CN106046014B - 一种辛可耐因Ib的制备方法及其应用 - Google Patents

一种辛可耐因Ib的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种辛可耐因Ib的制备方法，所述方法以蔷薇科植物、葡萄科葡萄属植物和菝契科植物的根、果实、茎和/或叶的醇提物为原料，通过多次液相色谱分离富集和精制得到纯度较高的辛可耐因Ib。本发明还提供了辛可耐因Ib在制备用于防治糖尿病或糖尿病血管并发症的药物中的应用，以及含有辛可耐因Ib的药物组合物。辛可耐因Ib具有降低糖尿病大鼠血脂的功效，对控制糖尿病血管并发症的进展也有很好的协同作用，有助于防治代谢综合症，使其在防治糖尿病血管并发症方面的优势更加明显，高效无毒，安全性极高，因此在临床防治糖尿病血管并发症中具有广阔的应用前景。

Description

一种辛可耐因Ib的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种辛可耐因Ib的制备方法，以及辛可耐因Ib在制备用于防治糖尿病及其血管并发症的药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。最近的流行病调查证实，我国的糖尿病患病率高达11.6％，在糖尿病人口绝对数方面已成为全球之冠。此外，据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。而糖尿病的危害主要来自糖尿病血管并发症，长期血糖增高会诱发大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等。因此对糖尿病血管并发症的防治研究极为迫切。糖尿病个体体内蛋白质发生非酶糖基化致使非酶糖基化代谢产物增多，是导致糖尿病血管并发症的重要原因之一。非酶糖基化代谢产物增多，可引发心肌细胞代谢紊乱、心肌细胞钙转运缺陷，导致心肌细胞功能异常；同时，非酶糖基化代谢产物能使肾小球合成Ⅳ型胶原，内皮、系膜和平滑肌细胞增殖。因此，糖尿病高糖状态下非酶糖基化代谢产物过多是糖尿病心肌疾病和糖尿病肾病等糖尿病并发症的发生和发展的共同诱因之一。
自由基清除剂可以显著抑制非酶糖基化代谢产物的形成，糖尿病时增强的氧化应激可以加速非酶糖基化代谢产物的形成，进而促进糖尿病血管并发症的发展。因此，抑制非酶糖基化反应，降低非酶糖基化代谢产物生成是防治糖尿病血管并发症的重要策略。
辛可耐因Ib是一种具有抗氧化作用的化合物，最早在蔷薇科植物枇杷中分离获得，后来陆续在蔷薇科枇杷属的山茶和红树科的秋茄以及菝契科粗茎菝契等植物中被发现。辛可耐因Ib是一种黄烷3-醇类的鞣质类成分，结构式如式Ⅰ所示。该化合物是通过C3-C6连接构成，显著区别于通过C4-C8或者C4-C6的连接方式构成的原花青素类成分。该化合物具有很强的抗氧化作用，可有效清除DPPH自由基。目前尚没有关于辛可耐因Ib如何在植物中高效提取的记载，也没有将其应用在药物中的报道。
发明内容
本发明的发明人意外地发现了辛可耐因Ib存在于苹果的果实中，并且在进一步的研究中发现辛可耐因Ib能够降低大鼠的血糖浓度，同时能够抑制糖尿病大鼠体内非酶糖基化反应。因而，本发明的目的在于提供一种辛可耐因Ib的制备方法，同时还提供了辛可耐因在制备用于防治糖尿病及糖尿病血管并发症的药物中的应用。
一种辛可耐因Ib的制备方法，所述方法包括：
1)提供粗提物，常温下将所述粗提物溶于水中得到粗提物水溶液；其中，所述粗提物为植物的根、果实、茎和/或叶的醇提物，所述植物选自蔷薇科植物、红树科植物、葡萄科葡萄属植物和菝契科植物中的一种或多种；优选地，将所述粗提物以质量比1：10的比例溶于水中；
2)将所述粗提物水溶液经HP20型大孔树脂吸附，然后以乙醇水溶液梯度洗脱，收集富含辛可耐因Ib的洗脱液，合并所述洗脱液，减压浓缩，得辛可耐因Ib的初级富集物；
3)将步骤2)得到的初级富集物溶于等质量的甲醇，得到初级富集物的甲醇溶液，将所述初级富集物的甲醇溶液与60～100目的硅胶粉混合，减压拌样至干，干法上样，以二氯甲烷-甲醇为洗脱液过硅胶色谱柱梯度洗脱分离，收集并合并富含辛可耐因Ib的洗脱液，减压浓缩至干，得辛可耐因Ib的次级富集物；其中，所述硅胶粉的质量为所述初级富集物质量的1.5～2.5倍；所述硅胶色谱柱中硅胶质量为所述初级富集物质量的10～20倍；
4)将所述次级富集物溶解于2倍质量的水中得到次级富集物的水溶液，将所述次级富集物的水溶液以甲醇水溶液为梯度洗脱液通过大孔聚合物填料色谱柱分离，收集并合并富含辛可耐因Ib的洗脱液，减压浓缩至干，得辛可耐因Ib的三级富集物；优选地，所述大孔聚合物填料色谱柱为Toyopearl HW-40柱；
5)将4)得到的三级富集物以50％甲醇水溶液为洗脱液通过C18柱精制，在254nm检测收集辛可耐因Ib的色谱峰，收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥得到辛可耐因Ib；优选地，所述C18柱为Cosmosil ODS柱。
在根据本发明的一个实施方案中，所述蔷薇科植物为蔷薇科苹果属植物。
