CN109221086A - 一种保护血细胞的中药提取物及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种香椿提取物的制备方法，包括如下步骤：(a)煎煮香椿，过滤，取滤液，形成第一混合物；(b)用乙醇处理所述第一混合物，形成第二混合物；(c)抽滤所述第二混合物，得滤液，形成第三混合物；(d)离心所述第三混合物，取上清，即初级香椿提取物溶液。该方法制备的香椿提取物能够用作鸡血细胞冻存的保护剂，该香椿提取物与氢气共同用作鸡血细胞冻存的保护剂时二者还具有协同作用。

Description

一种保护血细胞的中药提取物及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于医学领域，涉及一种保护血细胞的中药提取物及其制备方法与用途，特别涉及一种基于该中药提取物的用于保护冻存血细胞的保护方法。

背景技术

氢气是自然界中最小的分子，长期以来，生物学家误认为它是生理上的惰性气体，不能与生物体内的物质发生反应^[1]。近年来大量研究表明，氢气具有抗氧化，抗炎症，阻止细胞凋亡及信号调节的作用^[2-3]，故对其开发与应拥有广阔的前景。

香椿Toonasinensis(A.Juss.)Roem.又名春芽树、椿、椿树，为楝科(Meliacwae)椿属(Toona)植物，是我国具有传统的特色的乔木蔬菜^[4]。因其具有多酚、黄酮、生物碱、萜类、皂苷等众多天然活性成分^[5-7]，且其含量丰富，故其抗氧化性在150种蔬菜中排名第一。《本草纲目》记载，香椿果实、叶、茎、花、树皮均可入药，具有抗氧化，降血糖，降血脂，抗凝血等作用。国内外对香椿叶黄酮、多酚的研究比较深入，其抗氧化、清除羟基自由基、超氧自由基、DPPH·及抗脂质过氧化等均具有显著的效果^[8-9]。此外，香椿叶中也含有多糖和蛋白质，但是香椿多糖的应用却相对较少，鉴于其也具有显著的药用价值。

尚未见到香椿多糖在血细胞冷冻保护中的应用的报道，更未见到香椿多糖与氢气联合使用在血细胞冷冻保护中的应用的报道。

参考文献

[1]揣云海,孙学军,蔡建明.氢气生物学及其医学应用[J].生物物理学报,2012,28(09):705-718.

[2]韩世谦,叶治家.氢气作为新型治疗气体的研究进展[J].生命科学研究,2017,21(02):166-173.

[3]夏裕宁.氢气对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤内质网应激及神经细胞凋亡的影响[D].桂林医学院,2017.

[4]王旭波,顾芹英,沈玉萍,秦冬,杨欢,贾晓斌.香椿的化学成分研究进展[J].南京中医药大学学报,2014,30(04):396-400.

[5]黄诗琪,冯卫华,于立梅,等.香椿多酚抑菌特性研究[J].食品科技,2013,38(11):212-216.

[6]刘常金,赵彦丽,宛红颖,等.香椿老叶中总黄酮与总皂苷的提取工艺研究[J].食品科学,2011,(1):157-158.

[7]刘金福,尤玲玲,王昌禄,等.香椿叶提取物抗氧化和抑制癌细胞增殖的研究[J].中南大学学报(医学版),2011,37(1):42-47.

[8]张京芳,王冬梅,周丽,等.香椿叶抗氧化物提取工艺优化与抗氧化活性分析[J].农业机械学报,2007,38(8):97-100.

[9]沈玉萍,钟雄雄,余筱洁,周存山,杨欢,贾晓斌.中药香椿叶的化学成分研究[J].中国药学杂志,2013,48(01):22-24.

[10]曹美霞,程丽芳,姬云涛,刘佳,屈长青.谷胱甘肽与富氢冻存液在鸡血细胞冻存中的保护作用[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2016,25(01):75-79.

