关于A10细胞的细胞活力和增殖的数据的图示，其中A10细胞以20,000个细胞/孔铺板，然后在1.0M DMSO+/-三带大蚊AFGL中冷冻保存。
图4是在DMSO中冷冻保存后获得的关于细胞存活的数据的图示，所述DMSO具有从4种昆虫和1种植物物种获得的AFGL，其中细胞在冷冻保存之前暴露于1M DMSO中的10ppmAFGL。
具体实施方式
术语和定义
在以下详细说明部分，陈述了大量细节以便理解本发明。然而，本领域技术人员可以理解，可以在没有这些细节的情况下实践本公开的方法，并且可以对所描述的实施例进行多种变化或修改。
首先，应该注意的是，在任何实际实施方式的发展中，会做出许多特定的实施决定以达到开发者的特定目标，例如遵从系统相关的和经济相关的限制，这会造成不同实施之间的差异。此外，应理解，这样的开发努力可能是复杂且耗时的，但是这对于从本发明公开中获益的本领域普通技术人员而言会是常规工作。此外，本文使用/公开的组合物还可包含除所引用的那些之外的一些组分。在概述和该详细描述中，每个数值应该被一次理解为由术语“约”修饰(除非已经明确地如此修饰)，然后再次理解为未如此修饰，除非在上下文中另有说明。
如本文所用，与量结合使用的术语“约”包括所述值并且具有上下文所规定的含义。例如，它至少包括与特定量的测量相关的误差程度。当在范围的上下文中使用时，修饰词“约”也被认为公开了由两端点的绝对值所限定的范围。例如，“约2至约4”的范围也公开了“2至4”的范围。
除非本文另有明确说明，否则关于温度(℃)的修饰词“约”是指所述温度或温度范围，以及所述温度或温度范围所述的(所述温度或者温度范围的终点的)+/-1-4％。关于细胞活力和细胞保留率(％)，除非本文另有明确说明，关于细胞活力和细胞保留(％)的修饰词“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-3％。关于表达内容，例如，以百万分之一(ppm)或十亿分之一(ppb)为单位，除非本文另有明确说明，否则关于细胞活力和细胞保留(％)的修饰语“约”指的是所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-3％。关于以单位μg/mL表达含量，除非本文另有明确说明，关于以μg/mL表示的值的修饰词“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-4％。关于摩尔浓度(M)，除非本文另有明确说明，关于摩尔浓度(M)的修饰词“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-2％。关于冷却速率(℃/分钟)，除非本文另有明确说明，关于冷却速率(℃/分钟)的修饰词“约”是指所述值或值范围以及所述值或值范围+/-1-3％。
此外，在概述和该详细描述中，应该理解的是，列出或描述的有用，合适的范围等旨在包括对该范围内的任何可想到的子范围的支持，至少因为该范围中的每个点，包括终点在内的范围应视为已经说明。例如，“1至10的范围”将被读取为指示沿着约1和约10之间的连续区上的每个可能的数字。另外，例如，+/-1-4％将被读取为指示沿着1和4之间的连续区上的每个可能的数字。此外，本示例中的一个或多个数据点可以组合在一起，或者可以与说明书中的数据点之一组合以创建范围，因此包括此范围内的各可能值或数字。因此，(1)即使明确指定了该范围内的许多特定数据点，(2)即使参考该范围内的一些特定数据点，或(3)即使该范围内没有明确指定的数据点，会理解(i)发明人想到并理解该范围内的任何可想到的数据点应被认为已被指定，并且(ii)发明人拥有整个范围，范围内的可想到的每个子范围，以及范围内的每个可想到的点的知识。此外，本文说明性地公开的本申请的主题可适当地在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下实施。
除非另有明确说明，否则“或”指的是包含性的或，而不是指排他性的或。例如，条件A或B满足以下任何一个：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B都为真(或存在)。
另外，使用“一个”或“一种”来描述本文实施方式的元件和组分。这仅仅是为了方便并且给出根据本公开的概念的一般意义。除非另有说明，否则该描述应理解为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数。
本文所用的术语和词语是为了描述目的，而不应被视为限制性的。诸如“包括”，“包含”，“具有”，“含有”或“涉及”及其变体的语言旨在广泛并且包括其后列出的主题，等同物和未列举的其他主题。
此外，如本文所用，“一个实施方式”或“一种实施方式”表示结合实施方式描述的具体元件、特征、结构或性质包括在至少一个实施方式中。在说明书中各处出现的短语“在一个实施方式中”不一定是指同一实施方式。
如本文所用，术语“室温”是指在标准压力下约18℃至约25℃的温度。在各种实例中，室温可为约18℃，约19℃，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃或约25℃。
如本文所用，“细胞材料”或“细胞样品”是指含有细胞组分的活生物材料，无论该材料是天然的还是人造的，并且包括细胞，组织和器官，无论是天然的还是人造的。这些术语还指任何类型的待冷冻保存的生物材料，例如细胞，组织和器官。在一些实施方式中，细胞，组织和器官可以是哺乳动物器官(例如人器官)，哺乳动物细胞(例如人细胞)和哺乳动物组织(例如人组织)。
如本文所用，术语“器官”是指任何器官，例如肝，肺，肾，肠，心脏，胰腺，睾丸，胎盘，胸腺，肾上腺，动脉，静脉，淋巴结，骨或骨骼肌。如本文所用，术语“组织”包括任何组织类型，包括任何种类的细胞类型(例如来自上述器官之一)及其组合，包括例如卵巢组织，睾丸组织，脐带组织，胎盘组织，结缔组织，心脏组织，来自肌肉，软骨和骨骼的组织，内分泌组织和神经组织。术语“组织”还可包括脂肪组织或牙髓组织。在一些实施方式中，组织或器官是从人获得的，例如人肝，人肺，人肾，人肠，人心，人胰腺，人睾丸，人胎盘，人胸腺，人肾上腺，人动脉，人体静脉，人淋巴结，人骨骼或人骨骼肌。
如本文所用，术语“细胞”包括任何类型的细胞，例如体细胞(包括组织或器官中的所有细胞)，成纤维细胞，角质形成细胞，肝细胞，心肌细胞，平滑肌细胞，干细胞，祖细胞，卵母细胞，精子和生殖细胞。这些细胞可以是分离的形式或非分离的形式，例如含有细胞的体液，组织或器官的形式。在一些实施方式中，细胞来自哺乳动物组织或器官，例如上述人组织或器官。
如本文所用，“保存方案”是指向含细胞的活生物材料提供保质期的方法。保存方案可包括通过冷冻干燥或脱水的脱水保存和/或玻璃化和/或干燥的冷冻保存。
如本文所用，术语“冷冻保护剂”是指化学物质，与没有冷冻保护剂的冷冻效果相比，当组织冷却至零下温度时该化学物质使细胞/组织/器官中的冰晶形成最小化并且在加热后基本上不对细胞/组织/器官造成损伤。
如本文所用，与冷冻保存的材料相关的术语“冷冻保存后的功能”是指冷冻保存后的经冷冻保存的材料，例如器官，组织或细胞，在冷冻保存后保留了可接受的和/或预期的功能。在一些实施方式中，冷冻保存后的细胞材料保留其所有预期功能。
在一些实施方式中，通过本公开内容的方法保存的细胞冷冻保存的材料保留预期功能的至少50％，例如预期功能的至少60％，例如预期功能的至少70％，例如预期功能的至少80％，例如预期功能的至少90％，例如预期功能的至少95％，例如预期功能的100％。例如，在保持细胞活力的同时，维持/保持细胞/组织/器官的生理功能，例如对于心脏而言的泵送功能，和/或组织/细胞(例如，待移植的那些)与周围组织/细胞整合的能力可能也是重要的。
如本文所用，术语“糖脂”是指具有至少一个与脂肪酸链，神经酰胺或任何其他脂质连接的碳水化合物链的任何分子。糖脂，例如AFGL，可以是天然(例如，分离的和/或纯化的)或合成来源的。术语“碳水化合物链”是指含有超过一个单糖单元的糖部分。也就是说，术语碳水化合物包括多糖和/或寡糖。在实施方式中，碳水化合物也可以是各种单糖重复单元的混合物，例如包括木糖和甘露糖重复单元的多糖。如本文所用的术语“脂质”是指来自天然存在的或合成的分子的任何分子，其包括脂肪，蜡，甾醇，脂溶性维生素，甘油单酯，甘油二酯，甘油三酯，磷脂等。
本文所用的术语“分离的”是指经历过实验室纯化程序，包括例如提取，离心，冰亲和纯化(例如，具有多个冷冻/解冻冰纯化循环)和/或色谱分离(例如，薄层色谱或高效液相色谱)的任何组合物或混合物。通常，此类程序基于物理，化学或电势特性提供分离的组合物或混合物。根据程序的选择，分离的组合物或混合物可含有其他具有相似化学性质的组合物，化合物或混合物。
如本文所用，术语“纯化的”是指从其自然环境中移出的分子(例如，糖脂)被分离或分开。例如，在一些实施方式中，在本公开的方法中使用的糖脂是纯化的糖脂(例如从一种或多种生物体/植物中分离的AFGL)，其不含与它们天然相关的其他组分(即，不存在其它组分的可检测光谱信号(例如，用Varian UNITY Plus 600MHz FT-NMR光谱仪获得的1H NMR信号))(例如，蛋白质(例如AFP))。
如本文所用，“基本上纯化的”分子(例如，基本上纯化的糖脂)不含至少50％，或不含至少90％，或至少95％，或不含至少99％的与它们天然相关的其它组分。例如，在一些实施方式中，用于本公开内容的方法的糖脂是基本上纯化的糖脂(例如从一种或多种生物体/植物中分离的AFGL)，其不含至少50％，或不含至少90％，或至少95％，或不含至少99％的与它们天然相关的其他组分(例如，蛋白质(如AFP))。
如本文所用，术语“无菌”意指不含活细菌，微生物和能够增殖的其他生物体。
如本文所用，术语“基本上不含冷冻保护剂”是指冷冻保护剂的量小于0.01w/w％。在一些实施方式中，本公开的方法可以使用和/或获得基本上不含冷冻保护剂，例如DMSO的培养基/溶液和/或细胞材料。
实施方式
本公开涉及用于保存活材料/样品/器官/组织/细胞的方法(术语“材料”，“样品”，“器官”，“组织”和“细胞”可互换使用并包括任何含有细胞组分的活生物材料)。
本公开的方法包括使细胞与含有至少一种糖脂(和任选的冷冻保护剂)的溶液接触。在一些实施方式中，这可以包括在含有至少一种糖脂(和任选的冷冻保护剂)的培养基/溶液中孵育细胞，例如在含有至少一种糖脂(和任选的冷冻保护剂)的培养基中孵育(或接触)细胞。在实施方式中，所述至少一种糖脂可以以有效提供更有利于细胞存活的环境的量存在于培养基/溶液中(甚至对于难以保存的细胞，如角质形成细胞，肝细胞和心肌细胞)。