在根据本发明的一个实施方案中，所述粗提物为苹果多酚。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)中梯度洗脱的顺序为水、体积百分比浓度分别为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液；优选地，每半个柱床体积作为一个接收体积检测洗脱样品。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述梯度洗脱的二氯甲烷-甲醇体积比梯度依次为95:5、93:7、92:8、91:10；优选地，每半个柱床体积作为一个接收体积检测洗脱样品。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤4)中所述梯度洗脱的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比梯度依次为10％、15％、20％、25％；优选地，每四分之一个柱床体积作为一个接收体积检测洗脱样品。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)～5)中通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测洗脱样品是否含有辛可耐因Ib。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)～5)中减压浓缩的条件为温度≤60℃，真空度为0.06～0.08Mpa。
本发明还提供了通过上述的方法制备的辛可耐因Ib在制备用于防治糖尿病或糖尿病血管并发症的药物中的应用。
本发明进一步提供了一种用于防治糖尿病或糖尿病血管并发症的药物组合物，所述药物组合物包含辛可耐因Ib。
另一方面，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人发现辛可耐因Ib能够降低大鼠的血糖浓度，同时能够抑制糖尿病大鼠体内非酶糖基化反应，可以通过辛可耐因Ib的抗氧化能力和抑制非酶糖基化代谢产物的形成，在实现控制糖尿病血管并发症同时其还可以降低糖尿病大鼠血脂，对控制糖尿病血管并发症的进展有很好的协同作用，有助于防治代谢综合症。辛可耐因Ib高效无毒，安全性极高，在临床防治糖尿病血管并发症中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为检测辛可耐因Ib的液相色谱峰。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
实施例1辛可耐因Ib的液相检测方法
色谱柱：C-18 250×4.6mm
检测波长：280nm
流速：1.0ml/min
流动相：A：1％磷酸
B：乙腈:水＝40:60
检测辛可耐因Ib的液相色谱峰如图1所示。
实施例2由苹果多酚提取辛可耐因Ib
1)200g苹果多酚(天津市尖峰天然产物研究研究开发有限公司提供，多酚含量80％)中加入2000mL的水常温搅拌溶解，备用；
2)大孔树脂吸附分离：将1)中苹果多酚溶液经HP20型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每半个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得辛可耐因Ib的初级富集物；
3)硅胶柱分离：大孔树脂吸附分离后得到的辛可耐因Ib的初级富集物用等倍量的甲醇溶解以1.5—2.5倍量比例加入60-100目硅胶减压拌样至干，干法上样，用10-20倍量的硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇体积比为95:5，93:7，92:8，91:10梯度洗脱，半个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08Mpa减压浓缩至干，得辛可耐因Ib的次级富集物，含量为32.1％；
4)Toyopearl HW-40分离：将辛可耐因Ib次级富集物用2倍水溶解，经ToyopearlHW-40柱色谱分离，用甲醇-水的体积比为10％，15％，20％，25％梯度洗脱，每四分之一个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，得辛可耐因Ib的三级富集物，含量为67.2％；
5)制备液相色谱精制：将(4)中辛可耐因Ib的三级富集物利用制备液相色谱精制，Cosmosil ODS柱(5u，10×250mm)254nm检测，50％甲醇水分离，收集辛可耐因Ib的色谱峰，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为16，冷冻干燥得到辛可耐因Ib(460mg)。
