CN112075417A - 一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法 - Google Patents

一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚50‑60μg/mL、乙酰壳糖胺1.5‑4.0mg/mL、白果内酯25‑30ng/mL、焦磷酸钠35‑45ng/mL、苜蓿皂苷80‑90μg/mL、硫辛酸100‑110μg/mL。本发明提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，不添加动物源血清和DMSO，并且复苏后细胞存活率高。本发明的冻存液中添加乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，对细胞无损伤，提高细胞的通透性，维持细胞内外的渗透压稳定，有助于细胞维持活性。添加白果内酯和焦磷酸钠复配使用，防止细胞蛋白质分子变性失活，有助于细胞在长时间冻存后快速恢复活性。本发明的冻存液还添加有苜蓿皂苷和硫辛酸，清除冻存过程产生的自由基，具有抗氧化的效果。本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，方法简便，易于操作。

Description

一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液及其冻存方法。
背景技术
脂肪间充质干细胞(Adipose Mesenchymal Stem Cells，ADSC)是存在于脂肪组织的成体多潜能干细胞，在一定条件下可分化为骨、软骨、心肌、平滑肌、神经及内皮等多种组织细胞。目前已发现脂肪间充质干细胞可以治疗包括人体神经系统、免疫系统、消化系统、运动系统等系统的80多种疾病，脂肪间充质干细胞作为重要的再生医学资源在疾病治疗和人体抗衰老的应用领域有非常重要的使用价值。
现有技术中使用的脂肪间充质干细胞冻存液多含有胎牛血清和二甲基亚砜(DMSO)。胎牛血清含有多种生长因子，常用于体外细胞培养，为细胞的贴壁或铺展在培养基质上提供所需的生长因子；也可用于干细胞冻存，可以减慢细胞活性下降的问题，能够长时间维持细胞活率。但是，研究表明长期与胎牛血清接触的脂肪间充质干细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞胎牛血清后的间充质干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后会发生异种动物蛋白引起的免疫反应，从而导致干细胞移植的成功率降低，易引起诸多不良反应。而且胎牛血清大多源于进口，价格昂贵，增加科研成本。
DMSO因其具有抗冻作用，常用于细胞的冻存。但是，DMSO具有毒性，会对冻存细胞造成损伤，而外源动物血清对细胞有污染的可能，长期使用影响细胞活性，后续使用影响细胞临床治疗推广。现有的脂肪间充质干细胞冻存液即使不含有胎牛血清或DMSO，但是冻存效果不理想，存在长时间保存细胞复苏率差，存活率低等问题，极大地限制了其在临床上的推广应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞的冻存液，不添加胎牛血清和DMSO，并且冻存后的细胞活性保持较好，经复苏后存活率高。
本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞的冻存方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚50-60μg/mL、乙酰壳糖胺1.5-4.0mg/mL、白果内酯25-30ng/mL、焦磷酸钠35-45ng/mL、苜蓿皂苷80-90μg/mL、硫辛酸100-110μg/mL。
进一步地，上述脂肪间充质干细胞冻存液由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚55μg/mL、乙酰壳糖胺3.0mg/mL、白果内酯28ng/mL、焦磷酸钠40ng/mL、苜蓿皂苷85μg/mL、硫辛酸105μg/mL。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，采用上述冻存液进行冻存。
一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，再加入脂肪间充质干细胞，在4-6℃预冷处理；
(2)向步骤(1)经预冷处理后的培养基中加入白果内酯、焦磷酸钠、苜蓿皂苷和硫辛酸，在-20～-40℃预冻处理；
(3)将步骤(2)中经预冻处理后的脂肪间充质干细胞混合物以2-4℃/min的速率降温至-85℃，在-85℃冻存2-3h，然后转移至液氮中冷冻保存。
进一步地，所述步骤(1)中取处于对数生长期的脂肪间充质干细胞进行冻存。
进一步地，所述脂肪间充质干细胞加入量为：每毫升培养基1.0-2.0×106个。
进一步地，所述步骤(1)中预冷处理的时间为5-10min，步骤(2)中预冻处理的时间为1-2h。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，不添加动物源血清和DMSO，并且复苏后细胞存活率高。本发明的冻存液中添加乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，对细胞无损伤，提高细胞的通透性，维持细胞内外的渗透压稳定，减少因细胞内液冰晶的形成、渗透压改变等导致的损伤，有助于细胞维持活性。添加白果内酯和焦磷酸钠复配使用，利用焦磷酸钠的保水性和白果内酯对细胞的刺激性，防止细胞蛋白质分子变性失活，有助于细胞在长时间冻存后快速恢复活性。本发明的冻存液还添加有苜蓿皂苷和硫辛酸，清除冻存过程产生的自由基，具有抗氧化的效果。上述冻存液的成分在脂肪间充质干细胞冻存过程中协同作用，无需添加外源血清和DMSO，并且能保证冻存后细胞活性，复苏后的细胞存活率高。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，限定了冻存液中各成分的加入时机，进一步降低冻存过程对细胞的损伤，有助于提高细胞复苏后的存活率，方法简便，易于操作。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚55μg/mL、乙酰壳糖胺3.0mg/mL、白果内酯28ng/mL、焦磷酸钠40ng/mL、苜蓿皂苷85μg/mL、硫辛酸105μg/mL。
一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，再加入待冻存的处于对数生长期的脂肪间充质干细胞，细胞密度为每毫升培养基1.5×106个，在4℃预冷处理10min；
(2)向步骤(1)经预冷处理后的培养基中加入白果内酯、焦磷酸钠、苜蓿皂苷和硫辛酸，在-30℃预冻处理1.5h；
(3)将步骤(2)中经预冻处理后的脂肪间充质干细胞混合物以3℃/min的速率降温至-85℃，在-85℃冻存2h，然后转移至液氮中冷冻保存。
实施例2