[11]Jing Yang,NanaCai,HongwenZhai,Jiamin Zhang,et al.Naturalzwitterionic betaine enables cells to survive ultrarapid cryopreservation[J].Sci Rep.2016；6:37458.

[12]Paasch U,Sharma RK,Gupta AK,Grunewal d S,etal.Cryopreservationand thawing is associated with varying extent of activation of apoptoticmachinery in subsets of ejaculated human spermatozoa[J].Biology of Reproduction,2004,71(6):1828-1837.

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明对香椿叶多糖进行研究，发现它在细胞冻存中存在着一定的作用，并使其与氢气配伍，保护作用显著提高。

通过计算细胞在冻存复苏后的细胞活力、溶血度，并观察细胞存活状态，探讨香椿叶多糖与氢气配伍在鸡血细胞冻存中的保护作用。以太和香椿叶为原料，通过水提醇沉法提取出香椿叶粗多糖，经Sevage法去除蛋白质，再进一步确定最佳实验浓度。实验分为5组，分为传统组，阳性对照组，香椿叶多糖组、氢气组和香椿叶多糖与氢气协同组，使用台盼蓝染色鉴定鸡血细胞存活状态，MTT法测定鸡血细胞的细胞活力及测定细胞的溶血度。香椿叶多糖、氢气以及两者协同处理鸡血细胞，其细胞的存活状态、活力以及溶血度与传统组相比，差异性极显著(P＜0.01)，协同组与两种药物单个处理相比，差异性显著(P＜0.05)。实验结果表明香椿叶多糖、氢气对鸡血细胞的冻存具有保护作用，并且两者存在一定的协同作用。

较为具体地，本发明第一方面提供了一种用于保护血细胞的中药提取物的制备方法，所述中药提取物的活性成分来自香椿。

在一些实施方式中，所述中药提取物的活性成分来自香椿的多糖；和/或所述保护血细胞是对血细胞的冻存的保护；和/或所述血细胞是鸡血细胞。

在一些实施方式中，所述中药提取物的制备方法包括如下步骤：

(a)煎煮香椿，过滤，取滤液，形成第一混合物；

(b)用乙醇处理所述第一混合物，形成第二混合物；

(c)抽滤所述第二混合物，得滤液，形成第三混合物；

(d)离心所述第三混合物，取上清，即初级香椿提取物溶液。

在一些实施方式中，所述中药提取物的制备方法还包括如下步骤：

(e)除去所述初级香椿提取物溶液中的蛋白，得到香椿提取物粗品；

优选地，所述中药提取物的制备方法还包括如下步骤：

(f)将所述香椿提取物粗品冻干。

在一些实施方式中，所述香椿选自香椿叶粉末；

可选地，在步骤(a)之前，先用水浸泡香椿，优选15-45min，更优选30min；

可选地，用水煎煮步骤(a)产生的药渣，过滤，取滤液与步骤(a)产生的所述滤液合并使用；

优选地，在步骤(b)中，用50-70％优选60％的乙醇处理所述第一混合物，形成所述第二混合物；

可选地，用乙醇洗涤步骤(a)产生的滤渣，过滤，取滤液与步骤(b)产生的所述第二混合物合并使用；

可选地，在步骤(c)中，使用真空抽滤泵在0.5-1.0bar下进行抽滤，优选地，使用真空抽滤泵在0.8bar下进行抽滤；

可选地，在步骤(c)之前，静置所述第二混合物，优选12-36h，更优选24h；

可选地，在步骤(d)中，3000-5000r/min离心所述第三混合物10-30min，优选4000r/min离心20min；

可选地，在步骤(e)中，将所述初级香椿提取物溶液与Sevage试剂按照体积比3-5:1优选4:1混合，振荡，静置，取出上清液，得到所述香椿提取物粗品，其中，所述Sevage试剂的成分为体积比为3-5:1优选4:1的氯仿与正丁醇混合液；