在本发明的方法中，细胞在与至少一种糖脂(和任选的冷冻保护剂)接触后在冷冻保存期间受到保护，这在将细胞冷却至冷冻保存温度之前发生。在实施方式中，与至少一种糖脂(和任选的冷冻保护剂)接触意味着使细胞以某种方式与至少一种糖脂(和任选的冷冻保护剂)接触，使得在温度降低至冷冻保存温度期间，由于细胞已经被冷冻保存组合物中的至少一种糖脂(和任选的冷冻保护剂)稳定/保护，因此细胞的活力不会出现显著恶化。
适用于本公开的方法的糖脂可包括任何糖脂，例如美国专利号8,604,002中描述的AFGL，其公开内容通过引用全文纳入本文，其具有抑制/减少/防止结冰的结构。在这方面，合适的糖脂，例如AFGL，可具有防止细胞外冰致死地扩散到细胞质中的结构。在一些实施方式中，合适的糖脂(例如AFGL)可以具有这样的结构，使得该糖脂是产生热滞后(TH)的糖脂，例如能够以防止细胞外冰致死地扩散到胞质溶胶的方式而相对于正被冷冻保存的活细胞材料定位(例如，细胞膜的外表面上)的糖脂。在一些实施方式中，该取向可以在细胞表面上放置冰结合基序。合适的糖脂(实现上述功能)可包括，例如，基于木糖甘露聚糖的抗冻糖脂，例如糖脂，其中甘露糖和木糖是主要的糖组分(具有可变量的脂质，例如脂肪酸)，其中美国专利号8,604,002中描述了这些。
AFGL的分离/产生描述于美国专利号8,604,002。简而言之，可以使用膜提取然后通过冰结合方法从天然来源分离和纯化AFGL，或者它们可以通过化学和/或酶促过程合成。自然产生AFGL的植物，尤其是多年生植物，如欧白英(Solanum dulcamara)(苦甜藤)，是这些材料的有利来源。这些植物可以作为农作物种植，在AFGL产生后在秋季的适当时间收获，然后可以提取和纯化AFGL用于各种抗冻应用。
在动物，植物，细菌和真菌中已经描述了热滞后(TH)，热滞后是溶液的熔点和凝固点之间的差异，指示存在大分子量抗冻剂(例如抗冻蛋白)。来自耐冻甲虫皱翅甲(Upisceramboides)的高活性热滞后因子(THF)已通过冰亲和分离。氨基酸色谱分析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，紫外-可见分光光度法和核磁共振光谱分析表明，THF含有很少或没有蛋白质，但在5mg/mL时产生3.7±0.3℃的TH，与最活跃的昆虫抗冻蛋白相当。组成和结构分析表明，该抗冻剂含有β-甘露吡喃糖基-(1→4)β-木吡喃糖骨架和脂肪酸组分，其中脂质可与糖共价连接或与糖静电(离子)结合。
在一些实施方式中，本公开内容的方法中使用的糖脂可以具有很少或没有与其相关的蛋白质，并且具有显著的热滞后特性。例如，在本公开的方法中使用的糖脂可以包括抗冻糖脂组合物，其包含以下的多糖部分：
其中D-Manp代表D-甘露吡喃糖部分，D-Xylp代表D-木吡喃糖部分，n为约5至约70；和一个或多个脂质部分，与上式的多糖部分共价连接或与上述多糖部分静电缔合。
用于本公开内容的方法的糖脂可以是糖脂偶联物的集合，或者可以是与脂质部分(例如脂肪酸)静电缔合(例如通过离子键合)的木糖甘露聚糖多糖的集合。例如，本公开的方法可包括一种或多种下式的糖脂：
其中亲脂部分(RL)与糖组分之一，两者或其组合共价键合；脂质部分(RL)可以直接(例如，通过醚或酯基团)与糖部分共价键合，或者它可以通过连接基团如甘油与糖部分键合。
在一些实施方式中，本公开内容的方法中使用的糖脂可以是可与脂质部分静电缔合的木糖甘露聚糖多糖，如下式所示：
其中亲脂部分是，例如，被一个或多个羟基或羧基取代的烷基链，脂肪酸，甘油单酯，甘油二酯或甘油三酯，甾醇或磷脂。
在一些实施方式中，亲脂性部分RL可以是通过静电相互作用或通过直接共价键合与糖链缔合的任何脂质分子或部分。脂质分子可以是，例如，烷基链，脂肪酸，甘油单酯，甘油二酯或甘油三酯，甾醇或磷脂。当脂质分子与糖链共价键合时，共价键合可以在糖链的任何羟基上(例如，在C2，C3，C4(当不与另一糖部分连接时)，C6，或异头位置C1处)。偶联可以存在于一种或多种甘露糖，一种或多种木糖或其组合上。
在一些实施方式中，本公开内容的方法中使用的糖脂可包括如下的多糖部分：
其中n为约5至约70，并且每个Rx可独立地为H或亲脂部分RL，其中分子的至少一个Rx为RL。当组合物是木糖甘露聚糖和脂质部分的静电缔合时，木糖甘露聚糖可以是下式的糖：
其中脂质部分与上式糖类的一个或多个氧原子静电缔合。在一些实施方式中，本公开的方法中使用的糖脂可以是各种已知AFGL的组合，例如美国专利号8,604,002中描述的那些，例如美国专利号8,604,002的式VI的多糖和式VII的多糖的组合，其中一些脂质部分与多糖共价键合，而其它脂质部分与美国专利号8,604,002的式VI和/或式VII的多糖离子缔合。
在一些实施方式中，在本公开的方法中，含有至少一种糖脂(和任选的冷冻保护剂)的水性培养基(术语“培养基”和“溶液”可互换使用)可以与细胞组合以制备包含细胞悬浮液的冷冻保存组合物。为了这些目的，水性培养基可含有任何合适浓度的至少一种糖脂(和任选的冷冻保护剂)。
在一些实施方式中，在本公开的方法中以一定量使用至少一种糖脂，使得其导致活细胞材料/样品的活力(冷冻保存后)改善，所述活细胞材料/样品选自器官，细胞和组织，如哺乳动物器官，哺乳动物细胞和哺乳动物组织(包括随后可移植的那些组织)。短语“改善的细胞活力”或“改善的活力”是指，例如，细胞活力(％)为至少60％，例如80％或更高。改善的细胞活力(％)可以是50％或更多，60％或更多，70％或更多，73％或更多，75％或更多，77％或更多，80％或更多，83％或更多，85％或更多，87％或更多，90％或更多，93％或更多，95％或更多，97％或更多，98％或更多，或99％或更多。
在一些实施方式中，在本公开的方法中以一定量使用至少一种糖脂，使得其有效实现以下一种或多种：产生热滞后，抑制冰成核，改变冰结构，减少结冰的形成，防止冰的形成，以能够使用更快的冷却速率的程度减少/防止冰的形成，以减少提供更有利于细胞在难以保存细胞和组织的情况下存活的环境所需的冷冻保护剂的量的程度减少/防止冰的形成。
在一些实施方式中，所述至少一种糖脂占包含待保存细胞的培养基总重量的约0.000001％至约0.5％，例如占包含待保存细胞的培养基总重量的约0.00001％至约0.1％，或包含待保存细胞的培养基总重量的约0.0005％至约0.05％。
在一些实施方式中，至少一种糖脂可以实现预期结果的任何所需/有效量存在。在一些实施方式中，至少一种糖脂可以大于约0.01pg/ml的量，例如以大于约0.1pg/ml的量，或以大于约1pg/ml的量，或者，大于约10pg/ml的量，或者大于约200pg/ml的量存在于培养基中。在一些实施方式中，至少一种糖脂以大于约0.01ng/ml的量，例如以大于约0.1ng/ml的量，或以大于约1ng/ml的量，或者，大于约10ng/ml的量，或者大于约200ng/ml的量存在于培养基中。在一些实施方式中，至少一种糖脂以大于约0.01μg/ml的量，例如以大于约0.1μg/ml的量，或以大于约1μg/ml的量，或者，大于约10μg/ml的量，或者大于约200μg/ml的量存在于培养基中。
在一些实施方式中，培养基含有浓度范围为1pM至1000uM、1pM至500μM、1pM至30μM、1pM至1000nM、1pM至500nM、1pM至250nM、100pM至750μM、100pM至500μM、100pM至20μM、100pM至1000nM、1pM至750nM、1pM至500nM、1pM至250nM、1pM至1nM、500pM至500μM、500pM至250μM、500pM至100μM、500pM至10μM、500pM至1000nM、500pM至750nM、500pM至500nM、500pM至250nM、500pM至100nM、500pM至1nM、1nM至1000μM、1nM至750μM、1nM至500μM、1nM至250μM、1nM至100μM、1pM至1μM、100nM至1000μM、100nM至750μM、100nM至500μM、100nM至250μM、100nM至100μM、100pM至1μM、250nM至1000μM、250nM至750μM、250nM至500μM、250nM至250μM、250nM至100μM、250nM至1μM、500nM至1000μM、500nM至750μM，500nM至500μM、500nM至250μM、100nM至100μM、500nM至1μM、750nM至1000μM、750nM至750μM、750nM至500μM、750nM至250μM、750nM至100μM、750nM至1μM、0.5μM至1000μM、10μM至950μM、20μM至900μM、30μM至850μM、40μM至800μM、50μM至750μM、60μM至700μM、70μM至650μM、80μM至600μM、90μM至550μM、100μM至500μM、110μM至450μM、120μM，至400μM、130μM至350μM、140μM至300μM、150μM至250μM、160μM至200μM、0.5μM至100μM、1μM至90μM、5μM至90μM、10μM至85μM、10μM至75μM、20μM至85μM、20μM至65μM、30μM至70μM、30至50μM、40μM至80μM、或40μM至50μM的至少一种糖脂，其中在上述范围内发生的任何浓度也可以作为范围的终点。
在一些实施方式中，培养基含有浓度范围为0.001ppb至10,000ppm、0.01ppb至1,000ppm、0.1ppm至100ppm、1ppb至100ppm、1ppm至500ppm、1ppb至250ppm，100ppm至750ppm、100ppm至500ppm、100ppm至1000ppm、1ppm至750ppm、0.1ppm至500ppm、1ppb至250ppm、1ppb至1ppm、500ppb至500ppm、500ppb至250ppm、500ppb至100ppm、500ppb至10ppm、500ppb至1000ppm、500ppb至750ppm、500ppb至500ppm、50ppb至250ppm、1ppm至1000ppm、1ppm至750ppm、1ppm至500ppm、1ppm至250ppm、1ppm至100ppm、1ppm至1,000ppm、100ppm至1,000ppm、100ppm至750ppm、100ppm至500ppm、100ppm至250ppm、10ppm至950ppm、20ppm至900ppm、30ppm至850ppm、40ppm至800ppm、50ppm至750ppm、60ppm至700ppm、70ppm至650ppm、80ppm至600ppm、90ppm至550ppm、100ppm至500ppm、110ppm至450ppm、120ppm，至400ppm、130ppm至350ppm、140ppm至300ppm、150ppm至250ppm、160ppm至200ppm、0.5ppm至100ppm、1ppm至90ppm、5ppm至90ppm、5ppm至85ppm、5ppm至75ppm、2ppm至15ppm、2ppm至50ppm、3ppm至20ppm、3至50ppm、4ppm至80ppm、或4ppm至50ppm的至少一种糖脂，其中任何在上述范围内发生的浓度也可以作为范围的终点。