利用ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR等光谱手段并于文献数据进行对照，鉴定了根据上述方法分离得到的辛可耐因Ib的结构。在此基础上利用HPLC的面积归一化进行标定，辛可耐因Ib含量为97％。辛可耐因Ib为淡黄色粉末，聚酰胺薄膜以正丁醇-醋酸-水(4:1:3)展开，Rf为0.4，5％三氯化铁乙醇溶液显单一蓝色斑点。HR ESI-MS：(negative)m/z：451.0986[M-H]-，计算值(451.1035)，可以确定该化合物的分子量为452。结合氢谱碳谱给出的信息，确定其分子式为C24H20O9，计算其不饱和度为15。其1H-NMR(300MHz，在DMSO中)中信号交叠较严重，其13C-NMR(75MHz，在DMSO中)中信号清晰，与文献相对照进行了全归属，鉴定为辛可耐因Ib，结果见表1。
表1本发明中化合物的1H，13C-NMR数据
实施例3由葡萄藤中提取辛可耐因Ib
1)20kg葡萄藤用60％乙醇8倍量、6倍量连续回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至糖度40，加入2倍量水分散，备用。
2)大孔树脂吸附分离：将1)中获取的葡萄藤提取溶液经HP20型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每半个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得辛可耐因Ib的初级富集物，含量为8.2％；
3)硅胶柱分离：大孔树脂吸附分离后得到的辛可耐因Ib的初级富集物用等倍量的甲醇溶解以1.5—2.5倍量比例加入60-100目硅胶减压拌样至干，干法上样，用10-20倍量的硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇体积比为95:5，93:7，92:8，91:10梯度洗脱，半个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08Mpa减压浓缩至干，得辛可耐因Ib的次级富集物，含量为28.4％；
4)Toyopearl HW-40分离：将辛可耐因Ib次级富集物用2倍水溶解，经ToyopearlHW-40柱色谱分离，用甲醇-水的体积比为10％，15％，20％，25％梯度洗脱，每四分之一个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，得辛可耐因Ib的三级富集物，含量为63.7％；
5)制备液相色谱精制：将(4)中辛可耐因Ib的三级富集物利用制备液相色谱精制，Cosmosil ODS柱(5u，10×250mm)254nm检测，50％甲醇水分离，收集辛可耐因Ib的色谱峰，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为16，冷冻干燥得到辛可耐因Ib(235mg)。
实施例4由红树科植物秋茄中提取辛可耐因Ib
1)20kg秋茄茎、叶，破碎后用60％乙醇8倍量、6倍量连续回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至糖度40，加入2倍量水分散，备用。
2)大孔树脂吸附分离：将1)中获取的秋茄提取溶液经HP20型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每半个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得辛可耐因Ib的初级富集物，含量为6.3％；
3)硅胶柱分离：大孔树脂吸附分离后得到的辛可耐因Ib的初级富集物用等倍量的甲醇溶解以1.5～2.5倍量比例加入60-100目硅胶减压拌样至干，干法上样，用10-20倍量的硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇体积比为95:5，93:7，92:8，91:10梯度洗脱，半个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08Mpa减压浓缩至干，得辛可耐因Ib的次级富集物，含量为27.9％；
4)Toyopearl HW-40分离：将辛可耐因Ib次级富集物用2倍水溶解，经ToyopearlHW-40柱色谱分离，用甲醇-水的体积比为10％，15％，20％，25％梯度洗脱，每四分之一个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，得辛可耐因Ib的三级富集物，含量为71.3％；
5)制备液相色谱精制：将(4)中辛可耐因Ib的三级富集物利用制备液相色谱精制，Cosmosil ODS柱(5u，10×250mm)254nm检测，50％甲醇水分离，收集辛可耐因Ib的色谱峰，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为16，冷冻干燥得到辛可耐因Ib(176mg)。
实施例5由菝契中提取辛可耐因Ib
1)20kg菝契茎和叶，破碎后用60％乙醇8倍量、6倍量连续回流提取2次，合并提取液，减压浓缩至糖度40，加入2倍量水分散，备用。
