TW202139836A - 冷凍保存細胞之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明尤其提供一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：二甲亞碸(DMSO)、雙醣、人類血清，及IL-7及/或IL-15。本發明尤其亦提供一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：介於約1 w/v%至10 w/v%之間的二甲亞碸(DMSO)、介於約0.25 w/v%至5 w/v%之間的雙醣，及介於約10 w/v%至90 w/v%之間的人類血清。本發明尤其亦提供一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：介於約1 w/v%至10 w/v%之間的二甲亞碸(DMSO)、介於約0.25 w/v%至5 w/v%之間的雙醣，及介於約0.5 w/v%至30 w/v%之間的人類血清白蛋白。

Description

冷凍保存細胞之組合物及方法
細胞之冷凍長期以來用於在已自供體生物體移除或分離細胞後保存活細胞。然而，活細胞之冷凍保存及恢復仍頗具挑戰。此係至少因為使經受冷凍及解凍條件之細胞曝露於嚴苛條件，此進一步導致一般較低之存活率。
冷凍對大多數活細胞具有破壞性。一般而言，當細胞外介質冷凍時，細胞嘗試跨膜維持滲透平衡，導致細胞內失水，此進一步增加細胞內溶質濃度，直至發生細胞內冷凍。據信細胞內冷凍及溶液效應均為細胞損傷之原因。此等細胞損傷包括(例如)由細胞之滲透性脫水引起之細胞質膜之損傷。
發明人已意外發現容許冷凍並後續解凍活細胞之冷凍保存介質。使用本文描述之介質及方法冷凍並解凍細胞保持高存活率，容許該等細胞用於各種應用，包括(例如)過繼細胞輸入方法。
在一些態樣中，提供一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：二甲亞碸(DMSO)、雙醣、人類血清，及IL-7或IL-15。
在一些態樣中，提供一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：二甲亞碸(DMSO)、雙醣、人類血清白蛋白，及IL-7或IL-15。
在一些實施例中，該冷凍保存介質包括IL-7及IL-15。
在一些態樣中，提供一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：介於約1 w/v%至10 w/v%之間的二甲亞碸(DMSO)、介於約0.25 w/v%至5 w/v%之間的雙醣，及介於約10 w/v%至90 w/v%之間的人類血清。
在一些態樣中，提供一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：介於約1 w/v%至10 w/v%之間的二甲亞碸(DMSO)、介於約0.25 w/v%至5 w/v%之間的雙醣，及介於約0.5 w/v%至30 w/v%之間的人類血清白蛋白。
在一些實施例中，該雙醣係蔗糖。
在一些實施例中，該介質進一步包含D-葡萄糖。
在一些實施例中，該冷凍保存介質包括一或多種細胞介素。在一些實施例中，該等細胞介素係選自IL-7及IL-15。
在一些實施例中，該冷凍保存介質包括IL-7及IL-15兩者。
在一些實施例中，IL-7係以介於約1 ng/mL至50 ng/mL之間的最終濃度存在。
在一些實施例中，IL-7係以約5 ng/mL之最終濃度存在。
在一些實施例中，IL-15係以介於約1 ng/mL至50 ng/mL之間的最終濃度存在。
在一些實施例中，該IL-15係以約5 ng/mL之最終濃度存在。
在一些實施例中，該冷凍保存介質進一步包括哺乳動物細胞培養基。在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基係以約介於10 w/v%至90 w/v%之間存在。在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基不包含非人類動物組分。
在一些實施例中，該冷凍保存介質進一步包括一或多種胺基酸。
在一些實施例中，該冷凍保存介質進一步包括一或多種無機鹽。
在一些實施例中，該pH介於約7至8之間。例如，該pH係約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7及7.8。在一些實施例中，該pH係約7.4。
在一些實施例中，提供一種套組，其包括本文描述之冷凍保存介質。
在一些態樣中，提供一種冷凍保存哺乳動物細胞之方法，該方法包括：(a)使該等細胞與本文描述之冷凍保存介質接觸；及(b)以約1℃/分鐘冷卻該等細胞至-80℃或以下之溫度。
在一些態樣中，提供一種冷凍保存並恢復活細胞之方法，該方法包括：(a)使該等細胞與本文描述之冷凍保存介質接觸；(b)以約1℃/分鐘冷卻該等細胞至-80℃或以下之溫度，藉此冷凍保存該等細胞；及(c)解凍該等冷凍保存之細胞。