在实施方式中，包含至少一种糖脂的上述培养基可以与细胞或组织接触任何所需的持续时间，例如直至所述至少一种糖脂的所需剂量(例如有效剂量)存在于细胞或组织上以提供改善的活力(冷冻保存后)，和/或预防/防止组织损伤和/或实现以下一种或多种：产生热滞后，抑制冰成核，改变冰结构，减少冰的形成，防止冰的形成，以允许使用更快的冷却速率的程度减少/防止冰的形成，以减少提供更有利于细胞在难以保存细胞和组织的情况下存活的环境所需的冷冻保护剂的量的程度减少/防止冰的形成。
在一些实施方式中，待冷冻保存的细胞还可以与冷冻相容的pH缓冲液接触，所述缓冲液包含例如至少碱性盐溶液，能量源(例如葡萄糖)和能够在冷却的温度下维持中性pH的缓冲液。众所周知的这种材料包括例如达氏改良伊氏培养基(DMEM)。该材料也可作为冷冻保存组合物的一部分包括在内。参见，例如，Campbell等，“用双糖冷冻保存贴壁平滑肌和上皮细胞(Cryopreservation of Adherent Smooth Muscle and Endothelial Cellswith Disaccharides)”于：Katkov I.(编)《冷冻保存前沿》(Current Frontiers inCryopreservation).Croatia：In Tech(2012)；和Campbell等，″胰腺储液的开发：低温储存后β细胞存活和代谢状态的细胞保护性补充剂的初步筛选(Development of PancreasStorage Solutions：Initial Screening of Cytoprotective Supplements for β-cellSurvival and Metabolic Status after Hypothermic Storage)″Biopreservation andBiobanking 11(1)：12-18(2013)。
用于本公开的方法的冷冻保存组合物还可包含本领域已知的任何冷冻保护材料。在一些实施方式中，冷冻保护剂化合物在冷冻保存组合物中的存在量可以为，例如约0.05M至约11M、约0.1至约8M、约0.25至约11M、约1至约11M、约2至约11M、约4至约11M、约6至约11M、约8至约11M、约0.25至约11M、约0.25至约9M、约0.25至约8M、约0.25至约7M、约0.25至约10M、约1至约7M、约1至约8M、约1至约9M、约3至约10M、约2至约10M、约0.5至约10M、约0.5至约9M、约0.5至约9M、约0.5至约8M、或约0.5至约7M、或约6.5至约11M。在一些实施方式中，冷冻保护剂化合物在冷冻保存组合物中的存在量可以为，例如约0.05M至约6M、约0.1至约3M、约0.25至约6M、约1至约6M、约2至约6M、约3至约6M、约4至约6M、约5至约6M、约0.25至约1M、约0.25至约2M、约0.25至约3M、约0.25至约4M、约0.25至约5M、约1至约4M、约1至约3M、约1至约2M、约3至约5M、约2至约4M、约0.5至约6M、约0.5至约5M、约0.5至约4M、约0.5至约3M、约0.5至约2M、或约0.5至约1M。
在一些实施方式中，待保存的细胞可以在将待保存的细胞于含有至少一种糖脂的培养基中孵育之前，期间或之后与含有冷冻保护剂的组合物接触。
合适的冷冻保护剂可包括，例如，乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇(如2，3-丁二醇)，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己三醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺(如正二甲基甲酰胺)，二甲基亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，丙二醇(如1，2-丙二醇和1，3-丙二醇)，吡啶N-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖。可用于本公开的其他冷冻保护剂描述于Fahy等的美国专利号6,395,467；Wowk等的美国专利号6,274,303；Khirabadi等的美国专利号6,194,137；Fahy等的美国专利号6,187,529；Fahy等的美国专利号5,962,214；Calaco等的美国专利号5,955,448；Meryman的美国专利号5,629,145；和/或WO 02/32225 A2，其对应于Khirabadi等的美国专利申请号09/691,197，其公开内容各自通过引用全文纳入本文。
在本公开的一些实施方式中，含有冷冻保护剂的组合物可含有至少一种糖脂和至少一种糖。糖可以是糖的混合物，并且可以含有至少一种多糖，二糖，例如海藻糖和/或蔗糖，和/或三糖，例如棉子糖。该组合物可含有约0.1至2.0M糖，或约0.2至0.6M糖。含有冷冻保护剂的组合物可以是含糖脂的培养基。任选地，在冷冻或玻璃化细胞材料之前，可以将额外的糖和/或其他冷冻保护剂添加到该培养基中。
冷冻保护剂组合物还可包含至少一种环己二醇(CHD)化合物，例如1，3-环己二醇(1，3CHD)或1，4-环己二醇(1，4CHD)的顺式或反式形式，或其外消旋混合物，作为冷冻保护剂化合物。
CHD化合物在冷冻保存组合物中的存在量可以为，例如约0.05至约2M，约0.1M至约1M，约0.1至约2M，约0.1至约1M，约0.1至约1.5M，约0.1至约0.5M，约0.1至约0.25M，约1至约2M，约1.5至约2M，约0.75至约2M，约0.75至约1.5M，约0.75至约约1M，约0.05至约1M，约0.05至约0.75M，约0.05至约0.5M，或约0.05至约0.1M。冷冻保存组合物还可包括非常适合于细胞，组织和器官的器官储存的溶液。该溶液可以包括上述的缓冲液。该溶液可以是例如EuroCollins溶液，其包含右旋糖，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，碳酸氢钠和氯化钾。参见，例如，Taylor等，“Unisol与Euro-Collins溶液作为冷冻保护剂的载剂溶液的比较(Comparison of Unisol with Euro-Collins Solution as a Vehicle Solution forCryoprotectants)”，Transplantation Proceedings 33：677-679(2001)。
此外，用于本公开的方法的冷冻保存组合物还可以包括抗冻蛋白/肽(AFP)或“热滞后”蛋白(THP)。据信天然存在的AFP能够结合发展中的冰晶的棱镜面，从而改变它们的形成。在这方面，任何新发现的或众所周知的AFP都可以用于本方法中。参见，例如，Sicheri和Yang，Nature，375：427-431，(1995)，描述了八种这样的蛋白质；DeVries，“抗冻糖肽和肽：与冰和水的相互作用(Antifreeze glycopeptides and peptides：interactions withice and water)”，Meth.Enzymol.127：293-303(1986)；Duman，“陆地节肢动物中的抗冻和冰成核剂蛋白(Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrialarthropods)”，Annual Rev.Physiol.63：327-3257(2001)；Holmstrup等，“北极弹尾鱼的脱水和抗寒性(Dehydration and cold hardiness in the Arctic collembolanOnychiurus arcticus)”，J.Comp.Physiol.B 168：197-203(1998)；Kuiper等，“通过吸附到冰上纯化抗冻蛋白(Purification ofantifreeze proteins by adsorption to ice)”，Biochem.Biophys.Res.Commun.300(3)：64-68(2003)；Miller，“一些成年和未成熟昆虫在阿拉斯加内陆越冬的抗寒策略(Cold-hardiness strategies of some adult andimmature insects overwintering in interior Alaska)”，Comp.Biochem.Physiol.73A：595-604(1982)；Neven等，“昆虫血淋巴脂蛋白冰成核剂的纯化和表征：磷脂酰肌醇和载脂蛋白在冰成核剂活性中的重要性的证据(Purification and characterization of aninsect hemolymph lipoprotein ice nucleator：evidence for the importance ofphosphatidylinositol and apolipoprotein in the ice nucleator activity)”，J.Comp.Physiol.B 159：71-82(1989)；Sformo等，“在阿拉斯加甲虫红扁甲幼虫的深度过冷，玻璃化和有限存活至-100℃(Deep supercooling，vitrification and limitedsurvival to-100℃ in the Alaskan beetle Cucujus clavipes puniceus larvae)”，J.Exp.Biol.213(3)：502-509(2010)；Storey等，“动物的冷冻耐受性(Freeze tolerancein animals)”，Physiol.Rev.68：27-84(1988)；Storey等，“昆虫中对寒冷的生物化学适应(Biochemical adaptation for cold hardiness in insects)”，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B326：635-54(1990)；Walters等，“北极阿拉斯加石蝇，北极短尾石蝇(Nemoura arctica)的冻结耐受性(Freeze tolerance in the Arctic AlaskaStonefly，Nemoura arctica)”，J.Exp.Biol.212：305-12(2009a)；Walters等，“在冷冻耐受的阿拉斯加甲虫，拟步甲(Upis ceramboides)中冷冻保护剂生物合成和选择性积累苏糖醇(Cryoprotectant biosynthesis and the selective accumulation of threitol inthe freeze tolerant Alaskan beetle，Upis ceramboides)”J.Biol.Chem.284：16822-16831(2009b)；示例性AFP包括AFPI(I型AFP)，AFPIII(III型AFP)和/或AFGP，其公开内容各自通过引用全文纳入本文。对于每种存在的AFP来说，AFP在冷冻保存组合物中的量可为例如组合物的约0.001至约1mg/mL，约0.05至约0.5mg/mL，或约0.1至约0.75mg/mL。
