JP2020502284A - 臨床使用可能な細胞凍結保存液 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)ヒトアルブミン、
(2)ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコールの1種または複数種の組み合わせを含む凍結保護剤、
(3)Na+、K+、Mg+、Cl−およびCH3COO−イオンを含む塩緩衝液、
(4)ビタミン、ならびに
(5)アミノ酸を含み、
ここで、前記ヒトアルブミンの濃度は1%〜20%(w/v)である、
細胞凍結保存液を提供する。
Na+イオンの濃度は0.1〜0.2mol/Lであること、
K+イオンの濃度は5〜10mmol/Lであること、
Mg2+イオンの濃度は1.5〜5mmol/Lであること、
Cl−イオンの濃度は0.1〜0.3mol/Lであること、
CH3COO−イオンの濃度は40〜60mmol/Lであること、
からなる群から選ばれる1つまたは複数の特徴を有する。
細胞、および
本発明の第一の側面に記載の細胞凍結保存液を含み、
好ましくは、前記の細胞はCar−T細胞、間葉幹細胞、またはそれらの組み合わせである、
細胞混合物を提供する。
(i)凍結保存される細胞を本発明の第一の側面に記載の細胞凍結保存液と混合し、細胞混合物を得る工程と、
(ii)工程(i)で得られた細胞混合物を降温させた後、液体窒素で保存する工程と、
を含む細胞の凍結保存方法を提供する。
(i−1)生細胞を提供し、そして生存率および細胞密度を計算する工程と、
(i−2)工程(i−1)の細胞を遠心した後、上清液を除去し、細胞の沈殿を分散させる工程と、
で製造されたものである。
ヒトアルブミン
本明細書で用いられるように、用語「ヒトアルブミン」は血漿由来ヒトアルブミンおよび遺伝子組換えヒトアルブミンを含むが、本発明の具体的な実施例および比較例で使用された「ヒトアルブミン」とは血漿由来ヒトアルブミンで、「組換えヒトアルブミン」とは遺伝子組換えヒトアルブミンである。
本明細書で用いられるように、用語「間葉幹細胞」とは発育早期の内胚葉由来の高度の自己更新能および多分化能を有する多能性幹細胞で、全身の多くの組織に幅広く存在し、体外で培養して増幅することが可能で、かつ特定の条件の制御で神経細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などに分化することができる。
本明細書で用いられるように、「CAR−T細胞」は、キメラ抗原受容体T細胞で、ある腫瘍抗原を認識する抗体の抗原結合部とCD3−ζ鎖またはFcεRIγの細胞内部分が体外でカップリングしてなるキメラタンパク質で、遺伝子形質導入の方法によって患者のT細胞に形質移入し、キメラ抗原受容体(CAR)を発現させる。
細胞凍結保存技術は生物学において生物種を保存する重要な手段である。何らかの条件も加えずにそのまま細胞を凍結保存すると、細胞内と外部環境における水はいずれも氷結晶になり、細胞内の機械的損傷、電解質の上昇、浸透圧の変化、脱水、pHの変化、タンパク質の変性などが生じ、深刻な場合、細胞の死亡につながる。培養液に保護剤を入れると、凍結点が低下する。緩和な凍結条件において、細胞内における水分は凍結前に細胞から浸出し、低温で保存すると、氷結晶の形成が減少する。
本明細書で用いられるように、「細胞蘇生」とう言葉とは休眠の細胞を再び活性化させる過程である。通常、当業者に熟知のプロトコール、すなわち、快速蘇生法を使用し、凍結管を迅速に液体窒素から温水浴に移し、好ましくは37℃〜40℃にし、適当に撹拌して解凍を加速させ、細胞が完全に解凍した後、凍結管を消毒し、解凍後、細胞を洗浄して再懸濁させ、細胞培養瓶に移し、CO2インキュベーターで培養し、細胞の生存率および活力を検出する。
本発明の具体的な実施形態において、Car−T細胞の凍結保存と蘇生の工程は以下の通りである。
1.14日まで懸濁培養されたCar−T細胞を1袋取り、生存率および細胞密度を計算し、生細胞量4×108で遠心・収集する。
2.遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり20mLの凍結保存液を入れる。
3.均一に混合し、2つの20mL凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−80度に降温させる。
4.液体窒素で保存し、そして1週、6週でそれぞれサンプリングして細胞の活力および機能発現能の検出・分析を行う。
1.付着培養された間葉幹細胞を数皿取り、見かけの融合程度が80%〜90%で、トリプシンで消化して細胞を収集し、そして生存率および細胞密度を計算し、生細胞量4×107で遠心・収集する。
2.遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり3mLの凍結保存液を入れる。
3.均一に混合し、2つの2mL凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−80度に降温させる。
4.液体窒素で保存し、そして1か月、3か月でそれぞれサンプリングして細胞の生存率および分化能の検出・分析を行う。
細胞の維持環境は等張溶液が必要である。塩緩衝液、たとえば生理食塩水、多電解質注射液などは細胞の浸透圧を維持することができる。細胞は、凍結保存時、凍結保護剤で細胞内における水を置換し、凍結保存の過程で水が氷結晶になって細胞内小器官を損傷することを防止し、細胞の凍結保存・蘇生後の代謝はビタミンおよびアミノ酸を消耗する必要がある。
(1)塩緩衝液、
(2)ヒトアルブミン、
(3)ビタミン、
(4)アミノ酸、
(5)凍結保護剤。
(a)細胞の保存、
(b)細胞ライブラリーの構築、または
(c)細胞の活力の維持。
本発明の細胞混合物は、以下の成分を含む:
(a)細胞、および
(b)以下の成分を含む細胞凍結保存液:
(1)塩緩衝液、
(2)ヒトアルブミン、
(3)ビタミン、
(4)アミノ酸、
(5)凍結保護剤。
(1)長期間で細胞を凍結保存することができ、蘇生後の細胞も高い生存率を有する。
(2)凍結保存後蘇生した細胞も良い機能発現能および分化能を有する。
本実施例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。
1.14日まで懸濁培養されたCar−T細胞を1袋取り、生存率および細胞密度を計算し、生細胞量4×108で遠心・収集した。