可选地，在步骤(f)中，在-80℃冰箱冷冻6-24h优选12h，再置于冻干机中冷冻干燥。

本发明第二方面提供了一种用于保护血细胞的中药提取物，所述中药提取物是通过本发明第一方面所述的方法制备得到的。

本发明第三方面提供了如本发明第二方面所述的方法或如本发明第二方面所述的中药提取物在制备细胞冻存保护剂中的用途。

本发明第四方面提供了一种用于保护冻存血细胞的保护方法，所述保护方法包括向血细胞冻存溶液添加如本发明第二方面所述的中药提取物和氢气。

在一些实施方式中，所述保护方法包括如下步骤：

(i)在所述血细胞冻存溶液中添加如权利要求6所述的中药提取物，形成第四混合物；

(ii)取血液，加入抗凝剂，稀释到目的浓度，形成第一冷冻血液混合物；

(iii)将所述第四混合物加入所述第一冷冻血液混合物，形成第二冷冻血液混合物；

(iv)向所述第二冷冻血液混合物中通入氢气，形成第三冷冻血液混合物，对所述第三冷冻血液混合物进行冷冻储存。

在一些实施方式中，所述血细胞冻存溶液的成分为：按照体积比5-15％DMSO、60-80％DMEM、5-15％FBS，且总体积为100％，优选10％DMSO、70％DMEM、20％FBS；和/或

在步骤(i)中，以所述血细胞冻存溶液为溶剂，所述中药提取物的浓度为：1-15mg/L，优选2-10mg/L，更优选6mg/L；和/或

所述抗凝剂为肝素；和/或

在步骤(ii)中，采用的pH＝6.9的PBS缓冲液稀释所述血液，可选，稀释20-50倍体积，优选稀释40倍体积；和/或

在步骤(iii)中，所述第四混合物以1:2-10优选1:5的体积比加入所述第一冷冻血液混合物；和/或

在步骤(iv)中，向所述第二冷冻血液混合物中通入氢气的步骤为：将氢气缓慢的通入所述第二冷冻血液混合物中，持续3-10min，优选5min，优选通入氢气的速度为0.04-0.06L/min，更优选0.05L/min。

该方法制备的香椿提取物能够用作鸡血细胞冻存的保护剂，该香椿提取物与氢气共同用作鸡血细胞冻存的保护剂时二者还具有协同作用。

附图说明

图1为不同冻存液冻存的鸡血细胞活力台盼蓝染色的照片(比例尺：100μm)，A.传统组；B.GSH组；C.多糖组；D.氢气组；E.多糖加氢气组。

图2冷冻复苏后鸡血细胞活力MTT法检测(n＝3)结果比较视图，与传统组相比，差异性极显著(**P<0.01)；与多糖和氢气单个药物处理组相比，差异性显著(#P<0.05)。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

1材料与仪器

1.1材料与试剂

太和香椿叶购自安徽太和县，谷胱甘肽[GSH](Georgia USA)，鸡血细胞(采自本实验室饲养的10月龄公鸡)，DMSO(Sigma)，DMEM(Thermo)，噻唑蓝[MTT](WOLSEN)，胎牛血清(四季青)，其他试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

酶标仪(Thermo)、冷冻干燥机(SIM international Group)、烘干箱(上海精宏实验设备有限公司)、-80℃冰箱(Thermo)、4℃冰箱(青岛海尔)、-20℃冰箱(青岛海尔)、氮吹仪(美国Organomation)、中药粉碎机(浙江省永康市溪岸五金药具厂)、真空抽滤泵(北京莱伯泰科仪器有限公司)、电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)、台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、恒温水浴锅(北京东方精瑞科技发展有限公司)、GH-300高纯氢发生器(北京中兴汇利科技发展有限公司)。