在一些实施方式中，所述至少一种糖脂可以作为冷冻保护剂的替代物，例如DMSO，或作为这种其他冷冻保护剂的补充物以降低其浓度，例如降低至无毒浓度，在该浓度下对于在冷冻保存过程中保留经冷冻保存的材料/样品的同样多功能而言冷冻保护剂实现了相同或更好的保护作用。在一些实施方式中，在本公开的方法中以一定量使用至少一种糖脂，使得其作为活性材料/样品的冷冻保护剂有效，所述活性材料/样品选自器官，细胞和组织，例如哺乳动物器官，哺乳动物细胞和哺乳动物组织(包括随后可移植的那些)。
可以在本公开的方法中使用的细胞可以是任何合适的细胞组合物。在一些实施方式中，细胞可以是皮肤细胞，角质形成细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，肺细胞，肠系膜细胞，脂肪细胞，干细胞，肝细胞，上皮细胞，库普弗细胞，成纤维细胞，神经元，心肌细胞，肌细胞，软骨细胞，胰腺腺泡细胞，朗格汉斯胰岛，骨细胞，成肌细胞，卫星细胞，内皮细胞，脂肪细胞，前脂肪细胞，胆管上皮细胞和任何这些细胞类型的祖细胞。
在一些实施方式中，本公开的方法中使用的细胞可以来自任何合适的动物物种，例如哺乳动物，例如人，犬科(例如狗)，猫科(例如猫)，马科(例如马)，猪科，绵羊，山羊或牛科哺乳动物。
用于制备包含至少一种含糖脂的细胞悬浮液的冷冻保存组合物的细胞组合物可以以各种方式与至少一种糖脂组合。在一些实施方式中，细胞组合物可以与含有至少一种糖脂的水性液体培养基(例如水溶液)组合。在这方面，可以将细胞组合物添加到含有至少一种糖脂的培养基中，可以将含有至少一种糖脂的培养基添加到细胞组合物中，或两者。例如，可以进行逐渐组合，任选地轻柔搅拌。
在一些实施方式中，例如当先前保存的活细胞组合物用于形成冷冻保存组合物时，如果细胞组合物被冷却或冷冻，则可以在将其与至少一种含糖脂的培养基组合之前或之后将其解冻(和/或达到约37℃的温度)。可以使用任何合适的解冻/加热技术。
在一些实施方式中，为了实现细胞暴露于至少一种糖脂的积极效果，待保存的细胞可以在含至少一种糖脂的培养基中孵育(或暴露)至少3小时(在一些实施方式中，可能在较短的孵育/暴露时间内实现积极效果)，所述孵育(或暴露)在任何合适的温度(例如常温(或低温))，即足以使至少一种糖脂与细胞膜缔合的温度下。取决于待保存的细胞，这样的温度可以包括以下：室温至稍高于生理+37℃、室温至+40℃(前提是这种暴露不会导致细胞死亡)范围的温度、+25℃至+37℃范围的温度、+25℃至+35℃范围的温度、+25℃至+30℃范围的温度、-5℃至+20℃范围的温度、-5℃至+15℃范围的温度、-5℃至+10℃范围的温度、-5℃至+5℃范围的温度、0℃至+10℃范围的温度、0℃至+9℃范围的温度、0℃至+8℃范围的温度、0℃至+7℃范围的温度、0℃至+6℃范围的温度、0℃至+5℃范围的温度、0℃至+5℃范围的温度、0℃至+4℃范围的温度、0℃至+3℃范围的温度、0℃至+2℃范围的温度、+1℃至+8℃范围的温度、+1℃至+6℃范围的温度、+1℃至+4℃范围的温度、+1℃至+3℃范围的温度、+2℃至+9℃范围的温度、+2℃至+6℃范围的温度、+2℃至+4℃范围的温度、+3℃至+8℃范围的温度、+3℃至+6℃范围的温度、+3℃至+5℃范围的温度、+4℃至+8℃范围的温度、+4℃至+6℃范围的温度、+5℃至+9℃范围的温度、+5℃至+7℃范围的温度、+6℃至+10℃范围的温度、+6℃至+8℃范围的温度、+7℃至+9℃范围的温度、和+8℃至+10℃范围的温度。
在实施方式中，在本公开的方法中，待保存的细胞可以在含至少一种糖脂的培养基(具有至少一种糖脂的上述浓度之一)中孵育至少6小时，或至少12小时，或至少18小时，或至少24小时，或至少48小时，或至少72小时。在一些实施方式中，待保存的细胞可以孵育3至120小时，或者孵育更长的时间，例如通过将至少一种糖脂掺入用于维持细胞的细胞培养基中。在一些实施方式中，在本公开的方法中，细胞可以在包含至少一种糖脂的培养基中孵育6-72小时，或12-48小时，或18-46小时，或18-36个小时。
在一些实施方式中，细胞可以例如用另一种生理学上可接受的培养基洗涤，然后与含至少一种糖脂的培养基组合。
细胞与含至少一种糖脂的培养基的组合可以在任何合适的容器或器皿中进行。
制备的包括含至少一种糖脂的细胞悬浮液的冷冻保存组合物可具有任何合适密度的细胞。然后可以以任何方式进行的任何方式对冷冻保存组合物进行冷却/储存/加热，并且可以使用上述那些以外的任何其他材料。例如，在一些实施方式中，冷冻保存组合物可用于提高活冷冻保存的细胞材料的产量的方法，包括：将细胞材料暴露于含有至少一种糖脂和冷冻保护剂的培养基中预定的时间以形成冷冻保存组合物；使冷冻保存组合物经过包括在冷冻保存温度下冷冻保存的保存方案，例如下文描述的温度之一，例如约-80℃或更低，其中保存方案包括以下文所述的冷却速率冷却细胞材料，例如大于约-6.0℃/分钟；并且完成保存方案后，回收冷冻保存的细胞物质；其中，回收的冷冻保存的细胞物质的细胞活力(％)(例如，达到上述程度/程度(例如至少60％的细胞活力(％))相对于除了不使用至少一种糖脂以外相同的条件下的保存方案，例如单独使用单独的冷冻保护剂，如DMSO作为冷冻保护剂，至少60％得到改善。在一些实施方式中，回收的冷冻保存的细胞材料表现出改善的增殖性生长。在一些实施方式中，回收的冷冻保存的细胞物质的细胞活力(％)至少比通过在除了不使用至少一种糖脂(例如单一冷冻保护剂，如DMSO单独用作冷冻保护剂)以外相同的条件下进行保存方案所获得的细胞活力(％)大一个数量级，或者比通过在除了不使用至少一种糖脂(例如单一冷冻保护剂，如DMSO单独用作冷冻保护剂)以外相同的条件下进行保存方案所获得的细胞活力(％)大至少两个数量级，或者比通过在除了不使用至少一种糖脂(例如单一冷冻保护剂，如DMSO单独用作冷冻保护剂)以外相同的条件下进行保存方案所获得的细胞活力(％)大至少三个数量级，或者比通过在除了不使用至少一种糖脂(例如单一冷冻保护剂，如DMSO单独用作冷冻保护剂)以外相同的条件下进行保存方案所获得的细胞活力(％)大至少1-3个数量级。
一旦制备了冷冻保存组合物(并且至少一种糖脂与待保存的细胞有效缔合)，冷冻保存的冷却可以以任何方式进行，并且可以使用上述那些以外的任何其他材料来进行。例如，在充分暴露于至少一种糖脂后，待保存的细胞经过保存方案。该保存方案可包括冷却待保存的细胞和/或干燥待保存的细胞。例如，可以通过冷冻，玻璃化，冷冻干燥和干燥来保存细胞。在以下专利和公开中描述了通过这些技术保存细胞材料的方案：Fahy等的美国专利号6,395,467；Wowk等的美国专利号6,274,303；Khirabadi等的美国专利号6，194,137；Fahy等的美国专利号6,187,529；Toner等的美国专利号6，127,177；Fahy等的美国专利号5,962,214；Calaco等的美国专利号5,955,448；Beattie等的美国专利号5,827,741；Goodrich等的美国专利号5,648,206；Meryman的美国专利号5,629,145；Rudolph等的美国专利号5,242,792；和WO 02/32225 A2，其对应于Khirabadi等的美国专利申请号09/691,197，其公开内容各自通过引用全文纳入本文。
保存方案的冷冻保存部分通常包括将细胞冷却至远低于水的冰点的温度，例如至约-80℃或更低，更通常至约-130℃或更低。可以使用本领域技术人员已知的任何冷冻保存方法。例如，用于冷冻保存的冷却(冷冻)方案可以是任何合适的类型，其中冷冻保存温度可以低于约-20℃、(即更冷)，例如约-80℃或更低(即更冷)，或约-135℃或更低(即更冷)。在一些实施方式中，冷冻保存温度可以在约-20℃至约-200℃，或约-30至约-175℃，或约-50℃至约-160℃，或约-65℃至约-150℃，或约-75℃至约-135℃，或约-80℃至约-130℃，或约-90℃至约-125℃，或约-100℃至约-115℃的范围内。
在一些实施方式中，保存方案可包括从冰成核点到-80℃或任何上述公开的冷却温度的连续速率冷却，冷却速率取决于被冷冻的细胞/组织的特性。例如，用于冷冻保存的冷却(冷冻)方案可处于任何合适的速率，例如速率(和/或平均冷却速率，例如从样品的初始温度到冷冻保存温度)可以大于约-0.1℃/分钟，或大于约-4.0℃/分钟，或大于约-6.0℃/分钟，或大于约-8.0℃/分钟，或大于约-10.0℃/分钟，或大于约-14.0℃/分钟，或大于每分钟约-25.0℃/分钟。冷却速率(和/或平均冷却速率)，例如，对于连续速率冷却(或其他类型的冷却)，可以是，例如，约-0.1℃至约-10℃/分钟或约-1℃至约-2℃/分钟。冷却速率可以是约-0.1至约-9℃/分钟，约-0.1至约-8℃/分钟，约-0.1至约-7℃/分钟，约-0.1至约-6℃/分钟，约-0.1至约-5℃/分钟，约-0.1至约-4℃/分钟，约-0.1至约-3℃/分钟，约-0.1至约-2℃/分钟，约0.1至约-1℃/分钟，约0.1至约-0.5℃/分钟，约-1至约-2℃/分钟，约-1至约-3℃/分钟，约-1至约-4℃/分钟，约-1至约-5℃/分钟，约-1至约-6℃/分钟，约-1至约-7℃/分钟，约-1至约-8℃/分钟，约-1至约-9℃/分钟，约-1至约-10℃/分钟，约-2至约-3℃/分钟，约-2至约-5℃/分钟℃，约-2至约-7℃/分钟，约-2至约-8℃/分钟，约-2至约-20℃/分钟，约-4至约-10℃/分钟，约-4℃/分钟至约-8℃/分钟，约-4至约-6℃/分钟，约-6至约-10℃/分钟，约-6至约-9℃/分钟，约-6至约-8℃/分钟，约-6至约-7℃/分钟，约-7至约-10℃/分钟，约-7至约-9℃/分钟，约-7至约-8℃/分钟，约-8至约-9℃/分钟，约-9至约-10℃/分钟，约-7至约-30℃/分钟，约-10至约-25℃/分钟，约-15至约-25℃/分钟，约-20至约-25℃/分钟，或约-20至约-30℃/分钟。