一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚50μg/mL、乙酰壳糖胺1.5mg/mL、白果内酯25ng/mL、焦磷酸钠35ng/mL、苜蓿皂苷80μg/mL、硫辛酸100μg/mL。
一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，再加入待冻存的处于对数生长期的脂肪间充质干细胞，细胞密度为每毫升培养基1.0×106个，在6℃预冷处理5min；
(2)向步骤(1)经预冷处理后的培养基中加入白果内酯、焦磷酸钠、苜蓿皂苷和硫辛酸，在-20℃预冻处理2h；
(3)将步骤(2)中经预冻处理后的脂肪间充质干细胞混合物以2℃/min的速率降温至-85℃，在-85℃冻存2.5h，然后转移至液氮中冷冻保存。
实施例3
一种脂肪间充质干细胞冻存液，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚60μg/mL、乙酰壳糖胺4.0mg/mL、白果内酯30ng/mL、焦磷酸钠45ng/mL、苜蓿皂苷90μg/mL、硫辛酸110μg/mL。
一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，再加入待冻存的处于对数生长期的脂肪间充质干细胞，细胞密度为每毫升培养基2.0×106个，在4℃预冷处10min；
(2)向步骤(1)经预冷处理后的培养基中加入白果内酯、焦磷酸钠、苜蓿皂苷和硫辛酸，在-40℃预冻处理1h；
(3)将步骤(2)中经预冻处理后的脂肪间充质干细胞混合物以4℃/min的速率降温至-85℃，在-85℃冻存3h，然后转移至液氮中冷冻保存。
对比例1
对比例1提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去乙二醇单甲醚，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去乙酰壳糖胺，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去白果内酯，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去焦磷酸钠，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去苜蓿皂苷，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种脂肪间充质干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去苜蓿皂苷，并调整硫辛酸的用量为190μg/mL，其余均和实施例1相同。
对比例7
对比例7和实施例1的区别为冻存方法不同，对比例7的冻存过程如下：向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺、白果内酯、焦磷酸钠、苜蓿皂苷和硫辛酸，加入处于对数生长期的脂肪间充质干细胞，细胞密度为每毫升培养基1.5×106个，在4℃预冷处理10min，然后在-30℃预冻处理1.5h，以3℃/min的速率降温至-85℃，在-85℃冻存2h，最后转移至液氮中冷冻保存。
实施例1至3、对比例1至7中的细胞在液氮中分别冻存1个月、3个月和6个月后取出进行复苏，每次取三管，在37℃的水浴中迅速复苏，用台盼兰染色进行细胞计数(重复三次计数)，计算细胞存活率，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002711233360000061
Figure BDA0002711233360000071
由表1可以看出实施例1至3中经冻存复苏后的细胞存活率高于对比例1至7。对比例1至6中调整了冻存液的组成，由表1可知调整后的冻存液冻存的细胞成活率均有不同程度的降低。说明本发明提供的冻存液在不添加动物源血清和DMSO的情况下，还能保证复苏后细胞的存活率较高。
由实施例1和对比例1至2可知：本发明的冻存液中通过添加乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，对细胞无损伤，提高细胞的通透性，维持细胞内外的渗透压稳定，防止细胞内液冰晶的形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有助于细胞维持活性。
由实施例1和对比例3至4可知：添加白果内酯和焦磷酸钠复配使用，利用焦磷酸钠的保水性和白果内酯对细胞的刺激性，防止细胞蛋白质分子变性失活，有助于细胞在长时间冻存后快速恢复活性。
由实施例1和对比例4至6可知：本发明的冻存液添加有苜蓿皂苷和硫辛酸，清除冻存过程产生的自由基，具有抗氧化的效果，进而提高细胞的存活率。
由实施例1和对比例7可知：本发明的冻存方法通过限定冻存液中各成分的加入时机，进一步降低冻存过程对细胞的损伤，有助于提高细胞复苏后的存活率。
综上，本发明冻存液的成分在脂肪间充质干细胞冻存过程中协同作用，无需添加外源血清和DMSO，并且能保证冻存后细胞活性，复苏后的细胞存活率高。本发明的冻存方法一方面提高细胞存活率；另一方面过程易于操作，便于推广应用。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚50-60μg/mL、乙酰壳糖胺1.5-4.0mg/mL、白果内酯25-30ng/mL、焦磷酸钠35-45ng/mL、苜蓿皂苷80-90μg/mL、硫辛酸100-110μg/mL。
2.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、乙二醇单甲醚55μg/mL、乙酰壳糖胺3.0mg/mL、白果内酯28ng/mL、焦磷酸钠40ng/mL、苜蓿皂苷85μg/mL、硫辛酸105μg/mL。
3.一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1至2所述冻存液进行冻存。
4.根据权利要求3所述脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入乙二醇单甲醚和乙酰壳糖胺，再加入脂肪间充质干细胞，在4-6℃预冷处理；
(2)向步骤(1)经预冷处理后的培养基中加入白果内酯、焦磷酸钠、苜蓿皂苷和硫辛酸，在-20～-40℃预冻处理；
(3)将步骤(2)中经预冻处理后的脂肪间充质干细胞混合物以2-4℃/min的速率降温至-85℃，在-85℃冻存2-3h，然后转移至液氮中冷冻保存。
5.根据权利要求3所述脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述步骤(1)中取处于对数生长期的脂肪间充质干细胞进行冻存。
6.根据权利要求5所述脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞加入量为：每毫升培养基1.0-2.0×106个。
7.根据权利要求4所述脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述步骤(1)中预冷处理的时间为5-10min，步骤(2)中预冻处理的时间为1-2h。
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