2实验方法

2.1太和香椿叶多糖的制备

香椿多糖的提取方法；称取香椿叶粉末20g置于烧杯中，加入12倍量水，浸泡30min，煎煮提取1h，过滤，药渣加10倍量水煎煮1h，提取过程中用玻璃棒不断搅拌，合并两次滤液。在滤液中加入95％乙醇使溶液变为醇浓度为60％，边加边搅拌。滤渣用65％乙醇洗涤后过滤，得滤液，与上述60％醇溶液合并，静置24h，使用真空抽滤泵在0.8bar下进行抽滤，得滤液，4000r/min离心20min，得上清液，将上清液与Sevage试剂[氯仿：正丁醇＝4：1(V/V)]4：1混合，振荡，静置，变性后的蛋白质介于上清液与Sevage试剂交界处，取出上清液，在-80℃冰箱冷冻12h，再置于冻干机中冷冻干燥，得到香椿叶多糖提取物粉末，4℃冰箱中储存备用，临用时溶解于DMEM培养基中，DMEM培养基配方参见表1。

表1 DMEM培养基配方

序号	化合物名称	含量(mg/L)	序号	化合物名称	含量(mg/L)
						1	无水氯化钙	200.00	17	L-丝氨酸	42.00
2	硝酸铁.9H2O	0.10	18	L-苏氨酸	95.00
						3	氯化钾	400.00	19	L-色氨酸	16.00
4	无水硫酸镁	97.67	20	L-酪氨酸钠盐	104.00
						5	氯化钠	6400.00	21	L-缬氨酸	94.00
6	无水磷酸二氢钠	125.00	22	D-泛酸钙	4.00
						7	L-盐酸精氨酸	84.00	23	氯化胆碱	4.00
8	L-盐酸胱氨酸	63.00	24	叶酸	4.00
						9	L-谷氨酰胺	584.00	25	肌醇	7.20
10	甘氨酸	30.00	26	烟酰胺	4.00
						11	L-盐酸组氨酸	42.00	27	核黄素	0.40
12	L-异亮氨酸	105.00	28	盐酸硫胺	4.00
						13	L-亮氨酸	105.00	29	盐酸吡哆辛	4.00
14	L-盐酸赖氨酸	146.00	30	葡萄糖	4500.00
						15	L-甲硫氨酸	30.00	31	丙酮酸钠	110.00

2.2冻存液的制备

配制不同成分的冻存液，参见表2，传统的血细胞冻存溶液按照体积比为10％DMSO、70％DMEM、20％FBS配置，GSH或多糖的浓度指它们各自以前述血细胞冻存溶液为溶剂的浓度。

表2配制不同冻存液

注：存在氢气的组别，均为鸡血细胞在置于4℃冰箱降温前，通过GH-300高纯氢发生器产生氢气，使用氮吹仪调整氢气流速，将氢气以0.05L/min的速度缓慢的通入冻存管中，持续5min。

2.3鸡血细胞的冻存与复苏

使用注射器从鸡翅血管中取出1mL鸡血加入含有肝素的烧杯中，再加入40倍体积的PBS缓冲液(pH＝6.9)进行稀释，取200μL鸡血稀释液置于5mL冻存管中，加入1mL的冻存液。先置于4℃冰箱保存30min，再置于-20℃冰箱中保存30min,最后置于-80℃冰箱冷冻保存。

对于使用氢气的组别，使用注射器从鸡翅血管中取出1mL鸡血加入含有肝素的烧杯中，再加入40倍体积的PBS缓冲液(pH＝6.9)进行稀释，取200μL鸡血稀释液置于5mL冻存管中，加入1mL的冻存液。通过GH-300高纯氢发生器产生氢气，使用氮吹仪将氢气缓慢的通入冻存管中，以0.05L/min的速度持续5min。先置于4℃冰箱保存30min，再置于-20℃冰箱中保存30min,最后置于-80℃冰箱冷冻保存。

冻存30d后，进行复苏实验，为减少冰晶对细胞的损伤，采用速融原则，即将冻存管置于40℃恒温水浴锅中1min内完全溶解，取出置于离心机中，3000r/min，离心10min，弃上清，加入1mL DMEM培养基，缓慢吹打混匀。

