CN105340876A - 一种cik细胞的冻存方法及cik细胞的冻存介质 - Google Patents
一种cik细胞的冻存方法及cik细胞的冻存介质 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105340876A CN105340876A CN201410436792.7A CN201410436792A CN105340876A CN 105340876 A CN105340876 A CN 105340876A CN 201410436792 A CN201410436792 A CN 201410436792A CN 105340876 A CN105340876 A CN 105340876A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cik
- cell
- freezing media
- cik cell
- freezing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种CIK细胞的冻存方法及CIK细胞的冻存介质。具体地CIK细胞的冻存方法包括步骤，将制备的CIK细胞培养液离心，800-1500rpm，离心3-5min，将上清置于-80℃冻存待用；将离心获得CIK细胞置于冻存介质中，-20℃冷冻2-4h，然后-80℃冷冻6-10h后存放于液氮中；其中，冻存介质包括：人血白蛋白30～100μg/ml、维生素E？1～5μg/ml、谷胱甘肽20～50μg/ml、甘氨酸10～20μg/ml。利用该冻存介质冻存的细胞具有较高的复苏率，复苏后细胞保持CIK细胞的细胞毒活性等特点。冻存介质中的各组分不影响后续临床细胞治疗的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种CIK细胞的冻存方法及CIK细胞的冻存介质。
背景技术
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkillercells，CIK细胞)，是将人外周血、脐血或骨髓的单个核细胞在体外用细胞因子培养一段时间后获得的一群异质细胞。国内外多年的临床研究表明，CIK细胞治疗可以提高患者无病生存期和总生存期，提高机体抗肿瘤免疫功能，改善患者生活质量。由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性杀瘤优点。
CIK细胞中CD3+CD56+双阳性细胞为其主要效应细胞，具有增殖速℃快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、非主要组织相容性复合体(MHC)限制性、对正常骨髓造血影响轻微等优点。特别是对于术后清除微小转移灶、防止癌的扩散和复发、提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可起到改善生活质量、延长生命的积极作用。但是现有技术中的CIK细胞的制备技术中，存在CIK细胞增殖力差、细胞毒活性低的缺点。而且诱导CIK细胞需要花费的周期很长，在临床上需要多次采血诱导，给患者造成了极大的痛苦，浪费大量的医疗成本。因此，本领域的技术人员致力于开发一种CIK细胞的保存方法，方便CIK疗法的临床应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种CIK细胞的冻存方法。
本发明的另一目的是提供一种CIK细胞的冻存介质。
本发明的第一方面，提供了一种CIK细胞的冻存方法，包括步骤：
1)分离CIK细胞
将制备的CIK细胞培养液离心，800-1500rpm，离心3-5min，将上清置于-80℃冻存待用；
2)冻存CIK细胞
将步骤1)离心获得CIK细胞置于冻存介质中，-20℃冷冻2-4h，然后-80℃冷冻6-10h后存放于液氮中；
其中，所述冻存介质包括：人血白蛋白30～100μg/ml、维生素E1～5μg/ml、谷胱甘肽20～50μg/ml、甘氨酸10～20μg/ml。
优选地，所述步骤2)中的冻存介质包括：人血白蛋白50～80μg/ml、维生素E2～4μg/ml、谷胱甘肽30～40μg/ml、甘氨酸15～20μg/ml。
更优选地，所述步骤2)中的冻存介质包括：人血白蛋白60μg/ml、维生素E3μg/ml、谷胱甘肽40μg/ml、甘氨酸15μg/ml。
在另一优选例中，所述冻存介质中还包括IL-630～50ng/ml和/或IL-220～40ng/ml。
优选地，所述冻存介质中还包括IL-640ng/ml和/或IL-230ng/ml。IL-6和/或IL-2的添加能够显著增强复苏细胞的细胞毒活性。
在另一优选例中，使用生理盐水配制所述冻存介质。
在另一优选例中，所述冻存介质的pH为6.0-7.5，优选地，pH为6.2-7.0，更优选地pH为6.2-6.4。
在另一优选例中，所述方法包括CIK细胞复苏的步骤：
3)将步骤1)中冻存的上清液解冻后离心，得到经过离心处理的上清液；
4)将冻存的CIK细胞放入35～40℃的温水中速融，然后用生理盐水洗涤一次，加入步骤3)中经离心处理过的上清液，置于培养箱中培养。
本发明的另一方面，提供了一种CIK细胞的冻存介质，所述冻存介质包括：人血白蛋白30～100μg/ml、维生素E1～5μg/ml、谷胱甘肽20～50μg/ml、甘氨酸10～20μg/ml。
优选地，所述冻存介质中还包括IL-630～50ng/ml和/或IL-220～40ng/ml。
在另一优选例中，使用生理盐水配制所述冻存介质。
在另一优选例中，所述冻存介质的pH为6.0-7.5，优选地，pH为6.2-7.0，更优选地pH为6.2-6.4。
本发明中的冻存介质，能提高细胞膜对水的通透性，另外采用快速冻存的方法，能保证细胞外结晶在很短的时间内即冻住，避免由于缓慢冻存使水分渗入细胞内形成胞内冰晶对细胞造成伤害，造成细胞死亡。本发明的方法适用于对CIK细胞的长期保存，与现有技术相比，不但省略了步骤，简化了工艺，实验结果表明复苏后的活细胞数能达到95％以上。
利用该冻存介质冻存的细胞具有高复苏率，不影响细胞生长特性，复苏后细胞保持CIK细胞的细胞毒活性等特点。冻存介质中的各组分不影响后续临床细胞治疗的应用。
附图说明
图1显示了本发明复苏的CIK细胞的活细胞率。
图2显示了本发明复苏的CIK细胞的细胞毒活性。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。但本发明并不受实施例的限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
实施例1CIK细胞的冻存
CIK细胞的冻存及复苏包括以下步骤：
一、CIK细胞的冻存