2)大孔树脂吸附分离：将1)中获取的菝契提取溶液经HP20型大孔树脂吸附，用水、体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每半个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为40，得辛可耐因Ib的初级富集物，含量为9.6％；
3)硅胶柱分离：大孔树脂吸附分离后得到的辛可耐因Ib的初级富集物用等倍量的甲醇溶解以1.5—2.5倍量比例加入60-100目硅胶减压拌样至干，干法上样，用10-20倍量的硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇体积比为95:5，93:7，92:8，91:10梯度洗脱，半个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08Mpa减压浓缩至干，得辛可耐因Ib的次级富集物，含量为29.7％；
4)Toyopearl HW-40分离：将辛可耐因Ib次级富集物用2倍水溶解，经ToyopearlHW-40柱色谱分离，用甲醇-水的体积比为10％，15％，20％，25％梯度洗脱，每四分之一个柱床体积作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含辛可耐因Ib的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为20，得辛可耐因Ib的三级富集物，含量为70.5％；
5)制备液相色谱精制：将(4)中辛可耐因Ib的三级富集物利用制备液相色谱精制，Cosmosil ODS柱(5u，10×250mm)254nm检测，50％甲醇水分离，收集辛可耐因Ib的色谱峰，并将其在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，糖度为16，冷冻干燥得到辛可耐因Ib(149mg)。
实施例6辛可耐因Ib降血糖及抑制非酶糖基化的活性测试
1.试验材料：动物：雄性Wista大鼠，北京动物中心提供。试剂：辛可耐因Ib(天津市科曼思特医药科技发展有限公司自制，纯度为98％)；链尿佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)均为美国Sigma公司产品；羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)为美国Sigma公司产品，北京京科公司分装；仪器：DV650全自动生化仪，SHIMAZU 1601紫外可见分光光度计，微量移液器，电子分析天平，旋涡混匀器。
2.试验方法：(1)糖尿病动物模型制备：180-220g雄性Wistar大鼠90只，适应性喂养三天，随机选12只大鼠作为正常对照组。余78只大鼠空腹12h后左腹腔注射STZ60mg/kg，注射后均给予正常饮食，12h后测大鼠空腹尾静脉血糖，血糖>16.7mmol/L为糖尿病造模成功。取造模成功者60只纳入试验，余弃去。(2)动物分组及喂养：将糖尿病大鼠随机分为5组，空白对照组、AG治疗组、辛可耐因Ib低、中和高剂量组，每组12只。空白对照组用自来水灌胃，AG治疗组用150mg/kg·d的AG灌胃，辛可耐因Ib低、中和高剂量组分别用30、60、90mg/(kg·d)的辛可耐因Ib进行灌胃，每日下午4时灌胃1次，各组均给予标准饲料常规喂养，自由进食及饮水，不使用胰岛素。在喂养过程中，各组大鼠均有正常死亡，试验开始时各组具有12只大鼠，试验结束时，各组均有10只大鼠。(3)标本取材：喂养12周后，大鼠空腹6h，称体重，2％戊巴比妥钠腹腔麻醉，挖眼球取血5ml备用。另剖腹取出大鼠双肾，双肾去除包膜称重。取部分肾脏置入液氮中冷冻。(4)肾皮质中体内非酶糖基化终产物(AGEs)的检测：用荧光法测AGEs。取肾皮质0.5g，剪成小块，加生理盐水1ml磨成匀浆，2500r/min离心10min，弃上清，在沉淀中加入氯仿-甲醇(2:1)5ml去脂，4℃振摇过夜。4000r/min离心15min，弃上清，留沉淀，用2ml甲醇及0.5ml蒸馏水冲洗沉淀。3000r/min离心7min，重复冲洗3次。新鲜配置0.1mol/L HEPES缓冲液：用总量为225ml的蒸馏水溶解NaCl 9.36g，KCl 0.433g，Na2HPO4·2H2O 0.158g，葡萄糖1.17g，HEPES 5.85g，用1mol/LNaOH调节pH值至7.05，再用蒸馏水定容至250ml。将沉淀颗粒悬浮在含有2ml的HEPES缓冲液的试管中，每试管加入280uⅣ型胶原酶，并作空白胶原酶对照管，37℃恒温震荡24h后，3500r/min离心15min，上清液即为被胶原酶消化的肾皮质胶原。用荧光光度计在激发波长370nm、发射波长440nm处测定荧光强度，其数值用空白胶原酶校正。然后用氯胺T法测定消化液中的羟脯氨酸含量。AGEs含量以每毫克羟脯氨酸(Hyp)所含荧光强度为一个单位(AU/mg Hyp)表示。(5)血糖的检测：取上述大鼠自凝血2ml，利用全自动生化仪测定血糖。