2.4太和香椿叶多糖在细胞冻存中最佳浓度的确定

太和香椿叶多糖最佳浓度的确定；制备成终浓度为2、6、10mg/L的香椿叶多糖冻存液。取冻存液为香椿叶多糖的冻存管进行复苏，复苏后的鸡血细胞50μL加入96孔板，再加入20μL MTT，40℃孵育4h，再加入150μLDMSO，低速振荡10min，置于酶标仪中，在490nm波长下测定OD值，每个处理分别做3个重复。

2.5太和香椿叶多糖、氢气对鸡血细胞冻存的影响

待香椿叶多糖最佳浓度确定后，进行实验分组，分别为传统冻存组，GSH组，氢气组，香椿叶多糖组，氢气加香椿叶多糖组，每组3个重复，冻存液浓度及配制方法如表1。

2.6台盼蓝拒染法鉴定细胞存活状态

取各组冻存复苏后的鸡血细胞1mL，加入2-3滴0.4％台盼蓝染液(溶于0.9％生理盐水)，染色2min,吸取200μL置于载玻片上，盖上盖玻片，进行镜检。

2.7MTT比色法测定鸡血细胞活力

MTT比色法测定参考文献方法^[10]并作修改，细胞复苏后,置于离心机中，3000r/min，离心10min，弃上清，加入1mLPBS，缓慢吹打混匀,取50μL加到96孔板，再加入20μLMTT，40℃孵育4h，再加入150μLDMSO，低速振荡10min，置于酶标仪中，在490nm波长下测定OD值，每个处理分别做3个重复。

2.8鸡血细胞溶血度的测定

各组鸡血细胞冻存复苏后，置于离心机中，3000r/min，离心10min，收集上清液，取200μL加入到96孔板，每组3个重复样品，置于酶标仪中，在540nm波长下测定OD值，以此来间接的表示细胞溶血度。

2.9统计学方法

采用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理，各组实验数据用平均数±标准差表示，P＜0.05为差异性显著，P＜0.01差异极显著。

3实验结果

3.1太和香椿叶在细胞冻存中的最佳浓度

MTT与活细胞中的活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶反应生成水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，死细胞无此能力，DMSO可以溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，OD值越大，表示活细胞越多。(此处波长下的OD值是跟细胞相关联)。如表2所示，多糖浓度为2、10mg/L时，其OD值均显著高于传统组(P＜0.05)，多糖浓度为6mg/L时，其OD值高于传统组极显著(P＜0.01)，且在此浓度下，OD值显著高于其它两个浓度(P＜0.05)，故香椿叶多糖对鸡血细胞的冻存有一定的保护作用，且在多糖浓度为6mg/L时，保护效果最佳。

表2太和香椿叶不同浓度在鸡血红细胞冻存中的影响(n＝3,

注：与传统组相比，差异性极显著(**P<0.01)，差异性显著(*P<0.05)；与香椿叶多糖2mg/L和10mg/L相比,差异性显著(#P<0.05).

3.2太和香椿叶多糖、氢气在鸡血细胞冻存中的保护作用

通过实验得出太和香椿叶多糖提取物浓度为6mg/L时，作为冻存保护剂，在鸡血细胞冻存中的效果最佳，因此选用浓度为6mg/L香椿叶多糖提取物作为后续实验的终浓度。

3.3台盼蓝拒染

台盼蓝，一种细胞活性染料，作用原理是正常的活细胞，细胞膜完整，活性染料无法透过，细胞不着色，且有光泽；死细胞，细胞膜破裂，活性染料可以透过，细胞着蓝色并膨大，无光泽^[5]。将各组细胞复苏后经过拒染，如图1，可以发现，各组细胞存活状态均高于传统组，并且多糖加氢气组，细胞存活状态比单个药物处理组好，故多糖与氢气配伍对鸡血细胞冻存有良好的保护作用。