a.取CIK细胞(CIK细胞可以以本领域常规的方法进行制备，如可以参考中国专利CN201210324368.4中的方法)，1000rpm离心5min，取出上清液于-80℃冷冻备用。
b.使用生理盐水按照下表配制冻存介质
c.离心获得CIK细胞分别置于冻存介质中，还原至原CIK培养液体积的30～60％，-20℃冷冻3小时，然后放入-80℃冰箱冷冻8h后放于液氮中冻存。
二、CIK细胞的复苏
d.取出步骤a中冻存的上清液于4℃冰箱中解冻，然后将上清液2000rpm离心5min，取上清液备用，得到经过离心处理的上清液。
e、将冻存的CIK细胞放入37℃的温水中速融后加入装有生理盐水的离心管中1000rpm离心5min，弃上清液。
f、将CIK细胞放入到步骤d中经过离心处理的上清液中，然后将细胞浓度稀释到1.0×106/ml后均分于六孔板中培养。
实施例2：CIK细胞的检测
1、CIK细胞活细胞检测
取复苏的CIK细胞100ul，加入100ul0.4％胎盘蓝染色液，活细胞不被染色，死细胞都被染成蓝色。实验结果如图1所示，从图中可以看出，本发明的冻存介质能够使复苏细胞的活细胞率达到99％，但是冻存介质的pH对细胞复苏影响很大，当pH低至6时或者当pH高至6.5以上时，活细胞率显著降低。
2、CIK细胞毒活性检测
将实施例1中复苏的各组CIK细胞按效靶比例10∶1加入K562肿瘤细胞株(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)细胞接种24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入新鲜配制的5mg/ml的MTT10μ1，共同培养4小时，离心吸弃上清液，每孔加DMSO100μl振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算效应细胞的细胞毒活性，杀伤率(％)＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。以未经冻存的CIK细胞为对照，设置其杀伤率为100％。
结果显示本发明的方法复苏的CIK细胞能够达到对照组活性的95％以上。另外，冻存介质中添加IL-6和IL-2，能够显著提高复苏的CIK细胞的细胞毒活性而且同时添加IL-6和IL-2的效果要显著优于单独添加IL-6或IL-2。
本实施方式中利用冻存技术保存CIK细胞并保持了它的杀伤活性。CIK细胞冻存后可以根据需要随时复苏，复苏时间仅需要1～2天，避免了临床使用CIK细胞需要多次诱导的麻烦和多次采血给患者造成的痛苦，极大的方便了临床使用，降低了医疗成本。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种CIK细胞的冻存方法，其特征在于，包括步骤：
1)分离CIK细胞
将制备的CIK细胞培养液离心，800-1500rpm，离心3-5min，将上清置于-80℃冻存待用；
2)冻存CIK细胞
将步骤1)离心获得CIK细胞置于冻存介质中，-20℃冷冻2-4h，然后-80℃冷冻6-10h后存放于液氮中；
其中，所述冻存介质包括：人血白蛋白30～100μg/ml、维生素E1～5μg/ml、谷胱甘肽20～50μg/ml、甘氨酸10～20μg/ml。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤2)中的冻存介质包括：人血白蛋白50～80μg/ml、维生素E2～4μg/ml、谷胱甘肽30～40μg/ml、甘氨酸15～20μg/ml。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述冻存介质中还包括IL-630～50ng/ml和/或IL-220～40ng/ml。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述冻存介质的pH为6.0-7.5，优选地，pH为6.2-7.0，更优选地pH为6.2-6.4。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括CIK细胞复苏的步骤：
3)将步骤1)中冻存的上清液解冻后离心，得到经过离心处理的上清液；
4)将冻存的CIK细胞放入35～40℃的温水中速融，然后用生理盐水洗涤一次，加入步骤3)中经离心处理过的上清液，置于培养箱中培养。
6.一种CIK细胞的冻存介质，其特征在于，所述冻存介质包括：人血白蛋白30～100μg/ml、维生素E1～5μg/ml、谷胱甘肽20～50μg/ml、甘氨酸10～20μg/ml。
7.如权利要求6所述的CIK细胞的冻存介质，其中，所述冻存介质中还包括IL-630～50ng/ml和/或IL-220～40ng/ml。
8.如权利要求6所述的CIK细胞的冻存介质，其中，使用生理盐水配制所述冻存介质。
9.如权利要求6所述的CIK细胞的冻存介质，其中，所述冻存介质的pH为6.0-7.5。
10.如权利要求9所述的CIK细胞的冻存介质，其中，所述pH为6.2-6.4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410436792.7A CN105340876A (zh) | 2014-08-23 | 2014-08-23 | 一种cik细胞的冻存方法及cik细胞的冻存介质 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410436792.7A CN105340876A (zh) | 2014-08-23 | 2014-08-23 | 一种cik细胞的冻存方法及cik细胞的冻存介质 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105340876A true CN105340876A (zh) | 2016-02-24 |
Family
ID=55317164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410436792.7A Pending CN105340876A (zh) | 2014-08-23 | 2014-08-23 | 一种cik细胞的冻存方法及cik细胞的冻存介质 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105340876A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106212443A (zh) * | 2016-08-12 | 2016-12-14 | 四川驰鼎盛通生物科技有限公司 | 临床级细胞保护液及其制备方法和应用 |