3.试验结果：(1)各组实验大鼠形态、肾重、体重及肾重/体重的比较：所有成模糖尿病大鼠均出现多饮、多食、多尿的表现，由于消瘦及多食逐渐呈小头大腹的形态，与正常对照组相比，毛色暗淡无光泽，尾静脉采血后伤口不易愈合。糖尿病大鼠12周时体重较正常对照组显著降低，肾重/体重比值明显升高；AG治疗组和辛可耐因Ib各剂量组的肾重/体重比值比对照组低(P<0.01)，结果见表2。
表2各组大鼠体重、肾重、肾重/体重比较(x±s)
注：方差分析与t检验，与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，与空白对照组比较，均为P<0.01。
(2)血清血糖及肾皮质AGEs：试验结束时，各试验组血糖值仅辛可耐因Ib高剂量组与空白对照组存在显著性差异。同时AG治疗组、辛可耐因Ib各剂量组与正常对照组、空白对照组相比，大鼠肾皮质AGEs均有非常显著性差异(**P<0.01)，AG治疗组AGEs低于辛可耐因Ib低剂量组(ΔP<0.05)，辛可耐因Ib高剂量组低于辛可耐因Ib低剂量组(#P<0.01)，辛可耐因Ib中、高剂量组之间以及与AG治疗组相比较无显著性。(见表3)。
表3各组大鼠的血糖及肾皮质AGEs测定结果
结果显示：辛可耐因Ib高剂量组具有一定的降血糖功效，同时高中低剂量组均能抑制肾皮质AGE的形成，从而抑制非酶糖基化，防治糖尿病血管综合症的发生。
实施例7辛可耐因Ib对胰岛细胞的保护作用
1.实验仪器
超低温冰箱(日本Sanyo公司)；全无氟冰箱(中国海尔公司)；电子恒温水浴锅(天津市达北实验仪器厂)；精密电子天平(瑞士Mettler公司)；倒置光学显微镜(日本Nikon公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；全波长酶标仪(德国Tecan公司)；电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)；恒温振荡器(太仓市实验设备厂)；塑料薄膜封口机(温州正雄机械有限公司)；超纯水系统(美国Minipore公司)压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司)；96wells细胞培养板(Corning，USA)微孔过滤器(美国greiner公司)。
2实验试剂
胎牛血清浙江四季青生物工程有限公司；RIPM 1640培养液北京索莱宝科技有限公司；MTT试剂北京鼎国昌盛生物技术公司；胰蛋白酶北京鼎国昌盛生物技术有限公司；无水乙醇和二甲基亚枫，分析纯由天津市化学试剂三厂提供。
磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl 8.0g，KCl 0.20g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.20g，溶于600ml纯水，调节pH7.2-7.4，定容至1L。
0.25％胰蛋白酶溶液：Trypsin 2.5g，溶于600ml PBS中，调节pH至7.2-7.4，定容至1L。4℃放置过夜使胰酶充分溶解，然后在超净工作台中用无菌的0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装后保存于-20℃，应注意避免反复冻融；
胎牛血清(FBS)灭活：取出胎牛血清，放置于4℃过夜，溶解后于56℃水浴灭活30min。超净工作台中分装并保存于-20℃。
MTT溶液：称取50mg MTT粉末，溶于10ml 0.01M pH7.4的PBS中，混匀，在超净工作台中用无菌的0.22μm微孔滤膜除菌过滤，分装后避光保存于-20℃，4℃避光保存时间为一周。
辛可耐因Ib配制：称取药物，用DMSO将其充分溶解，-20℃避光保存。给药前，用培养液稀释至所需浓度。
3、实验细胞
RIN-m5F胰岛β细胞，由中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所提供。
4.实验方法
(1)RIN-m5f细胞常规培养：
胰岛RIN-m5Fβ细胞使用RPMI 1640培养液培养。培养液含10％胎牛血清，50U/ml青霉素和50μg/L的链霉素，在37℃、5％CO2培养箱内培养。根据细胞状态，使用3ml/次PBS轻洗细胞更换培养液。待细胞长至80％汇合以上，用PBS轻洗细胞，充分去除血清后，用3ml的0.25％胰蛋白酶消化。在显微镜下观察，约30s，细胞变圆后立即加入3ml完全培养液终止消化。用5ml的枪轻轻吹打培养瓶壁，收集细胞。1000rpm离心5min，弃上清，用完全培养液吹悬细胞，按照细胞多少传代，隔天换液。
(2)Cinchonain Ib对于胰岛RIN-m5f细胞的促增殖作用。
取对数生长期胰岛RIN-m5Fβ细胞，消化后计数，调整细胞密度，接种于96孔板，每孔100μl细胞液，每孔细胞数为1.5×104个/孔。按照实验设计分组，每个实验组设置5个复孔，实验重复3次。24h后按实验分组加入100μl含不同浓度药物的培养液，继续培养24h，然后加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，孵育4h，吸去上清液，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min，用全波长酶联免疫检测仪于490nm处检测各孔吸光度值，考察单体化合物辛可耐因Ib各个浓度对胰岛RIN-m5Fβ细胞增殖程度。