2.遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり20mLの凍結保存液を入れた。
3.均一に混合し、2つの20mL凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−80度に降温させた。
4.液体窒素で保存し、そして1週、6週でそれぞれサンプリングして検出した。
O:Car−T細胞のみ
N:Car−T細胞+CD19陰性腫瘍細胞
P:Car−T細胞+CD19陽性腫瘍細胞
本実施例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。
1.付着培養された間葉幹細胞を数皿取り、見かけの融合程度が80%〜90%で、トリプシンで消化して細胞を収集し、そして生存率および細胞密度を計算し、生細胞量4×107で遠心・収集する。
2.遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり3mLの凍結保存液を入れた。
3.均一に混合し、2つの2mL凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−80度に降温させた。
4.液体窒素で保存し、そして1か月、3か月でそれぞれサンプリングして検出した。
本実施例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。
1.付着培養された間葉幹細胞を数皿取り、見かけの融合程度が80%〜90%で、トリプシンで消化して細胞を収集し、そして生存率および細胞密度を計算し、生細胞量4×107で遠心・収集する。
2.遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり3mLの凍結保存液を入れた。
3.均一に混合し、2つの2mL凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−80度に降温させた。
4.液体窒素で保存し、そして1か月、3か月でそれぞれサンプリングして検出した。
本実施例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。
1.付着培養された間葉幹細胞を数皿取り、見かけの融合程度が80%〜90%で、トリプシンで消化して細胞を収集し、そして生存率および細胞密度を計算し、生細胞量4×107で遠心・収集する。
2.遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり3mLの凍結保存液を入れた。
3.均一に混合し、2つの2mL凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−80度に降温させた。
4.液体窒素で保存し、そして1か月、3か月でそれぞれサンプリングして検出した。
本比較例で使用された凍結保存液の配合は以下の通りである。
1.付着培養された間葉幹細胞を数皿取り、見かけの融合程度が80%〜90%で、トリプシンで消化して細胞を収集し、そして生存率および細胞密度を計算し、生細胞量4×107で遠心・収集した。
2.遠心後、上清を捨て、細胞の沈殿を分散させ、ゆっくり3mLの凍結保存液を入れた。
3.均一に混合し、2つの2mL凍結保存袋に分け、プログラム降温装置に入れて−80度に降温させた。
4.液体窒素で保存し、そして1か月、3か月でそれぞれサンプリングして検出した。
Claims (10)
- 臨床使用可能な細胞凍結保存液であって、
(1)ヒトアルブミン、
(2)ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコールのうちの1種または複数種の組み合わせを含む凍結保護剤、
(3)Na+、K+、Mg+、Cl−およびCH3COO−イオンを含む塩緩衝液、
(4)ビタミン、ならびに
(5)アミノ酸
を含み、
ここで、前記ヒトアルブミンの濃度は1%〜20%(w/v)である
ことを特徴とする細胞凍結保存液。 - 前記の凍結保護剤の濃度は0.4mol/L〜2.2mol/Lであることを特徴とする請求項1に記載の細胞凍結保存液。
- Na+イオンの濃度は0.1〜0.2mol/Lであること、
K+イオンの濃度は5〜10mmol/Lであること、
Mg2+イオンの濃度は1.5〜5mmol/Lであること、
Cl−イオンの濃度は0.1〜0.3mol/Lであること、
CH3COO−イオンの濃度は40〜60mmol/Lであること、
からなる群から選ばれる1つまたは複数の特徴を有することを特徴とする請求項1に記載の細胞凍結保存液。 - 前記のビタミンの濃度は50mmol/L〜150mmol/Lであり、および/または前記のアミノ酸の濃度は0.1mol/L〜0.5mol/Lであることを特徴とする請求項1に記載の細胞凍結保存液。
- 前記のヒトアルブミンは、血漿由来ヒトアルブミン、遺伝子組換えヒトアルブミン、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の細胞凍結保存液。
- 前記のビタミンは、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の細胞凍結保存液。
- 前記のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれ、好ましくはリジン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、またはそれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の細胞凍結保存液。
- 細胞、および
請求項1〜7のいずれかに記載の細胞凍結保存液
を含み、
好ましくは、前記の細胞はCar−T細胞、間葉幹細胞、またはそれらの組み合わせである
ことを特徴とする細胞混合物。 - 細胞の凍結保存方法であって、
(i)凍結保存される細胞を請求項1〜7のいずれかに記載の細胞凍結保存液と混合し、細胞混合物を得る工程と、
(ii)工程(i)で得られた細胞混合物を降温させた後、液体窒素で保存する工程と、
を含むことを特徴とする方法。 - 細胞の凍結保存のためのキットであって、請求項1〜7のいずれかに記載の細胞凍結保存液を含むことを特徴とするキット。
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