| CN106577635A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-04-26 | 南京佰泰克生物技术有限公司 | 一种维持cik细胞高杀伤力的冻存保护剂 |
| JP2020502284A (ja) * | 2016-12-23 | 2020-01-23 | セルラー バイオメディスン グループ （シャンハイ） エルティーディー． | 臨床使用可能な細胞凍結保存液 |
| CN113994951A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-02-01 | 晋文娟 | 一种cik细胞冻存液及冻存方法 |
| CN114600868A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-06-10 | 张帅军 | 一种细胞保存液及其在保存cik细胞中的应用 |
-
2014
- 2014-08-23 CN CN201410436792.7A patent/CN105340876A/zh active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106212443A (zh) * | 2016-08-12 | 2016-12-14 | 四川驰鼎盛通生物科技有限公司 | 临床级细胞保护液及其制备方法和应用 |
| CN106212443B (zh) * | 2016-08-12 | 2019-08-06 | 四川驰鼎盛通生物科技有限公司 | 临床级细胞保护液及其制备方法和应用 |
| JP2020502284A (ja) * | 2016-12-23 | 2020-01-23 | セルラー バイオメディスン グループ （シャンハイ） エルティーディー． | 臨床使用可能な細胞凍結保存液 |
| CN106577635A (zh) * | 2016-12-26 | 2017-04-26 | 南京佰泰克生物技术有限公司 | 一种维持cik细胞高杀伤力的冻存保护剂 |
| CN106577635B (zh) * | 2016-12-26 | 2020-07-14 | 苏桥生物(苏州)有限公司 | 一种维持cik细胞高杀伤力的冻存保护剂 |
| CN113994951A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-02-01 | 晋文娟 | 一种cik细胞冻存液及冻存方法 |
| CN114600868A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-06-10 | 张帅军 | 一种细胞保存液及其在保存cik细胞中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105340876A (zh) | 一种cik细胞的冻存方法及cik细胞的冻存介质 | |
| CN106665560B (zh) | 一种直接静脉回输的免疫细胞冻存液及其应用 | |
| CN107027743B (zh) | 细胞冻存液及细胞冻存方法 | |
| CN103404509B (zh) | 一种细胞保存液、其制备方法和应用 | |
| CN102487939B (zh) | 一种间充质干细胞储存液 | |
| CN108633877A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞外泌体冻干粉及其制备的方法 | |
| CN103548814B (zh) | 造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂 | |
| CN104488850A (zh) | 一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法 | |
| CN105211051B (zh) | 一种培养后的nk细胞的冻存液及其制备方法 | |
| CN107148967A (zh) | 一种抗原特异性t淋巴细胞冻存液及其制备方法和应用 | |
| WO2007133665A3 (en) | Methods for collecting and using placenta cord blood stem cells | |
| CN104430303B (zh) | 人外周血干细胞冻存液的配制及使用方法 | |
| Lauterboeck et al. | Active control of the nucleation temperature enhances freezing survival of multipotent mesenchymal stromal cells | |
| CN101063107B (zh) | Cik细胞的冻存及复苏 | |
| CN112167240A (zh) | 临床级细胞冷藏保存液及其制备方法和应用 | |
| CN106967675A (zh) | 一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法 | |
| CN105211052B (zh) | 一种培养后的nkt细胞的冻存液及其制备方法 | |
| CN105532650A (zh) | 一种细胞冻存液 | |
| CN106798724A (zh) | 一种骨髓间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 | |
| CN104222069A (zh) | 红系祖细胞冻存液及其应用 | |
| Clarke et al. | Improved post-thaw recovery of peripheral blood stem/progenitor cells using a novel intracellular-like cryopreservation solution | |
| CN101199273B (zh) | 一种新型多器官储存保护液 | |
| CN113925049B (zh) | 一种保持细胞活性的细胞保存液及其制备方法和应用 | |
| CN102197802B (zh) | 一种胰岛冻存保护剂及其使用方法 | |
| US20180271087A1 (en) | Device for vascularized composite allotransplant preservation and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160224 |