5.实验结果
实验结果显示，与空白组比较，辛可耐因Ib(10-1mmol/L、10-2mmol/L、10-3mmol/L)均能特别显著地促进胰岛RIN-m5Fβ细胞的增殖(P<0.01)，结果见表4。
表4不同浓度cinchonain Ib对胰岛β细胞增殖的影响(X±SD)
注：与空白组相比，**表示P＜0.01
根据上述体外实验发现，辛可耐因Ib对胰岛RIN-m5Fβ细胞具有促增殖作用，提示辛可耐因Ib具有促进胰岛细胞增殖，具有潜在的抗胰岛细胞凋亡作用，从而进一步推测其具有保护胰岛细胞，改善胰岛细胞功能，具有潜在的降血糖活性。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (12)

1.一种辛可耐因Ib的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)提供粗提物，常温下将所述粗提物溶于水中得到粗提物水溶液；其中，所述粗提物为植物的根、果实、茎和/或叶的醇提物，所述植物选自蔷薇科植物、红树科植物、葡萄科葡萄属植物和菝契科植物中的一种或多种；
2)将所述粗提物水溶液经HP20型大孔树脂吸附，然后以乙醇水溶液梯度洗脱，收集富含辛可耐因Ib的洗脱液，合并所述洗脱液，减压浓缩，得辛可耐因Ib的初级富集物；
3)将步骤2)得到的初级富集物溶于等质量的甲醇，得到初级富集物的甲醇溶液，将所述初级富集物的甲醇溶液与60～100目的硅胶粉混合，减压拌样至干，干法上样，以二氯甲烷-甲醇为洗脱液过硅胶色谱柱梯度洗脱分离，收集并合并富含辛可耐因Ib的洗脱液，减压浓缩至干，得辛可耐因Ib的次级富集物；其中，所述硅胶粉的质量为所述初级富集物质量的1.5～2.5倍；所述硅胶色谱柱中硅胶质量为所述初级富集物质量的10～20倍；
4)将所述次级富集物溶解于2倍质量的水中得到次级富集物的水溶液，将所述次级富集物的水溶液以甲醇水溶液为梯度洗脱液通过大孔聚合物填料色谱柱分离，收集并合并富含辛可耐因Ib的洗脱液，减压浓缩至干，得辛可耐因Ib的三级富集物；所述大孔聚合物填料色谱柱为Toyopearl HW-40柱；
5)将4)得到的三级富集物以50％甲醇水溶液为洗脱液通过C18柱精制，在254nm检测收集辛可耐因Ib的色谱峰，收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥得到辛可耐因Ib；所述C18柱为Cosmosil ODS柱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中将所述粗提物以质量比1：10的比例溶于水中。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔷薇科植物为苹果属植物。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述粗提物为苹果多酚。
5.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中梯度洗脱的顺序为水、体积百分比浓度分别为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中每半个柱床体积作为一个接收体积检测洗脱样品。
7.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述梯度洗脱的二氯甲烷-甲醇体积比梯度依次为95:5、93:7、92:8、91:10。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)中每半个柱床体积作为一个接收体积检测洗脱样品。
9.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述梯度洗脱的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比梯度依次为10％、15％、20％、25％。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤4)中每四分之一个柱床体积作为一个接收体积检测洗脱样品。
11.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)～5)中通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测洗脱样品是否含有辛可耐因Ib。
12.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)～5)中减压浓缩的条件为温度≤60℃，真空度为0.06～0.08Mpa。
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