一旦通过这种连续速率冷却将细胞冷却至约-40℃至-80℃或更低，它们可以转移至液氮或液氮的气相以进一步冷却至冷冻保存温度，该温度通常低于冷冻溶液的玻璃化转化温度。可将细胞冷却至约-40℃至约-75℃，约-45℃至约-70℃，约-50℃至约-60℃，约-55℃至约-60℃，约-70℃至约-80℃，约-75℃至约-80℃，约-40℃至约-45℃，约-40℃至约-50℃，约-40℃至约-60℃，约-50℃至约-70℃，或约-50℃至约-80℃，然后进一步冷却至冷冻保存温度。
升温方案可以包括两步加温过程(例如Campbell等，用于解冻冷冻保存细胞的两步方法(Two stage method for thawing cryopreserved cells)中所述；参见例如美国专利号6,596,531，其公开内容通过引用全文纳入本文)。在两步升温方案中，可以从冷冻保存冷冻器中取出冷冻保存的细胞(在冷冻保存温度下冷冻保存)。冷冻保存的细胞首先在两步方案的第一步中的第一环境中缓慢升温。环境不需要经过任何特殊处理或具有任何特殊组成，并且可以使用任何环境。环境可以是气态气氛，例如空气。为实现第一步的缓慢升温，环境可能处于大于冷冻温度的第一升温温度下。第一升温温度可能接近室温。例如，可以使用30℃或更低，例如约15℃至约30℃，约20℃至约25℃，或约20℃至约30℃的温度。
两步升温过程的第二步包括在第二升温温度下的第二升温环境中快速解冻细胞，第二升温温度高于第一升温步骤中使用的升温温度。第二升温温度可以是32℃或更高，约32℃至约50℃，约35℃至约45℃，约40℃至约50℃，约45℃至约50℃，约32℃至约40℃，约35℃至约40℃，或约37℃。同样，任何合适的环境，例如气体(空气)，液体或流化床可用作第二环境。例如，可以使用升温温度的水浴来实现这种快速解冻。
在实施方式中，通过本公开的方法保存的冷冻保存的细胞可以用于任何合适的用途，包括例如研究或治疗用途。例如，关于治疗用途，可以将冷冻保存的细胞给予人或动物患者以治疗或预防疾病或病症，例如退行性骨病，骨关节炎，类风湿性关节炎，多关节炎，系统性红斑狼疮，炎性肠病，特应性，肝炎，慢性类固醇反应性脑膜炎-动脉炎，比格犬疼痛综合征，退行性脊髓病，慢性肾功能衰竭病，扩张和二尖瓣心肌病，干燥性角膜结膜炎，免疫介导的非糜烂性关节炎，免疫介导的溶血性贫血，免疫介导的血小板减少症，伊文氏综合征，椎间盘疾病，继发于疾病或创伤的肌肉纤维化，难治性角膜溃疡，糖尿病，脊柱外伤，嗜酸性肉芽肿复合体，肥厚性心肌病，胆管炎，脊髓损伤，运动性肺出血，横纹肌溶解症，角膜溃疡，湿疹，多发性硬化，肌营养不良，脊髓损伤，糖尿病，肝炎，心肌梗塞，充血性心力衰竭或肌肉纤维化。
冷冻保存的细胞可以以任何合适的方式给予患者。在一些实施方式中，冷冻保存的细胞可以全身递送到患者的血流中，例如通过递送到静脉或动脉中。在一些实施方式中，冷冻保存的细胞可以局部递送给患者(例如，治疗特应性或其他皮肤病)。在一些实施方式中，可以将冷冻保存的细胞递送至患者的局部植入部位。这些给药方式中的任何一种或任何组合可用于治疗患者。
在一些实施方式中，第一量的含至少一种糖脂的冷冻保存的细胞可以全身递送到患者的血流中，并且第二量的含至少一种糖脂的冷冻保存的细胞(例如，与第一量一起或分开制备，并且包括相同类型或不同类型的细胞)可以局部植入患者的一个或多个骨骼关节中或附近以治疗关节炎病症，例如本文确定的任何关节炎病症。此外，在本文的患者治疗中，在一些实施方式中可以进行含至少一种糖脂的冷冻保存的细胞的单次给药，而在其他实施方式中，可以随着时间的推移进行含至少一种糖脂的冷冻保存的细胞的多次分开给药(例如，每周或每月给药)。在其他实施方式中，可以在给予患者之前过滤含至少一种糖脂的冷冻保存的细胞。例如，含至少一种糖脂的冷冻保存的细胞可以通过位于管中的在线过滤器，细胞悬浮液通过该过滤器进入患者的血流，例如进入患者的静脉或动脉。在某些变体中，这种过滤器可具有约200微米或更低的粒度截止值(即，从通过中排除具有大于约200微米的最大横截面尺寸的颗粒)，或者约170微米或更低的粒度截止值，或者约100微米或更低的粒度截止值，同时允许单个悬浮细胞通过过滤器。
在一些实施方式中，提供含有至少一种糖脂的水性介质，所述糖脂可用于制备包含含至少一种糖脂的冷冻保存细胞的冷冻保存组合物。含有至少一种糖脂的水性培养基可含有这些组分，以一定含量，如本文所述。另外，含有至少一种糖脂的水性培养基可以无菌形式提供在试剂盒中包含的容器中。该容器可以是小瓶，袋或其他容器。在一些实施方式中，容器可包括“第二容器”，其中可制备含至少一种糖脂的细胞悬浮液，其包括例如具有入口或其他构件(例如针隔膜)和单独的出口。本文公开的试剂盒可包括容器，所述容器包含：含至少一种糖脂的水性培养基以及一种或多种另外的组分，该容器例如包括液体转移装置如注射器和附着或可附着的针，并且所述试剂盒还可能包含含有细胞组合物的容器，用于制备包含含至少一种糖脂的细胞悬浮液的冷冻保存组合物。含有细胞组合物的容器可以包括处于冷冻保存状态(例如用试剂盒冷冻运输的)或非冷冻保存的(例如解冻的，其中细胞先前是冷冻保存的)状态的组合物。本文公开的试剂盒还可以包括至少一个过滤器，其中例如经冷冻保存的含至少一种糖脂的细胞悬浮液可以在给予患者之前通过该过滤器，和/或管道，其中细胞悬浮液可以在给予患者期间通过该管道。
在第一方面，本公开涉及一种保存活细胞材料的方法，包括：将细胞材料暴露于含有至少一种糖脂和冷冻保护剂的培养基中预定的时间；并且在暴露之后，使细胞材料经过包括在约-80℃或更低的低温保存温度下冷冻保存的保存方案。在第二方面，第一方面的方法可以是其中至少一种糖脂是抗冻糖脂的方法。在第三方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中从至少一种选自植物和昆虫的成员中分离抗冻糖脂。在第四方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中所述至少一种糖脂是从选自下组的一个或多个成员分离的抗冻糖脂：三带大蚊(Tipula trivittat)，宽锹甲(Ceruchus piceus)，欧白英(Solanum dulcamara)，赤翅甲(Dendroides canadensis)和红扁甲(Cucujus clavipes)。在第五方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中所述至少一种糖脂是基于木糖甘露聚糖的抗冻糖脂。在第六方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中所述至少一种糖脂包含β-甘露吡喃糖基-(1→4)β-木吡喃糖骨架和亲脂部分。在第七方面，第六方面的方法可以是这样的方法，其中亲脂部分选自：被一个或多个羟基取代的烷基链；被一个或多个羧基取代的烷基链；脂肪酸；单甘油酯；二甘油酯；三甘油酯；甾醇和磷脂。在第八方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中保存方案包括以大于6℃/分钟的冷却速率将细胞材料从37℃冷却至培养基的冷冻温度。在第九方面，第八方面的方法可以是这样的方法，其中保存方案包括以10至30℃/分钟的冷却速率将细胞材料从37℃冷却至培养基的冷冻温度。在第十方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中细胞材料在使细胞材料经过保存方案之前暴露于培养基至少3小时。在第十一方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中细胞材料在使细胞材料经过保存方案之前暴露于培养基6-72小时。在第十二方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中保存方案包括冷却培养基中的细胞材料，其中培养基含有浓度范围为1pM至1000μM的至少一种糖脂。在第十三方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中保存方案包括冷却培养基中的细胞材料，其中培养基含有浓度范围为1pM至1nM的至少一种糖脂。在第十四方面，任何上述方面的方法可以是这样的方法，其中冷冻保护剂选自下组：乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己三醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，丙二醇，吡啶N-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖。在第十五方面，第十四方面的方法可以是这样的方法，其中培养基是冷冻保护剂组合物，并且冷冻保护剂在冷冻保护剂组合物中的存在量为约0.05M至约11M。在第十六方面，第十四方面的方法可以是这样的方法，其中培养基是冷冻保护剂组合物，并且冷冻保护剂以低于1M的浓度存在于冷冻保护剂组合物中。在第十七方面，第十六方面的方法可以是这样的方法，其中将包含至少一种糖的另外的冷冻保护剂添加到冷冻保护剂组合物中。在第十八方面，第十七方面的方法可以是这样的方法，其中另外的冷冻保护剂选自海藻糖，葡萄糖，甘油，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲基葡萄糖，棉子糖，核糖，蔗糖和木糖。在第十九方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料选自器官，细胞和组织的方法。在第二十方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料选自角质形成细胞，肝细胞和心肌细胞的方法。在第二十一方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料选自哺乳动物器官，哺乳动物细胞和哺乳动物组织的方法。在第二十二方面，任何上述方面的方法可以是其中细胞材料选自人器官，人细胞和人体组织的方法。在第二十三方面，任何上述方面的方法可以是在完成保存方案后细胞材料的细胞活力(％)为至少60％的方法。在第二十四方面，任何上述方面的方法可以是其中培养基不含抗冻蛋白/肽的方法。