在一些實施例中，該等經解凍之冷凍保存之細胞在後續培養或植入個體內前未清洗。
在一些實施例中，相較於用非本文揭示之冷凍保存介質冷凍並解凍之細胞，該等經解凍之冷凍保存之細胞具有增強之細胞存活。例如，相較於用一般購買獲得之冷凍保存介質冷凍並解凍之細胞，該等經解凍之冷凍保存之細胞具有增強之細胞存活。
在一些實施例中，該等經解凍之冷凍保存之細胞具有活體外增強之細胞存活。
在一些實施例中，該等經解凍之冷凍保存之細胞在植入個體內後具有增強之細胞存活。
在一些實施例中，該等哺乳動物細胞係淋巴球或前驅細胞。
在一些實施例中，該等哺乳動物細胞係基改淋巴球或前驅細胞。
在一些實施例中，該等哺乳動物細胞係誘導性多能細胞(iPSC)衍生之淋巴球或前驅細胞。
在一些實施例中，該等淋巴球係T細胞或自然殺手(NK)細胞。
在一些實施例中，該等前驅細胞係iPSC、造血前驅細胞(HPC)或胚胎幹細胞(ESC)。
在一些實施例中，該等哺乳動物細胞係適用於過繼細胞療法。
下列章節中詳細描述本發明之各種態樣。使用章節無意限制本發明。各章節可適用於本發明之任何態樣。在本申請案中，除非另有說明，否則使用「或」意謂「及/或」。如本文使用，除非內文另有明確規定，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括單數及複數個參考物。
定義
投與：如本文使用，術語「投與」或「引入」在將受關注之一次冷凍細胞遞送至有需要病患之內文中可互換使用。此項技術中已知各種方法用於向病患載體投與細胞，包括(例如)藉由靜脈內或手術方法向有需要病患投與細胞。
過繼細胞療法：如本文使用，術語「過繼細胞輸入」或「ACT」係指將細胞輸入有需要病患內。該等細胞可自有需要病患獲得並繁殖或可已自非病患供體獲得。在一些實施例中，該細胞係免疫細胞，諸如淋巴球。各種細胞類型可用於ACT諸如T細胞、CD8+細胞、CD4+細胞、NK細胞、δ-γ T細胞、調節T細胞及外周血單核細胞。此外，已使用本文描述之組合物及/或方法冷凍保存之細胞可進一步基改並針對ACT應用保留高存活率及適合性。例如，在一些實施例中，可基改冷凍細胞以引入嵌合抗原受體(CAR)。或者，在一些實施例中，已預先基改之細胞(例如，CAR-T細胞)可使用本文描述之冷凍保存介質及/或方法冷凍保存並針對ACT應用保留高存活率及適合性。
動物：如本文使用，術語「動物」係指動物界之任何成員。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之人類。在一些實施例中，「動物」係指處於任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，該非人類動物係哺乳動物(例如，嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物及/或豬)。在一些實施例中，動物包括(但不限於)哺乳動物、鳥、爬行動物、兩棲動物、魚、昆蟲及/或蠕蟲。在一些實施例中，動物可為轉基因動物、基因工程化動物及/或純系。
大約或約：如本文使用，術語「大約」或「約」當應用於受關注之一或多個值時，係指與規定參考值相似之值。在某些實施例中，除非另有說明或另外自內文顯而易見(除此數字超過可能值之100%之情況外)，否則術語「大約」或「約」係指以任一方向(大於或小於)落於規定參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內之一定範圍之值。
冷凍保存：如本文使用，術語「冷凍保存」或「冷凍」一般係指冷凍細胞以維持細胞存活率之方法。冷凍保存之細胞在冷凍狀態下維持存活率延長之時間週期，諸如在冷凍保存之狀態下維持存活率1、5、10或更多年。該等冷凍保存之細胞一經解凍即可繁殖用於活體外及活體內應用。
新鮮細胞：如本文使用，術語「新鮮」或「新鮮細胞」係指從未冷凍之哺乳動物細胞。
功能等同物或衍生物：如本文使用，在胺基酸序列之功能衍生物之內文中，術語「功能等同物」或「功能衍生物」表示保留與原始序列之生物活性大體上相似之生物活性(功能或結構)之分子。功能衍生物或等同物可為天然衍生物或合成製備。例示性功能衍生物包括具有一或多種胺基酸之取代、刪除或添加之胺基酸序列，條件為蛋白質之生物活性係保守的。理想地，取代胺基酸具有與經取代之胺基酸之化學物理性質相似之化學物理性質。期望之相似化學物理性質包括電荷、膨鬆度、疏水性、親水性，及類似物之相似性。
活體外：如本文使用，術語「活體外」係指在人造環境中，例如，在試管或反應容器中、在細胞培養物中等，而非於多細胞生物體內，發生之事件。
活體內：如本文使用，術語「活體內」係指於多細胞生物體(諸如人類及非人類動物)內發生之事件。在基於細胞之系統之內文中，該術語可用於係指活細胞(相對於，例如，活體外系統)內發生之事件。
初生細胞：術語「初生細胞」係指直接自個體分離並後續繁殖之細胞。
多肽：如本文使用之術語「多肽」係指經由肽鍵連接在一起之胺基酸之順序鏈。該術語用於係指任何長度之胺基酸鏈，但一般技術者將瞭解該術語不限於長鏈且可係指包含經由肽鍵連接在一起之兩個胺基酸之最小鏈。如熟習此項技術者已知，多肽可經處理及/或修飾。
