CN108392518A - 香椿提取物及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种香椿提取物的制备方法，包括步骤1：取香椿材料在乙醇中超声波辅助提取；步骤2：取滤液挥发掉乙醇，得滤渣；步骤3：离心所述滤渣后得香椿粗提取物，加蒸馏水稀释成香椿提取物稀释液备用；步骤4：纯化所述香椿粗提取物稀释液。通过该方法制备的香椿提取物，特别是香椿花提取物，能够有效地降低体内α‑淀粉酶活性，降低体内α‑葡萄糖苷酶活性，降低体内血糖含量，进而是制备治疗或缓解糖尿病的药物或保健品中的良好选择。
Description
技术领域
本发明属于医学领域，涉及香椿提取物及其制备方法与用途，特别涉及香椿花提取物及其制备方法与在治疗或缓解糖尿病中的用途。
背景技术
香椿Toonasinensis(A.Juss.)Roem.为楝科椿属植物，香椿叶中含有丰富的黄酮、皂苷、酚类等生物性活成分。安徽省太和县栽种香椿的历史非常悠久，且品质较高，唐代时曾用此物作为贡礼，清朝时被御封为“贡椿”。香椿花又名椿树子、椿花,具有祛风、散寒止痛之功效，常被用来治疗头痛、偏头痛、风湿性关节痛等症，民间流传着香椿煎煮可预防糖尿病的说法。香椿抗糖尿病的作用研究已经引起国内外学者的高度关注，并已取得了一些重要成果。但是现有的做法是用整株香椿提取活性成分，由于香椿不同器官部位的活性成分及其含量都不完全相同，药效会不同，另一方面，不同器官部位的非药效成分的组成和含量也不完全相同，特别地，起到副作用的成分不同，因此，完全有必要选择药效最好的器官部位入药，来提高药效，降低不良反应，但现有的报道只单独探究了香椿提取物的降糖作用，并没有对香椿不同部位的提取物的降糖效果进行系统的对比，选出最优器官部位。
参考文献：
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发明内容
为了解决现有技术的不足，本研究首次对太和香椿不同部位提取物的糖尿病关键酶α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性进行比较，结合链脲佐菌素导致的糖尿病小鼠模型进行体内降糖研究，考察太和香椿不同部位提取物的降糖作用，为综合利用太和香椿，有效开发预防糖尿病的相关产品提供了新思路与实验依据。
较为具体地，本发明提供了一种香椿提取物的制备方法，所述香椿提取物是按照如下步骤制备的：
步骤1：取香椿材料在乙醇中超声波辅助提取；
步骤2：取滤液挥发掉乙醇，得滤渣；
步骤3：离心所述滤渣后得香椿粗提取物，加蒸馏水稀释成香椿提取物稀释液备用；
步骤4：纯化所述香椿粗提取物稀释液。
在一些实施方案中，在所述步骤1中，所述乙醇为65-75％的乙醇，优选地70％的乙醇；和/或
在所述步骤1中，所述超声波辅助提取的条件为65-75℃， 35-45KHz，优选地，70℃，40KHz；和/或
在所述步骤1中，用所述超声波辅助提取两次；和/或
在所述步骤1中，所述超声波辅助提取的料液比为1:25-35，优选地所述料液比为1:30；和/或
在所述步骤1中，所述超声波辅助提取的时间为45-75min，优选地60min；和/或
在所述步骤3中，3000-5000r/min离心所述滤渣15-25min，优选地4000r/min离心20min。
在一些实施方案中，所述步骤4分为如下子步骤：
子步骤1：用乙醇浸泡树脂后装柱；
子步骤2：将所述香椿提取物稀释液过所述树脂柱；
子步骤3：吸附完毕后静置；
子步骤4：依次用蒸馏水、乙醇洗柱；
子步骤5：收集乙醇洗脱液，浓缩至无醇味；
可选地，子步骤6：在冰箱冷冻，优选地，在-70到-80℃冰箱冷冻8-15h，更优选地在-80℃冰箱冷冻12h；
可选地，子步骤7：在冻干机中冷冻干燥；
可选地，子步骤8：4℃冰箱中储存；
可选地，所述树脂为AB-8大孔树脂；
可选地，在所述子步骤1中：所述乙醇为92-96％的乙醇，优选地95％乙醇；
可选地，在所述子步骤1中：用乙醇浸泡所述树脂15-30小时后装柱，优选地，用95％乙醇浸泡所述树脂24小时后装柱；
可选地，在所述子步骤2中：将所述香椿提取物稀释液以 6-10mL/min的速度过所述树脂柱，优选地，将所述香椿提取物稀释液以8mL/min的速度过所述树脂柱；
