CN101037666A - 一种动物细胞的低温保存溶液及保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物细胞的低温保存溶液及保存方法，用于低温保存细胞，特别是新鲜分离的原代动物细胞，如肝细胞。它是通过将刚分离的动物细胞在37℃下培养0～24h后，将培养基切换成0～4℃的低温保存溶液，然后在0～4℃下低温保存0～48h。保存结束后，采用新鲜细胞培养基在37℃条件下进行复苏培养0～24h，最后采用正常动物细胞培养基进行培养。在保存过程以及前后的培养基中采用添加中药有效成分以及其他化学保护剂，提高动物细胞经过低温保存后的存活率以及细胞功能。本发明提出的离体动物细胞短期低温保存技术，可应用于生物人工肝及其他由器官细胞构成的生物型人工脏器的运输和保存，同时也适用于动物细胞在其他医药领域的应用。

Description

一种动物细胞的低温保存溶液及保存方法

技术领域

本发明涉及生物保存技术，特别地，涉及一种动物细胞的低温保存溶液及保存方法。

背景技术

在低温条件(0～4℃)下，大多数器官可以耐受30～60min的缺血状态而维持其功能，这是因为低温下细胞内酶活性低、细胞代谢慢所造成的。因此就产生这么一个想法：将分离的细胞、组织、器官保存于低温条件下，延长保存时间，提高保存效果，有效提高这些生物资源的利用度，拓展其细胞、组织和人工器官的运输与保存中的应用。

随着人工组织的研究与应用，人们对低温保存溶液产生越来越浓厚的兴趣，这种保存操作步骤简单易行、对环境要求低，适合于运输和移植中所要求的短期保存要求，无需冷冻。低温保存的一般方法是将已分离细胞、组织和器官等直接保存于4℃中，这种传统的保存方法导致在低温保存后细胞活率下降，细胞膜皱缩，细胞结构遭到严重损伤，无法在复苏后存活。

可见低温会产生很强的副作用，其对细胞造成的伤害主要有以下几个方面：1)细胞膜流动性减小，细胞膜僵化将导致细胞的进一步损伤；2)抑制了Na/K ATP酶，引起细胞膨胀；3)导致细胞坏死和凋亡；4)产生氧自由基。

由此，人们使用特殊的低温保存液来保存离体器官于0～4℃。也因此相继出现许多低温保存液，如UW液(威斯康星大学研制的低温保存液)，EURO-COLLIN液、L-15液、HTS(HYPOTHERMOL)液、EPIDERM液和DME等。这些保存液都很好用于保存器官，使器官在低温状态下保存后仍维持一定的功能、活率，取得了很好的效果。随后，科学家采用这些保存液用于保存离体动物细胞，其保存效果却不理想，无法有效地抑制由低温保存引起的细胞损伤。

可见，低温保存液的成分尚需要进一步的改良与优化。这对于采用离体细胞通过体外组装成的人工器官尤其重要。Pahernik等就强调了大规模低温保存方法对发展生物人工肝的重要性，这种方法能有效地延长细胞贮存、运输的时间，更拓宽这些细胞的应用范围，使细胞能有效地用于化妆品和药品临床前的体外安全性检测，或者组装成人工器官用于临床使用。

因此，本专利针对低温保存引起的细胞损伤现象，改良低温保存液成分，提高低温保存效果。

随着中药现代化，中药有效成分具有抑制细胞凋亡、稳定细胞膜和清除自由基等保护功能，可以通过各自机制保护细胞免于低温状态下的细胞受损。以下是文献所报道的部分中药有效成分的一些具体作用。甘草酸[1]对细胞有抑制凋亡、清除氧自由基的功效，苦参碱在0.2～10mg/L浓度范围下能清除自由基，保护细胞膜结构，减轻细胞的损伤，且能明显抑制由肿瘤坏死因子所诱导的体外大鼠肝细胞的凋亡，且对细胞功能有很强的促进作用。山莨菪碱[2]有稳定细胞膜和抗氧自由基损伤的作用。五味子乙素[3]对两种不同自由基产生系统所引起的肝细胞脂质过氧化损伤均有保护作用，使肝细胞存活串提高，并能保持细胞膜形态完整。有相关功效的中药有效成分还有：丹参素[4]、黄芪多糖[5]、柴胡皂甙[6]等。