本公开涉及通过任何上述方面和/或通过以下获得的冷冻保存的细胞：将活细胞材料暴露于含有至少一种糖脂和冷冻保护剂的培养基预定的时间；并且在暴露之后，使细胞材料经过保存方案；其中保存方案后细胞材料的细胞活力(％)为至少60％。在另一方面，本公开涉及一种方法，包括向患者给予权利要求25所述的冷冻保存的细胞。
在另一方面，本发明涉及提高活的冷冻保存的细胞材料的产量的方法，包括：将细胞材料暴露于含有至少一种糖脂和冷冻保护剂的培养基中预定的时间以形成冷冻保存组合物；使冷冻保存组合物经过包括在约-80℃或更低的冷冻保存温度下的冷冻保存的保存方案，其中保存方案包括以大于约-6.0℃/分钟的冷却速率冷却细胞材料；并且完成保存方案后，回收冷冻保存的细胞材料；其中回收的冷冻保存的细胞材料的细胞活力(％)为至少60％。这里，(i)回收的冷冻保存的细胞材料可以表现出改善的增殖性生长，(ii)回收的冷冻保存的细胞材料的细胞活力(％)比在相同条件但仅使用DMSO作为冷冻保护剂的情况下进行保存方案所实现的细胞活力(％)大至少两个数量级，和/或(iii)回收的冷冻保存的细胞材料的细胞活力(％)比在相同条件但仅使用DMSO作为冷冻保护剂的情况下进行保存方案所实现的细胞活力(％)大至少三个数量级。在上述这些方面中，冷却速率在约-6至约-40℃/分钟的范围内，或者在约-6至约-20℃/分钟的范围内，或者在约-6至约-10℃/分钟的范围内。另外，(i)冷冻保护剂可选自：乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己三醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，丙二醇，吡啶N-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖；(ii)冷冻保护剂在冷冻保护剂组合物中的存在量为约0.05M至约11M。任选地，冷冻保护剂以低于1M的浓度存在于冷冻保护剂组合物中。在这些方面，(i)将包含至少一种糖的另外的冷冻保护剂加入到冷冻保护剂组合物中，(ii)另外的冷冻保护剂选自海藻糖，葡萄糖，甘油，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲基葡萄糖，棉子糖，核糖，蔗糖和木糖，(iii)细胞材料选自器官，细胞和组织，(iv)细胞材料选自角质形成细胞，肝细胞和心肌细胞，(v)细胞材料选自哺乳动物器官，哺乳动物细胞和哺乳动物组织，和/或(vi)细胞材料选自人器官，人细胞和人组织。此外，在这些方面，(i)回收的冷冻保存的细胞物质的细胞活力(％)为至少80％，(ii)冷冻保存组合物不含抗冻蛋白/肽，(iii)至少一种糖脂是一种抗冻脂糖，(iv)从至少一种选自植物和昆虫的成员中分离抗冻糖脂，(v)至少一种糖脂是从选自下组的一个或多个成员分离的抗冻糖脂：三带大蚊(Tipula trivittat)，宽锹甲(Ceruchus piceus)，欧白英(Solanum dulcamara)，赤翅甲(Dendroides canadensis)和红扁甲(Cucujus clavipes)，(vi)所述至少一种糖脂是基于木甘露聚糖的抗冻糖脂，(vii)所述至少一种糖脂包含β-甘露吡喃糖基-(1→4)β-木吡喃糖骨架和亲脂部分(亲脂部分可选自被一个或多个羟基取代的烷基链；被一个或多个羧基取代的烷基链；脂肪酸；单甘油酯；二甘油酯；三甘油酯；甾醇和磷脂)，和/或(viii)细胞活力(％)比在相同条件但仅使用DMSO作为冷冻保护剂的情况下下进行保存方案所获得的细胞活力(％)大1-3个数量级。
通过以下实施例可以更好地理解上述内容，提供以下实施例仅是为了说明目的，而非旨在限制本发明的范围。
实施例
在下面讨论的结果中，图1-4中的细胞活力和增殖的测量采用alamarBlueTM通过测量细胞内发生的氧化/还原反应来进行。将alamarBlueTM直接加入含有培养基中培养的细胞的平板中，并在37℃下孵育3小时。还原后，alamarBludTM会改变颜色，可以测量和量化这种颜色变化。使用Gemini EM荧光酶标仪(分子动力学公司(Molecular Dynamics))在544nm的激发波长和590nm的发射波长下读取培养平板。
除了在复温后立即测量活力，还使用alamarBlueTM检查细胞增殖的能力。由于alamarBlueTM无毒，因此可以反复使用而不会伤害细胞。在复温后，细胞可以每天37℃在alamarBlueTM中孵育3小时，连续持续几天。一旦读取平板，就去除alamarBlueTM并将细胞在常规细胞培养基中培养过夜直至第二天。代谢活动增加表明增殖。
虽然一些细胞，例如成纤维细胞，很容易冷冻保存，但其他细胞类型如角质形成细胞，肝细胞和心肌细胞不能很好地冷冻，细胞产量通常远低于50％，如图1所示(冷冻保存后的细胞活力)。角质形成细胞在含10％DMSO的RPMI中在小瓶中或培养板中冷冻保存。解冻后立即测量代谢活性，并在解冻后测量几天。将细胞活力(以未处理对照的百分比计)计算为120次重复的平均值(±SEM)。
为了获得分离的AFGL，使用不同的方案来减少蛋白质污染物的存在。使用的纯化过程的变化取决于分离AFGL的物种。1H NMR光谱用于确定AFGL的存在并确认冰纯化样品中不存在抗冻蛋白。从相应生物体(下文鉴定)中分离AFGL的方法是已知的。
下面描述的实验使用在1.0M二甲基亚砜(DMSO)中AFGL的连续稀释液进行，并与单独的1.0M DMSO溶液比较。
简而言之，将大鼠平滑肌细胞系A10以20,000个细胞/孔接种在96孔组织培养平板中，并在培养箱中放置过夜。第二天，将平板置于冰上，用0.5M甘露醇处理细胞，然后加入1.0M DMSO+/-AFGL。使细胞在冰上用1.0M DMSO+/-AFGL平衡约10分钟，然后将平板在速率受控的冷冻机中以-1.0℃/分钟冷却至-80℃下，该冷冻机还包括在约-6.0℃下的成核步骤。将平板储存过夜并在第二天解冻。为了解冻，将平板从储存(-135℃)中取出并在-20℃下放置30分钟，然后将其置于37℃的水浴中并快速解冻，然后置于冰上。使用含有0.5M甘露醇的细胞培养基稀释冷冻保护剂溶液，然后仅用细胞培养基洗涤。使细胞在培养箱中恢复60分钟，然后以10％体积加入alamarBlue并在37℃下放置3小时。使用荧光酶标仪在544nm的激发波长和590mm的发射波长下读板。针对仅在DMSO中冷冻保存的细胞计算细胞活力。如在下面的图2中可以看到的，在几种稀释度的AFGL存在下细胞存活大大提高，AFGL稀释度为1∶1000时是显著的，p＜0.05。
图2是用DMSO中连续稀释的三带大蚊(Tipula trivittat)AFGL冷冻保存后细胞存活的图示。在冷冻保存之前，将细胞暴露于1M DMSO中的AFGL。解冻后，用alamarBlue测量代谢活性。将细胞活力(以DMSO对照的百分比表示)计算为5次重复的平均值(±SEM)。*p＜0.05。
对于下一组实验，将A10细胞以20,000个细胞/孔接种在96孔组织培养平板中，并在培养箱中放置过夜。第二天，将平板置于冰上，用0.5M甘露醇处理细胞，然后加入1：1000稀释度的1.0M DMSO+/-AFGL。然后将该板以-1.0℃/分钟在速率受控的冷冻机中冷却至-80℃，该冷冻机还包括在约-6.0℃下的成核步骤。将平板储存过夜并在第二天解冻。为了解冻，将平板从储存(-135℃)中取出并在-20℃下放置30分钟，然后将其置于37℃的水浴中并快速解冻，然后置于冰上。使用含有0.5M甘露醇的细胞培养基稀释冷冻保护剂溶液，然后移出，然后仅用细胞培养基洗涤。使细胞在培养箱中恢复60分钟，然后以10％体积加入alamarBlue并在37℃下放置3小时。使用荧光酶标仪在544nm的激发波长和590mm的发射波长下读板。用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，然后在培养基中放置过夜。然后在接下来的几天中，再次用alamarBlue评估代谢活性，提供冷冻保存后细胞增殖潜力的指示。针对仅在DMSO中冷冻保存的细胞计算细胞活力。如图3所示，在AFGL中冷冻保存的A10细胞比在仅DMSO中冷冻保存的细胞有更好的活力，并且能够在解冻后连续几天增殖，在第2天达到平台期。
图3显示了与冷冻保存后A10细胞的细胞活力和增殖有关的数据。将A10细胞以20,000个细胞/孔接种，然后在1.0M DMSO+/-三带大蚊(Tipula Trivittat)AFGL中冷冻保存。在解冻后立即使用alamarBlue测量代谢活性，并持续解冻后测量数天以测量细胞增殖。将细胞活力(以DMSO对照的百分比表示)计算为5次重复的平均值(±SEM)。
在下面的一组实验中(类似于上面讨论的那些)，将在1.0M DMSO中的来自昆虫三带大蚊(Tipula trivittat)和宽锹甲(Ceruchus piceus)以及来自植物欧白英(Solanumdulcamara)的AFGL的连续稀释液用于冷冻保存另一种平滑肌细胞系，A7R5。
将冷冻保存在AFGL与DMSO中的细胞与仅在DMSO中冷冻保存的细胞进行比较。如图4所示，尽管最佳稀释度不同，但每种不同的AFGL糖脂均显示出比仅DMSO改善的细胞活力。图4说明了在具有3种不同AFGL糖脂的DMSO中冷冻保存后获得的关于细胞存活的数据。在冷冻保存之前，将细胞暴露于1M DMSO中的AFGL。解冻后，用alamarBlue测量代谢活性。将细胞活力(以DMSO对照的百分比表示)计算为3次重复的平均值(±SEM)。*p＜0.05。
在上述实验中，用从三带大蚊(Tipula trivittat)分离的AFGL冷冻保存的那些细胞在几种稀释度下显示出改善的活力。
然后进行进一步的实验以评估AFGL糖脂在不同冷却条件下改善细胞活力的能力。具体而言，使用更快的冷却速率，这通常导致大多数细胞类型的活力降低。在这些实验中使用内皮细胞系CPAE以及从三带大蚊(Tipula trivittat)、宽锹甲(Ceruchus piceus)和欧白英(Solanum dulcamara)分离的AFGL。此外，还添加了三种其他AFGL糖脂，其中包括从宽锹甲(Ceruchus piceus)成虫分离的第二AFGL以及从赤翅甲(Dendroides canadensis)和红扁甲(Cucujus clavipes)分离的AFGL。在前一天晚上以20,000个细胞/孔铺板细胞，然后如上所述在第二天在仅1.0M DMSO中或在1.0M DMSO(每种AFGL以10ppm稀释)中冷冻保存。解冻后，使用alamarBlue评估活力。结果显示在图4中，其显示了在具有从4种昆虫和1种植物物种获得的AFGL的DMSO中冷冻保存后的细胞存活，其中细胞在冷冻保存之前暴露于1MDMSO中的10ppm AFGL。解冻后，用alamarBlue测量代谢活性。将细胞活力(以DMSO对照的百分比表示)计算为6次重复的平均值(±SEM)。