可选地，在所述子步骤4中：所述静置时间为0.8-1.2小时，优选地1小时。
可选地，在所述子步骤4中：所述乙醇为65-75％的乙醇，优选地70％乙醇。
在一些实施方案中，所述香椿材料选自或独立选自香椿花、香椿嫩叶、香椿老叶和香椿种子。
在一些实施方案中，所述香椿材料为香椿花。
本发明还提供了一种香椿提取物，所述香椿提取物是按照前述任一种方法制备的。
本发明还提供了前述香椿提取物在制备治疗或缓解能够通过降低体内α-淀粉酶活性或含量而治疗或缓解的疾病或亚健康状况的药物或保健品中的用途。
本发明还提供了前述香椿提取物在制备治疗或缓解能够通过降低体内α-葡萄糖苷酶活性或含量而治疗或缓解的疾病或亚健康状况的药物或保健品中的用途。
本发明还提供了前述香椿提取物在制备治疗或缓解能够通过降低体内血糖含量而治疗或缓解的疾病或亚健康状况的药物或保健品中的用途。
本发明还提供了前述香椿提取物在制备治疗或缓解糖尿病的药物或保健品中的用途。
香椿提取物，特别是香椿花提取物，能够有效地降低体内α-淀粉酶活性，降低体内α-葡萄糖苷酶活性，降低体内血糖含量，进而是制备治疗或缓解糖尿病的药物或保健品中的良好选择。
附图说明
图1为太和香椿不同部位提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率曲线。
图2为太和香椿不同部位提取物对α-淀粉酶的抑制率曲线。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。
材料与试剂
太和香椿购自安徽太和县，对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷 (PNPG)(上海源叶生物科技公司)、α-葡萄糖苷酶(美国Sigma公司)、α-淀粉酶(美国Sigma公司)，可溶性淀粉(天津博迪化工股份有限公司)、阿卡波糖(上海源叶生物科技有限公司)，其他试剂均为分析纯。
主要仪器
酶标仪(Thermo)、冷冻干燥机(SIM international Group)、烘干箱(上海精宏实验设备有限公司)、-80℃冰箱(Thermo)、快速血糖仪(上海强生医疗器材有限公司)、中药粉碎机(浙江省永康市溪岸五金药具厂)、电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)、台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、恒温水浴锅(北京东方精瑞科技发展有限公司)。
实施例1：太和香椿提取物的制备
分别独立称取太和香椿不同器官部位(花、嫩叶、老叶、种子) 粉末20g于烧杯中，以70％乙醇超声波辅助提取(70℃，40KHz)，重复两次，提取料液比为1:30，时间为60min，合并滤液，挥发浓缩至无乙醇味，4000r/min离心20min，加入100mL蒸馏水稀释备用。
取100gAB-8大孔树脂，95％乙醇浸泡24小时后装柱，将香椿不同部位粗提物稀释液以8mL/min的速度过AB-8树脂柱，吸附完毕后静置1h，依次用蒸馏水、70％乙醇洗柱，收集乙醇洗脱液，浓缩至无醇味，在-80℃冰箱冷冻12h，再置于冻干机中冷冻干燥，得到香椿叶，花，种子提取物粉末，4℃冰箱中储存备用。
实施例2：太和香椿不同部位提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性
α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过延缓碳水化合物的消化和吸收达到降低餐后血糖的目的，其特点是在碳水化合物消化的最后一步抑制双糖降解为单糖，α-葡萄糖苷酶抑制剂还能抑制蛋白糖基化和脂类糖基化过程，具有防治肥胖症、抗肿瘤，抗病毒和和免疫刺激活性等作用。