但迄今为止，尚未有文献报道将五味子乙素、山莨菪碱、甘草酸、丹参素、黄芪多糖、柴胡皂甙等中药的有效成分应用于离体细胞的低温保存。

[1]史桂兰，胡志浩，甘草酸药理作用及临床应用研究进展，天津药学2001，13(1)：10-12。

[2]王火、张淑环、黄良生，樟柳碱和山莨菪碱预防急性肺损伤的实验研究，中国急救医学，1999，19(11)：19-20。

[3]刘耕陶，五味子乙素对原代培养大鼠肝细胞脂质过氧化的抗氧化作用，中国药理学报，1989，10(4)：353

[4]张文生朱陵群张丽慧牛福玲，丹参素对缺氧/缺糖损伤神经细胞线粒体的保护作用，北京中医药大学学报，2004，27(3)：53-56

[5]李汶霞，孙圣刚，袁慧，王海涛，张颜波，孙保亮，黄芪多糖对星形胶质细胞培养液中自由基系统损伤保护作用的时间依赖性，中国临床康复，200610(11)：59-61

[6]周世文，周宁，徐传福。中草药抗肝细胞损伤有效成分研究进展，中国药学杂志，1995，30(2)：67-69。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供一种动物细胞的低温保存溶液，同时，也提供一种应用此保存溶液进行低温保存的方法。

该发明的基本思路是：在动物细胞基础培养基中加入各种保护因子，抑制因为低温保存所造成的细胞损伤，而且低温保存中以及前后的预培养和复温培养中都添加了保护因子，强化其对细胞的保护作用。该保护因子主要由中药有效成分组成。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种动物细胞的低温保存溶液，它包括动物细胞基础培养基、化学保护成分钙离子Ca²⁺和中药有效成分山莨菪碱、五味子乙素、甘草酸、苦参碱、丹参素、黄芪多糖、柴胡皂甙。所述Ca²⁺和各中药有效成分浓度分别为：钙离子Ca²⁺0～10mol/L、山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。

进一步地，所述动物细胞基础培养基为Williams’E培养基、HTS液、1640、L-15液或Ham’s F12。

一种应用上述动物细胞的低温保存溶液进行的低温保存方法，用于保存动物细胞，它包括如下步骤：

(1)将已分离的动物细胞在二氧化碳培养箱中预培养0～24小时；

(2)将预培养后的动物细胞在权利要求1所述的低温保存溶液中低温保存0～48小时；

(3)低温保存完毕后，在二氧化碳培养箱中复温培养。

进一步地，所述动物细胞是从组织器官中分离得到的原代细胞。

进一步地，所述步骤(1)和(3)中，所述二氧化碳培养箱中，为防止细胞在逐渐升温过程中受损，使用的动物细胞基础培养基中添加了各保护因子，其组成为：钙离子Ca²⁺0～10mol/L、山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。

进一步地，所述动物细胞基础培养基为Eagle’s MEM、DMEM、Ham’s F10、Ham’s F12、DMEM/F12、PRMI 1640、L-15、M199或Williams’E。

本发明专利的有益效果是，五味子乙素、山莨菪碱、甘草酸、丹参素、黄芪多糖、柴胡皂甙等中药的有效成分均是离体细胞低温保存的良好保护剂，根据低温损伤机理，它们可以通过清除氧自由基、抑制钙通道、增加细胞膜的稳定性和抑制低温引起的细胞凋亡等渠道来保护低温保存中的离体细胞。本发明优化了低温保存液配方，较好地通过低温保存方法维持细胞的生物学活性及特异性功能。同时，在0～4℃下低温保存情况下，细胞运输和保存过程中不需要任何营养和氧气供给，操作简单可行，为离体细胞的保存和运输带来便利，具有很强的现实意义。

具体实施方式

下面根据具体实施例详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

为了克服现有的低温保存过程中保存细胞效果差的严重不足，本发明以基于添加各种不同功能的中药保护成分为主要发明创造点，此外结合廉价的化学保护剂来研制一种有效的用于低温保存离体细胞的溶液，同时也提供相应的便于操作的低温保存方法。

本发明用于保存动物细胞的低温保存方法，其具体步骤为：将已分离的动物细胞在二氧化碳培养箱中预培养0～24小时；将预培养后的动物细胞在本发明的低温保存溶液中低温保存0～48小时；低温保存完毕后在二氧化碳培养箱中复温培养。培养细胞的方式有悬浮培养、贴壁培养、凝胶包埋培养、聚球体培养等。这样所得到的高活率细胞可用于人工器官。