3.4MTT法测定细胞活力

具体数值如表3所示，如图2，横坐标表示不同药物组，纵坐标表示光吸收值即OD值(间接反映活细胞数量)，OD值越大表明活细胞数量越多，同时也反映细胞损伤程度。各组细胞复苏后，经过MTT实验，结果表明，多糖组、氢气组均高于传统组，且差异性极显著(**P<0.01)；当氢气与多糖配伍时，其OD值高于单个药物处理组，且差异性显著(#P<0.05)，效果也仅次于GSH组，故太和香椿叶多糖、氢气均可作为一种细胞冻存保护剂，且两种物质相配伍，效果最佳。

表3冷冻复苏后鸡血细胞溶血度MTT法检测(n＝3,)

注：与传统组相比，差异性极显著(**P<0.01)；与多糖组和氢气组相比，差异性极显著(##P<0.01)

3.5细胞溶血度的测定

红细胞发生破裂时，细胞中的血红蛋白会溢出，发生溶血现象。故使用上述方法离心获得的上清液中的物质为细胞发生溶血现象后的血红蛋白，此处实验中的OD值越大则表示细胞受损伤的程度越高，死细胞越多。(此处的波长下OD值是跟血红蛋白相关联)。如表4，多糖组、氢气组、GSH组、多糖OD值均高于传统组，且差异性显著；多糖与氢气相协同时，其OD值显著高于单个药物处理组。故太和香椿叶多糖与氢气相配伍在鸡血细胞中有良好的保护作用，且两种物质存在一定的协同作用。

表4冷冻复苏后鸡血细胞溶血度测定(n＝3,)

注：与传统组相比，差异性极显著(**P<0.01)，差异性显著(*P<0.05)；与多糖和氢气单个药物处理组相比，差异性显著(#P<0.05)。

4讨论

随着现代器官移植和再生医学事业的不断发展，人们对细胞的冻存与复苏的要求越来越高。在低温冻存细胞的过程中，细胞内部或周围环境产生冰晶，这会对细胞产生不可逆转的机械损伤(冰损伤)或渗透性休克(溶质损伤)，进而引起细胞发生凋亡。目前已有文章报道，冷冻复苏后一方面会使精子细胞内ROS含量增加，另一方面会降低细胞内一些清除自由基的酶活性。

氢气作为自然界中最简单的小分子，在生物学上被认为是惰性气体。然而，近年来，大量的研究发现，氢气可作为一种还原性物质，具有抗氧化，抗炎症，抗溶血，阻止细胞凋亡及信号调节的作用，可治疗多种疾病，如衰老、糖尿病、动脉粥样硬化等。另外，氢气分子可以轻易的透过细胞的膜结构，特异性的结合细胞中的一些自由基，使得细胞在氧化应激的过程中，受到的氧化损伤程度降低，进而减少细胞的凋亡。

太和香椿作为一种乔木蔬菜，150种蔬菜中抗氧化性最好，并且在药物开发上，也具有很高的利用价值。本文主要以鸡血细胞作为实验对象，发现在细胞冻存前添加6mg/L的香椿叶多糖能够明显的提高细胞冻存复苏后的细胞活力，降低细胞的溶血程度，并且在使用香椿叶多糖作为冻存液后，再通入缓慢氢气5min后，能够更加有效地提高细胞的活力。也就是说，氢气与6mg/L的香椿叶多糖配伍使用在细胞冻存过程中，在细胞的存活状态、活力、溶血度方面，明显比单个药物处理的效果好，而且两者在细胞冻存保护方面具有一定的协同作用。

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于保护血细胞的中药提取物的制备方法，所述中药提取物的活性成分来自香椿。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述中药提取物的活性成分来自香椿的多糖；和/或所述保护血细胞是对血细胞的冻存的保护；和/或所述血细胞是鸡血细胞。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述中药提取物的制备方法包括如下步骤：