α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定参考文献方法并稍作修改[1]。具体步骤为：将样品、磷酸钾缓冲液(0.1mol·L-1，pH 6.8)各240μL混合，加入α-葡萄糖苷酶(0.25U·m L－1)充分震荡至均匀，37℃水浴锅中反应5min后，其中药物组和阳性对照组加入60μL 5mmoL·L- 1pNPG， 37℃酶解40min后，加入60μL DNS显色试剂后沸水浴中反应5min，取出冷却至室温，每个处理分别做3个重复。分别移取100μL反应液于96孔板孔中，用酶标仪在505nm波长下测定吸光值，取平均值。
阳性对照组采用阿卡波糖。
样品为实施例1所制备的太和香椿花、嫩叶、老叶、种子提取物。
分别用磷酸盐缓冲溶液将各样品和阿卡波糖稀释成0.5mg/mL、1 mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL的样品。
按照上述的方法，向各自的反应孔中加入香椿不同部位不同浓度的提取物和阳性对照。
空白对照组加入等量的磷酸盐缓冲溶液，其他与抑制剂样品组操作相同，各组背景对照是等量对应浓度的抑制剂样品溶液，且用磷酸盐缓冲溶液代替等量的α-葡萄糖苷酶液。
抑制率＝[1-(药物反应组OD-药物对照组OD)/(空白反应组 OD-空白对照组OD)]×100％。
由于香椿提取物本身有颜色干扰，故每个样品做背景对照组以消除颜色干扰。
太和香椿不同部位提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性数据参见表1 和图1。
表1香椿不同部位提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响
如表1和图1所示，当提取物浓度小于1.0mg/mL时香椿老叶提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最强，抑制率43.8％，仅次于同浓度下阿卡波糖的抑制率50.0％，当提取物浓度大于1.0mg/mL时，香椿花提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最强，香椿种子提取物的抑制活性最弱。太和香椿不同部位的提取物对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，在一定范围内与浓度呈正相关趋势。当浓度增加至3mg/mL时，太和香椿花提取物抑制率对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最强为86.7％，仅次于同浓度下阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率(90.5％)。
实施例3:测定太和香椿不同部位提取物对α-淀粉酶抑制活性
α-淀粉酶抑制活性的测定参考文献[2]方法并稍作修改，具体步骤为：分别将α-淀粉酶溶液、实施例1所制备的太和香椿单一部位提取物样品、可溶性淀粉和阿卡波糖用0.1mol·L-1，pH＝6.8磷酸盐缓冲溶液配成所需浓度。
取100μLα-淀粉酶溶液(10U·m L-1，pH＝6.8)于10mL试管中，加入300μL待测液(浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2 mg/mL、3.5mg/mL、3mg/mL)，震荡30s混合均匀，在37℃水浴中活化10min。再加入200μL淀粉溶液(1％)，迅速摇晃至均匀后置于37℃水浴锅中继续反应10min，最后加入200μL DNS显色试剂后沸水浴中反应5min，取出冷水浴至室温，最后加入1mL蒸馏水，每个处理分别做3个重复。
用酶标仪在546nm处测定OD值，取平均值。按照上述的方法，向反应体系中加入香椿不同部位不同浓度的提取物，空白对照组加入等量的磷酸盐缓冲溶液，其他与抑制剂组操作相同，各组背景对照是等量对应浓度的抑制剂溶液，且用磷酸盐缓冲溶液代替等量的α-淀粉酶液。
抑制剂对α-淀粉酶的抑制率：
抑制率＝(1–A00/A01)×100％
A00＝A3-A4，A01＝A1-A2
注：式中A1，A2，A3，A4分别为546nm处空白、空白对照、抑制剂组和背景对照组的吸光值(由于香椿提取物本身有颜色干扰，故每个样品做背景组以消除颜色干扰)。
经测试与计算，太和香椿不同部位提取物不同浓度下对α-淀粉酶抑制抑制率曲线参见图2。具体数值参见表2。