如在上述实验中，当AFGL与1.0M DMSO一起用于冷冻保存时，观察到更大的活力。即使使用的AFGL减少了100倍，AFGL的存在也产生改善(例如，与图2和图4，和对细胞更不友好的冷冻保存条件相比)，因此，AFGL对细胞在次优冷却条件下的存活情况有更大影响。
上述说明书中提及的所有公开都通过引用纳入本文。对本公开所述组合物、方法和系统的多种改进和变动对本领域技术人员是显而易见的，而不偏离本公开的范围和精神。虽然已结合具体的优选实施方案对本公开作了描述，但应了解，如权利要求所述，本公开不应过分地受限于这些具体实施方案。

Claims (20)

1.一种保存活细胞材料的方法，包括：
将所述细胞材料暴露于含有至少一种糖脂和冷冻保护剂的培养基经过预定的时间；并且
在暴露之后，使所述细胞材料经过冷冻保存方案，所述冷冻保存方案包括在约-80℃或更低的冷冻保存温度下的冷冻保存。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种糖脂是从选自以下的一个或多个成员分离的抗冻糖脂：三带大蚊(Tipula trivittat)，宽锹甲(Ceruchus piceus)，欧白英(Solanum dulcamara)，赤翅甲(Dendroides canadensis)和红扁甲(Cucujus clavipes)。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种糖脂包含β-甘露吡喃糖基-(1→4)β-木吡喃糖骨架和亲脂部分，所述亲脂部分选自：被一个或多个羟基取代的烷基链；被一个或多个羧基取代的烷基链；脂肪酸；单甘油酯；二甘油酯；三甘油酯；甾醇和磷脂。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞材料暴露于培养基6-72小时，之后使所述细胞材料经过保存方案，并且所述保存方案包括以10-30℃/分钟的冷却速率将所述细胞材料从37℃冷却至所述培养基的冷冻温度。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述保存方案包括冷却所述培养基中的细胞材料，其中所述培养基含有1pM至1nM的浓度范围的至少一种糖脂。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基是冷冻保护剂组合物，并且所述冷冻保护剂在冷冻保护剂组合物中的存在量为约0.05M至约11M，所述冷冻保护剂选自：乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己三醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，丙二醇，吡啶N-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖。
7.如权利要求6所述的方法，其中将另外的冷冻保护剂加入到所述冷冻保护剂组合物中，所述另外的冷冻保护剂选自海藻糖，葡萄糖，甘油，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲基葡萄糖，棉子糖，核糖，蔗糖和木糖。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞材料选自角质形成细胞，肝细胞和心肌细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中在完成所述保存方案之后，所述细胞材料的细胞活力(％)为至少60％。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基不含抗冻蛋白/肽。
11.冷冻保存的细胞，其通过以下步骤获得：将活细胞材料暴露于含有至少一种糖脂和冷冻保护剂的培养基经过预定的时间；并且
在暴露之后，使所述细胞材料经过保存方案；其中经过所述保存方案之后的细胞材料的细胞活力(％)为至少60％。
12.一种方法，包括向患者给予如权利要求11所述的冷冻保存的细胞。
13.一种用于增加活的冷冻保存的细胞材料的产量的方法，包括：
将细胞材料暴露于含有至少一种糖脂和冷冻保护剂的培养基经过预定的时间以形成冷冻保存组合物；
将所述冷冻保存组合物经过保存方案，所述保存方案包括在约-80℃或更低的冷冻保存温度下的冷冻保存，其中
所述保存方案包括以大于约-6.0℃/分钟的冷却速率冷却所述细胞材料；并且
在完成所述保存方案之后，回收所述冷冻保存的细胞材料；其中所述回收的冷冻保存的细胞材料的细胞活力(％)为至少60％。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述回收的冷冻保存的细胞材料表现出改善的增殖性生长。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述回收的冷冻保存的细胞材料的细胞活力(％)比在相同条件但仅使用DMSO作为冷冻保护剂进行的保存方案所获得的细胞活力(％)大至少三个数量级。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述冷却速率的范围为约-6至约-10℃/分钟。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述冷冻保护剂在冷冻保护剂组合物中的存在量为约0.05M至约11M，并且所述冷冻保护剂选自下组：乙酰胺，琼脂糖，藻酸盐，丙氨酸，白蛋白，乙酸铵，抗冻蛋白，丁二醇，硫酸软骨素，氯仿，胆碱，环己二醇，环己二酮，环己三醇，葡聚糖，二乙二醇，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，赤藓糖醇，乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚，甲酰胺，葡萄糖，甘油，甘油磷酸酯，单乙酸甘油酯，甘氨酸，糖蛋白，羟乙基淀粉，肌醇，乳糖，氯化镁，硫酸镁，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲醇，甲氧基丙二醇，甲基乙酰胺，甲基甲酰胺，甲基脲，甲基葡萄糖，甲基甘油，苯酚，复合多元醇，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，脯氨酸，丙二醇，吡啶N-氧化物，棉子糖，核糖，丝氨酸，溴化钠，氯化钠，碘化钠，硝酸钠，亚硝酸钠，硫酸钠，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，三甘醇，乙酸三甲胺，尿素，缬氨酸和木糖。
18.如权利要求13所述的方法，其中将另外的冷冻保护剂加入到所述冷冻保护剂组合物中，所述另外的冷冻保护剂选自海藻糖，葡萄糖，甘油，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，甲基葡萄糖，棉子糖，核糖，蔗糖和木糖。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述细胞材料选自角质形成细胞，肝细胞和心肌细胞。
20.如权利要求13所述的方法，其中所述冷冻保护组合物不含抗冻蛋白/肽，并且所述至少一种糖脂包含β-甘露吡喃糖基-(1→4)β-木吡喃糖骨架和亲脂部分，所述亲脂部分选自：被一个或多个羟基取代的烷基链；被一个或多个羧基取代的烷基链；脂肪酸；单甘油酯；二甘油酯；三甘油酯；甾醇和磷脂。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111657267A (zh) * 2020-06-17 2020-09-15 科瑞百奥泰州生物技术有限公司 一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法
CN111749044A (zh) * 2020-07-03 2020-10-09 汕头方大印刷包装科技有限公司 一种抗冻处理剂及其应用方法
CN112075417A (zh) * 2020-09-30 2020-12-15 郑州佐爵生物科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法
CN113615682A (zh) * 2021-09-05 2021-11-09 内蒙古赛诺种羊科技有限公司 绵羊高渗络合剂精液稀释保存液及其应用方法
CN115279887A (zh) * 2020-03-02 2022-11-01 盖亚生物制药有限公司 高活性nk细胞的处理方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108094410B (zh) * 2018-01-26 2021-08-31 山东大学齐鲁医院 一种皮肤深低温保护剂及皮肤保存方法
BR112021018174A2 (pt) * 2019-03-13 2021-11-16 Membrane Protective Tech Inc Métodos e sistemas para a suplementação protetora durante depressão de temperatura.
CN114007416A (zh) * 2019-04-30 2022-02-01 明尼苏达大学董事会 用于细胞的冷冻保存的组合物和方法
CN110742060A (zh) * 2019-11-28 2020-02-04 郑州市和沐生物科技有限公司 一种脂肪组织的冻存方法
CN111972399B (zh) * 2020-08-06 2021-11-30 温州医科大学 维持肝细胞活性的保存液
WO2023080281A1 (ko) * 2021-11-05 2023-05-11 주식회사 프롬바이오 펙틴과 알라닌을 이용한 세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5071598A (en) * 1987-12-03 1991-12-10 California Institute Of Technology Cryoprotective reagent