在预培养和复温过程中，为了防止细胞在逐渐升温时受到损伤，在现有的动物细胞基础培养基中加入了Ca²⁺0～10mol/L的钙离子、0～500mg/L的山莨菪碱、0～100mg/L的五味子乙素、0～100mg/L的甘草酸、0～100mg/L的苦参碱、0～100mg/L的丹参素、0～100mg/L的黄芪多糖、0～100mg/L的柴胡皂甙，pH调节至7.4；二氧化碳培养箱的培养条件为37℃，内含5％的二氧化碳。

现有的基础培养基可为：Eagle’s MEM，DMEM，Ham’s F10或12，DMEM/F12，PRMI 1640，L-15，M199，Williams’E等培养基。

本发明的低温保存溶液是在现有的每升动物细胞基础培养基中加入各保护因子，使各浓度组分为：Ca²⁺0～10mol/L、山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。

用于低温保存的动物细胞基础培养基可为：Williams’E培养基，HTS液，1640，L-15液，Ham’s F12等。

实施例1

聚球体的低温保存：将人肝细胞聚球体凝胶包埋于聚砜中空纤维丝内，5cm培养皿培养，加入含有保护剂的Williams’E培养基(添加成分：5mg/L山莨菪碱、5mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，1mMCa²⁺，每个平行分别添加一种保护剂)，放入37℃、5％CO₂培养箱静置，预培养12h；将培养基换成添加有保护剂的1640基础培养基，于4℃冰箱放置48h，复温时，将保存液重新换成含有保护剂的Williams’E培养基，复温12h后检测各项指标。

作为阳性对照组，用同样的方法进行预培养、低温保存和复温，但所有培养基或保存液均不添加任何保护成分(包括中药有效成分和化学保护剂)；作为阴性对照组，细胞一直培养在37℃下，但培养基中不含任何保护剂。评价各种情况下的细胞活率和功能。

各重复三组，测定肝细胞活率及肝细胞功能指标

结果如下表所示。

组别	MTT(％)	尿素分泌量(pg/cell/h)
			阴性对照组1  37℃	100	45.0
阳性对照组2  4℃	36.5	13.8
			1#添加钙离子	92.9	43.9
2#添加五味子乙素	95.8	44.3
			3#添加甘草酸	86.4	39.8
4#添加山莨菪碱	91.3	40.1

根据表中数据，与阳性对照组相比，添加有各种中药保护成分的实验组其细胞活率提高约1.5～2.0倍。

实施例2

凝胶包埋培养的低温保存：将收获活率高于90％的大鼠肝细胞凝胶包埋，注入中空纤维丝，细胞密度为1×10⁶。将中空纤维丝装入硅胶管，加入DMEM培养基(添加成分：10mg/L苦参碱、10mg/L丹参素、10mg/L黄芪多糖、5mg/L柴胡皂甙，每个平行分别添加一种保护剂)，放入37℃、5％CO₂培养箱静置预培养12h。将培养基换成分别添加各保护剂的L-15液，于4℃冰箱放置48h，复温时，DMEM培养基中也添加了同样成分的保护剂，培养时间为12h，复温12h后检测各项指标。

作为阳性对照组，用同样的方法进行预培养、低温保存和复温，但低温保存液中不添加任何中药有效成分(保护剂)。而作为阴性对照组，细胞一直培养在37℃下，但培养基中不含任何保护剂。评价各种情况下的细胞活率和功能。

各重复三组，测定细胞细胞活率(MTT)和肝细胞功能指标之一(白蛋白分泌量)。

组别	MTT(％)	白蛋白分泌量(pg/cell/h)
			阴性对照组37℃	100	1.5
阳性对照组4℃	32.3	0.48
			1#添加丹参素	66.5	0.85
3#添加黄芪多糖	87.6	0.13
			4#添加柴胡皂甙	85.8	0.124
5#添加苦参碱	76.9	0.105

观察细胞形态，可见培养于添加有保护成分的保存液中的细胞无论是存活率还是白蛋白分泌量均明显优于不添加任何成分的阳性对照组。

根据表中的实验结果，在凝胶包埋的培养条件下，与不加任何保护细胞中药成分的阳性对照组相比，添加有各种保护细胞成分的实验组其细胞活率有所提高。

实施例3

小型生物人工肝的低温保存：将猪肝细胞培养于小型生物人工肝模型中，总体积为50ml的猪肝细胞培养基在反应器外腔以10ml/min的流速进行循环。DMEM/F12培养基中的添加成分：100mg/L苦参碱、50mg/L山莨菪碱、100mg/L五味子乙素、100mg/L甘草酸，10mg/L丹参素、5mg/L黄芪多糖、5mg/L柴胡皂甙，3mMCa²⁺，。预培养12h后，将培养基换成保护剂添加含量和成分均相同的的1640基础培养基进行循环培养，于4℃冰箱放置48h，复温时，DMEM/F12培养基中也添加了同样成分的复合保护剂，复温12h后检测各项指标。