(a)煎煮香椿，过滤，取滤液，形成第一混合物；

(b)用乙醇处理所述第一混合物，形成第二混合物；

(c)抽滤所述第二混合物，得滤液，形成第三混合物；

(d)离心所述第三混合物，取上清，即初级香椿提取物溶液。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述中药提取物的制备方法还包括如下步骤：

(e)除去所述初级香椿提取物溶液中的蛋白，得到香椿提取物粗品；

优选地，所述中药提取物的制备方法还包括如下步骤：

(f)将所述香椿提取物粗品冻干。

5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：

所述香椿选自香椿叶粉末；

可选地，在步骤(a)之前，先用水浸泡香椿，优选15-45min，更优选30min；

可选地，用水煎煮步骤(a)产生的药渣，过滤，取滤液与步骤(a)产生的所述滤液合并使用；

优选地，在步骤(b)中，用50-70％优选60％的乙醇处理所述第一混合物，形成所述第二混合物；

可选地，用乙醇洗涤步骤(a)产生的滤渣，过滤，取滤液与步骤(b)产生的所述第二混合物合并使用；

可选地，在步骤(c)中，使用真空抽滤泵在0.5-1.0bar下进行抽滤，优选地，使用真空抽滤泵在0.8bar下进行抽滤；

可选地，在步骤(c)之前，静置所述第二混合物，优选12-36h，更优选24h；

可选地，在步骤(d)中，3000-5000r/min离心所述第三混合物10-30min，优选4000r/min离心20min；

可选地，在步骤(e)中，将所述初级香椿提取物溶液与Sevage试剂按照体积比3-5:1优选4：1混合，振荡，静置，取出上清液，得到所述香椿提取物粗品，其中，所述Sevage试剂的成分为体积比为3-5:1优选4:1的氯仿与正丁醇混合液；

可选地，在步骤(f)中，在-80℃冰箱冷冻6-24h优选12h，再置于冻干机中冷冻干燥。

6.一种用于保护血细胞的中药提取物，所述中药提取物是通过权利要求1-5中任一项所述的方法制备得到的。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法或如权利要求6所述的中药提取物在制备细胞冻存保护剂中的用途。

8.一种用于保护冻存血细胞的保护方法，所述保护方法包括向血细胞冻存溶液添加如权利要求6所述的中药提取物和氢气。

9.如权利要求8所述的保护方法，所述保护方法包括如下步骤：

(i)在所述血细胞冻存溶液中添加如权利要求6所述的中药提取物，形成第四混合物；

(ii)取血液，加入抗凝剂，稀释到目的浓度，形成第一冷冻血液混合物；

(iii)将所述第四混合物加入所述第一冷冻血液混合物，形成第二冷冻血液混合物；

(iv)向所述第二冷冻血液混合物中通入氢气，形成第三冷冻血液混合物，对所述第三冷冻血液混合物进行冷冻储存。

10.如权利要求9所述的保护方法，其特征在于：

所述血细胞冻存溶液的成分为：按照体积比5-15％DMSO、60-80％DMEM、5-15％FBS，且总体积为100％，优选10％DMSO、70％DMEM、20％FBS；和/或

在步骤(i)中，以所述血细胞冻存溶液为溶剂，所述中药提取物的浓度为：1-15mg/L，优选2-10mg/L，更优选6mg/L；和/或

所述抗凝剂为肝素；和/或

在步骤(ii)中，采用的pH＝6.9的PBS缓冲液稀释所述血液，可选，稀释20-50倍体积，优选稀释40倍体积；和/或

在步骤(iii)中，所述第四混合物以1:2-10优选1:5的体积比加入所述第一冷冻血液混合物；和/或

在步骤(iv)中，向所述第二冷冻血液混合物中通入氢气的步骤为：将氢气缓慢的通入所述第二冷冻血液混合物中，持续3-10min，优选5min，优选通入氢气的速度为0.04-0.06L/min，更优选0.05L/min。