EP1283670A4 (en) * 2000-05-16 2003-09-17 Gen Hospital Corp MICROINJECTION OF COLD PROTECTING AGENTS FOR CELL PRESERVATION
CN103068256A (zh) * 2010-08-25 2013-04-24 株式会社钟化 担子菌来源的冰结晶化抑制剂
US8604002B1 (en) * 2010-06-23 2013-12-10 University Of Notre Dame Du Lac Saccharide antifreeze compositions
US20150037783A1 (en) * 2012-03-14 2015-02-05 Membrane Protective Technologies, Inc. System and Substances for Cryopreservation of Viable Cells
US20160116454A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Lifeline Scientific, Inc. Selection of extracellular matrix components and/or matricellular proteins for improved post-cryopreservation cell viability and retention

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5045446A (en) 1988-08-26 1991-09-03 Cryopharm Corporation Lyophilization of cells
US5242792A (en) 1991-02-25 1993-09-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method for the preservation of red blood cells by lyophilization using glycerol or inositol with disaccharides
US5723282A (en) 1991-07-08 1998-03-03 The American National Red Cross Method of preparing organs for vitrification
US5955448A (en) 1994-08-19 1999-09-21 Quadrant Holdings Cambridge Limited Method for stabilization of biological substances during drying and subsequent storage and compositions thereof
US5629145A (en) 1995-03-24 1997-05-13 Organ, Inc. Cryopreservation of cell suspensions
US5827741A (en) 1996-11-19 1998-10-27 The Regents Of The University Of California Cryopreservation of human adult and fetal pancreatic cells and human platelets
WO1998019529A1 (en) 1996-11-07 1998-05-14 21St Century Medicine, Inc. A method for rapid cooling and warming of biological materials
US6127177A (en) 1998-09-11 2000-10-03 Massachusetts Institute Of Technology Controlled reversible poration for preservation of biological materials
AU6499299A (en) 1998-09-21 2000-04-10 21St Century Medicine, Inc. Polyvinyl alcohol compounds for inhibition of ice growth
US6194137B1 (en) 1999-04-13 2001-02-27 Organ Recovery Systems, Inc. Method of cryopreservation of blood vessels by vitrification
WO2001078504A2 (en) 2000-04-17 2001-10-25 Organ Recovery Systems, Inc. Novel warming method of cryopreserved specimens
WO2002000228A1 (fr) * 2000-06-29 2002-01-03 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Composition ophtalmique contenant de l'oxygene
AU1179202A (en) 2000-10-19 2002-04-29 Organ Recovery Systems Method of cryopreservation of tissues or organs other than a blood vessel by vitrification
WO2007077562A2 (en) * 2006-01-04 2007-07-12 Do-Coop Technologies Ltd. Antiseptic compositions and methods of using same
CN103027032B (zh) * 2012-09-29 2014-09-17 浙江大学 一种鼠李糖脂作为细胞低温或超低温保存的保护剂应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5071598A (en) * 1987-12-03 1991-12-10 California Institute Of Technology Cryoprotective reagent
EP1283670A4 (en) * 2000-05-16 2003-09-17 Gen Hospital Corp MICROINJECTION OF COLD PROTECTING AGENTS FOR CELL PRESERVATION
US8604002B1 (en) * 2010-06-23 2013-12-10 University Of Notre Dame Du Lac Saccharide antifreeze compositions
CN103068256A (zh) * 2010-08-25 2013-04-24 株式会社钟化 担子菌来源的冰结晶化抑制剂
US20150037783A1 (en) * 2012-03-14 2015-02-05 Membrane Protective Technologies, Inc. System and Substances for Cryopreservation of Viable Cells
US20160116454A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Lifeline Scientific, Inc. Selection of extracellular matrix components and/or matricellular proteins for improved post-cryopreservation cell viability and retention

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
章崧英 等: "《实用冷冻外科》", 31 December 1980 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115279887A (zh) * 2020-03-02 2022-11-01 盖亚生物制药有限公司 高活性nk细胞的处理方法
CN111657267A (zh) * 2020-06-17 2020-09-15 科瑞百奥泰州生物技术有限公司 一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法
CN111657267B (zh) * 2020-06-17 2021-02-02 科瑞百奥泰州生物技术有限公司 一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法
CN111749044A (zh) * 2020-07-03 2020-10-09 汕头方大印刷包装科技有限公司 一种抗冻处理剂及其应用方法
CN112075417A (zh) * 2020-09-30 2020-12-15 郑州佐爵生物科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法
CN112075417B (zh) * 2020-09-30 2021-10-08 广东赛尔生物科技有限公司 一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法
CN113615682A (zh) * 2021-09-05 2021-11-09 内蒙古赛诺种羊科技有限公司 绵羊高渗络合剂精液稀释保存液及其应用方法

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Publication number Publication date
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Malazai et al. The history of hyperbaric oxygen therapy and kidney transplant surgery

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