作为阳性对照组，用同样的方法进行预培养、低温保存和复温，但低温保存液中不添加任何成分的中药有效成分(保护剂)。而作为阴性对照组，细胞一直培养在37℃下，但培养基中不含任何保护剂。评价各种情况下的细胞活率和功能。

各重复三组，测定细胞活率(MTT)和肝细胞功能指标(尿素分泌量和白蛋白)。

组别	MTT(％)	albumin(pg/cell)	尿素分泌量(pg/cell)
				阴性对照组37℃	100	1.5	35.6
阳性对照组4℃	32.3	0.43	12.1
				添加保护剂	95.6	1.45	32.8

比较实施例2与3，可见将各种中药保护成分混合后添加后，其对细胞的保护效果优于单一中药成分对肝细胞的保护作用。

实施例4

将无菌条件下收获的软骨细胞，置于37℃进行凝胶包埋，注入中空纤维丝，细胞密度为1×10⁵。将中空纤维丝装入硅胶管，加入F12(复合培养液中的添加成分：10mg/L苦参碱、50mg/L山莨菪碱、10mg/L五味子乙素、10mg/L甘草酸，10mg/L丹参素、10mg/L黄芪多糖、10mg/L柴胡皂甙，3mMCa²⁺。)，放入37℃，5％CO₂培养箱静置预培养24h。将培养基换成保护剂添加含量和成分均相同的的HTS基础培养基，于4℃冰箱放置48h，复温采用F12基，其中也添加了同样成分的保护剂，培养时间为24h。复温24h后检测各项指标。

作为阳性对照组，用同样的方法进行预培养、低温保存和复温，但低温保存液中不添加任何中药有效成分(保护剂)。而作为阴性对照组，细胞一直培养在37℃下，但培养基中不含任何保护剂。评价各种情况下的细胞活率和功能。

组别	MTT(％)
		阴性对照组37℃	100
1#添加钙离子	60.5
		2#添加甘草酸	83.7
3#添加复合中药保护剂	96.3

从数据中看出，将各种中药保护成分混合后添加于低温保存液中，其对软骨细胞同样具有明显的保护效果，且优于添加单一保护剂的保护作用。因此该保护剂有广泛应用于低温保存各种细胞的价值。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种动物细胞的低温保存溶液，其特征在于，它包括动物细胞基础培养基、化学保护成分钙离子Ca²⁺和中药有效成分山莨菪碱、五味子乙素、甘草酸、苦参碱、丹参素、黄芪多糖、柴胡皂甙。所述Ca²⁺和各中药有效成分浓度分别为：钙离子Ca²⁺0～10mol/L、山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。

2.根据权利要求1所述的低温保存溶液，其特征在于，所述的动物细胞基础培养基为Williams’E培养基、HTS液、1640、L-15液或Ham’s F12。

3.一种应用权利要求1所述的低温保存溶液进行的低温保存方法，用于保存动物细胞，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)将已分离的动物细胞在二氧化碳培养箱中预培养0～24小时。

(2)将预培养后的动物细胞在权利要求1所述的低温保存溶液中低温保存0～48小时。

(3)低温保存完毕后，在二氧化碳培养箱中复温培养。

4.根据权利要求3所述的低温保存方法，其特征在于，所述动物细胞是从组织器官中分离得到的原代细胞。

5.根据权利要求3所述的低温保存方法，其特征在于，所述步骤(1)和(3)中，所述二氧化碳培养箱中，为防止细胞在逐渐升温过程中受损，使用的动物细胞基础培养基中添加了各保护因子，其组成为：钙离子Ca²⁺0～10mol/L、山莨菪碱0～500mg/L、五味子乙素0～100mg/L、甘草酸0～100mg/L、苦参碱0～100mg/L、丹参素0～100mg/L、黄芪多糖0～100mg/L、柴胡皂甙0～100mg/L。

6.根据权利要求5所述的低温保存方法，其特征在于，所述动物细胞基础培养基为Eagle’s MEM、DMEM、Ham’s F10、Ham’s F12、DMEM/F12、PRMI 1640、L-15、M199或Williams’E。