表2 太和香椿不同部位对α-淀粉酶抑制活性的影响
如表1和图1所示，当提取物浓度小于0.5mg/mL时，香椿嫩叶对α-淀粉酶的抑制率最高为27％，仅次于同浓度下阿卡波糖的抑制率 31％，随着浓度的增加，香椿花的抑制活性增强，当浓度增加至 3mg/mL时，抑制率为89％，同浓度下阿卡波糖的抑制率为91％。太和香椿不同部位的提取物对α-淀粉酶均有抑制作用，在一定范围内与浓度呈正相关趋势，当浓度大于1.0mg/mL时香椿花提取物对α- 淀粉酶的抑制活性最强。
这说明香椿花提取物对α-淀粉酶的抑制活性好于香椿其他部位的提取物，且效果与常规α-淀粉酶抑制剂阿卡波糖差不多，有望成为高效的α-淀粉酶抑制剂。
太和香椿不同部位提取物对糖尿病的关键酶α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，当浓度大于1.0mg/mL时，香椿花提取物对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性最强，提示太和香椿花具有很好的降低血糖的功效。
实施例4：太和香椿花提取物对链脲佐菌素糖尿病模型小鼠体重和血糖的影响
通过体外降糖实验得出太和香椿花提取物对糖尿病关键酶α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性最好，因此选用香椿花提取物对糖尿病模型小鼠进行灌胃处理，实验所获数据采用SPSS统计软件进行方差分析，数据采用均值±标准差表示。
参考文献3和文献4的方法，腹腔注射100mg/kg链脲佐菌素糖，制备糖尿病小鼠模型，并将糖尿病小鼠按血糖值随机分为正常对照组 (非糖尿病模型小鼠)、糖尿病模型组(糖尿病模型小鼠不用药)，阿卡波糖组(糖尿病模型小鼠)和太和香椿花提取物低、高剂量组(糖尿病模型小鼠)，每组5只。
正常对照组：生理盐水1ml/100g体重。
糖尿病模型组：生理盐水1ml/100g体重。
阿卡波糖组：100mg/kg体重。
太和香椿花提取物高剂量组：120mg/kg体重。
太和香椿花提取物低剂量组：60mg/kg体重。
不同组动物每天按上述剂量灌胃，每日1次，连续15d，小鼠自由饮水摄食。称量体重和测量血糖前禁食4小时。
太和香椿花提取物对糖尿病小鼠体重的影响结果参见表3。
实验期间，各给药组小鼠"三多一少"症状(即，多饮、多食、多尿，体重减轻)有所缓解，小鼠活动量增加，精神变好。阿卡波糖组与正常组小鼠相比，体重差异显著(P＜0.05)；太和香椿花提取物高剂量组与正常组小鼠相比，差异极显著(P＜0.01)，与模型组小鼠相比，差异显著(P＜0.05)；太和香椿花提取物低剂量组与正常组小鼠相比，差异显著(P＜0.05)，与模型组小鼠比，差异不明显。详见表3。
表3 太和香椿花提取物对糖尿病小鼠体重的影响
注：与正常组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：ΔP＜0.05。
太和香椿花提取物对糖尿病小鼠血糖的影响结果参见表4。
各实验组在给药后，高剂量组和阿卡波糖组小鼠血糖均降低，阿卡波糖组与正常组和模型组相比，血糖显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；高剂量组与正常组相比，差异极显著，有统计学意义 (P＜0.01)；低剂量组给药后血糖没有降低，无显著差异。
表4太和香椿花提取物对糖尿病小鼠血糖的影响
注：与正常组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：ΔP＜0.05。
阿卡波糖是一种α糖苷酶抑制剂，是临床常用的降糖药，可延缓α-葡萄糖苷酶将淀粉等多糖分解成葡萄糖，同时，阿卡波糖还能够延缓肠道对葡萄糖的吸收，从而达到控制餐后血糖升高的治疗效果。虽然阿卡波糖在临床的应用非常广泛，但该药存在的某些不良反应，如消化道反应，皮肤过敏等。根据检索世界卫生组织(WHO)药品不良反应监测中心数据库，其中涉及消化系统的不良反应居首位(804 例次，占总例次的38.8％)，其次为肝胆系统(222例次，占总例次的 10.7％)及皮肤及其附件损害(203例次，占9.8％)。另外，糖尿病患者常伴有心脏病变、肾脏病变等并发症，临床合并用药情况较为普遍，虽然阿卡波糖药品说明书中已注明与某些药物的相互作用，但随着各种新上市药物用于临床，联合用药过程中产生新的或严重的药物相互作用也成为影响药品安全性的不容忽视的因素。
目前文献报道的关于香椿花药用成份和药用价值的研究较少，高鷃铭等对香椿花中的挥发性成份进行了研究，通过气相色谱-质谱 (GC-MS)联用方法鉴定出37种物质，主要为萜烯类化合物，有一定的抗肿瘤、抗真菌、平喘等药理作用；关于香椿花中多酚的研究及药理作用尚未见报道。
通过上述事实可以看出，太和香椿花提取物具有较好的降低血糖的作用，且药性要比阿卡波糖更温和，对体弱的糖尿病患者更有利，不会产生强烈降血糖所造成的应激效应。对机体的整体调节作用要比单纯强烈降血糖更明显。
以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种香椿提取物的制备方法，其特征在于，所述香椿提取物是按照如下步骤制备的：
步骤1：取香椿材料在乙醇中超声波辅助提取；
步骤2：取滤液挥发掉乙醇，得滤渣；
步骤3：离心所述滤渣后得香椿粗提取物，加蒸馏水稀释成香椿提取物稀释液备用；
步骤4：纯化所述香椿粗提取物稀释液。
2.如权利要求1所述的香椿提取物的制备方法，其特征在于：
在所述步骤1中，所述乙醇为65-75％的乙醇，优选地70％的乙醇；和/或
在所述步骤1中，所述超声波辅助提取的条件为65-75℃，35-45KHz，优选地，70℃，40KHz；和/或
在所述步骤1中，用所述超声波辅助提取两次；和/或
在所述步骤1中，所述超声波辅助提取的料液比为1:25-35，优选地所述料液比为1:30；和/或
在所述步骤1中，所述超声波辅助提取的时间为45-75min，优选地60min；和/或
在所述步骤3中，3000-5000r/min离心所述滤渣15-25min，优选地4000r/min离心20min。
3.如权利要求1所述的香椿提取物的制备方法，其特征在于：
所述步骤4分为如下子步骤：
子步骤1：用乙醇浸泡树脂后装柱；
子步骤2：将所述香椿提取物稀释液过所述树脂柱；
子步骤3：吸附完毕后静置；
子步骤4：依次用蒸馏水、乙醇洗柱；
子步骤5：收集乙醇洗脱液，浓缩至无醇味；
可选地，子步骤6：在冰箱冷冻，优选地，在-70到-80℃冰箱冷冻8-15h，更优选地在-80℃冰箱冷冻12h；
可选地，子步骤7：在冻干机中冷冻干燥；
可选地，子步骤8：4℃冰箱中储存；
可选地，所述树脂为AB-8大孔树脂；
可选地，在所述子步骤1中：所述乙醇为92-96％的乙醇，优选地95％乙醇；
可选地，在所述子步骤1中：用乙醇浸泡所述树脂15-30小时后装柱，优选地，用95％乙醇浸泡所述树脂24小时后装柱；
可选地，在所述子步骤2中：将所述香椿提取物稀释液以6-10mL/min的速度过所述树脂柱，优选地，将所述香椿提取物稀释液以8mL/min的速度过所述树脂柱；
可选地，在所述子步骤4中：所述静置时间为0.8-1.2小时，优选地1小时。
可选地，在所述子步骤4中：所述乙醇为65-75％的乙醇，优选地70％乙醇。
4.如权利要求1-3中任一项所述的香椿提取物的制备方法，其特征在于，所述香椿材料选自或独立选自香椿花、香椿嫩叶、香椿老叶和香椿种子。
5.如权利要求1-4中任一项所述的香椿提取物的制备方法，其特征在于，所述香椿材料为香椿花。
6.一种香椿提取物，其特征在于，所述香椿提取物是按照权利要求1-5中任一项所述的方法制备的。
7.如权利要求6所述的香椿提取物在制备治疗或缓解能够通过降低体内α-淀粉酶活性或含量而治疗或缓解的疾病或亚健康状况的药物或保健品中的用途。
8.如权利要求6所述的香椿提取物在制备治疗或缓解能够通过降低体内α-葡萄糖苷酶活性或含量而治疗或缓解的疾病或亚健康状况的药物或保健品中的用途。
9.如权利要求6所述的香椿提取物在制备治疗或缓解能够通过降低体内血糖含量而治疗或缓解的疾病或亚健康状况的药物或保健品中的用途。
10.如权利要求6所述的香椿提取物在制备治疗或缓解糖尿病的药物或保健品中的用途。
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