蛋白質：如本文使用之術語「蛋白質」係指充當離散單元之一或多種多肽。若單個多肽係離散功能單元且無需永久或暫時物理結合其他多肽以形成離散功能單元，則術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用。若該離散功能單元包含超過一個彼此物理結合之多肽，則術語「蛋白質」係指物理偶合並一起充當離散單元之多個多肽。
個體(subject)：如本文使用，術語「個體」係指人類或任何非人類動物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物)。人類包括產前及產後形式。在許多實施例中，個體係人類。個體可為病患，係指向醫療提供者呈遞以診斷或治療疾病之人類。術語「個體」在本文中可與「個體(individual)」或「病患」互換使用。個體可罹患或易患疾病或疾患但可顯示或可不顯示該疾病或疾患之症狀。
大體上：如本文使用，術語「大體上」係指顯示受關注之特性或性質之全部或接近全部之範圍或程度之定性條件。生物領域之一般技術者將瞭解生物及化學現象很少(若有)完成及/或繼續完成或達成或避免絕對結果。因此，本文中使用術語「大體上」以捕獲許多生物及化學現象中固有之完整性之潛在缺乏。
罹患：「罹患」疾病、疾患及/或病症之個體已診斷患有或顯示該疾病、疾患及/或病症之一或多種症狀。
治療有效量：如本文使用，術語治療劑之「治療有效量」意謂當向罹患或易患疾病、疾患及/或病症之個體投與時，足以治療、診斷、預防及/或延遲該疾病、疾患及/或病症之該(等)症狀之發作之量。一般技術者應知曉，治療有效量通常經由包含至少一個單位劑量之給藥方案投與。
治療：如本文使用，術語「治療(treat、treatment或treating)」係指用於部分或完全減輕、改善、緩解、抑制、預防特定疾病、疾患及/或病症之一或多種症狀或特徵、延遲其等發作、降低其等嚴重程度及/或降低其等發病率之任何方法。出於降低發展與疾病相關聯之病理學之風險之目的，可向未顯示疾病之徵象及/或僅顯示該疾病之早期徵象之個體投與治療。
本文中由端點詳述之數值範圍包括歸入該範圍內之所有數字及分數(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.9、4及5)。亦應瞭解，假定所有數字及其分數均由術語「約」修飾。
本發明之各種態樣詳細描述於下列章節中。使用章節無意限制本發明。各章節可適用於本發明之任何態樣。在本申請案中，除非另有說明，否則使用「或」意謂「及/或」。如本文使用，除非內文另有明確規定，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括單數及複數個參考物。 用於冷凍保存細胞之組合物
本文提供適用於冷凍保存並後續解凍活哺乳動物細胞之各種冷凍保存介質。
在一些態樣中，適用於冷凍保存並後續解凍活細胞之冷凍保存介質包含：二甲亞碸(DMSO)、雙醣、細胞介素。合適之冷凍保存介質亦包含人類血清白蛋白或人類血清。
冷凍保存介質中可使用之合適細胞介素包括(例如) IL-7及IL-15。因此，在一些實施例中，該冷凍保存介質包括IL-7。在一些實施例中，該冷凍保存介質包括IL-15。在一些實施例中，該冷凍保存介質包括IL-7及IL-15兩者。在一些實施例中，向該冷凍保存介質添加一或多種另外細胞介素。
冷凍保存介質中可使用各種濃度之細胞介素。例如，在一些實施例中，IL-7係以介於約1 ng/mL至50 ng/mL之間的最終濃度存在於冷凍保存介質中。因此，在一些實施例中，IL-7係以介於約1.0 w/v%、1.5 w/v%、2.0 w/v%、2.5 w/v%、3.0 w/v%、3.5 w/v%、4.0 w/v%、4.5 w/v%、5.0 w/v%、5.5 w/v%、6.0 w/v%、6.5 w/v%、7.0 w/v%、7.5 w/v%、8.0 w/v%、8.5 w/v%、9.0 w/v%、9.5 w/v%、10.0 w/v%、10.5 w/v%、11.0 w/v%、11.5 w/v%、12.0 w/v%、12.5 w/v%、13.0 w/v%、13.5 w/v%、14.0 w/v%、14.5 w/v%、15.0 w/v%、15.5 w/v%、16.0 w/v%、16.5 w/v%、17.0 w/v%、17.5 w/v%、18.0 w/v%、18.5 w/v%、19.0 w/v%、19.5 w/v%、20.0 w/v%、20.5 w/v%、21.0 w/v%、21.5 w/v%、22.0 w/v%、22.5 w/v%、23.0 w/v%、23.5 w/v%、24.0 w/v%、24.5 w/v%、25.0 w/v%、25.5 w/v%、26.0 w/v%、26.5 w/v%、27.0 w/v%、27.5 w/v%、28.0 w/v%、28.5 w/v%、29.0 w/v%、29.5 w/v%、30.0 w/v%、30.5 w/v%、31.0 w/v%、31.5 w/v%、32.0 w/v%、32.5 w/v%、33.0 w/v%、33.5 w/v%、34.0 w/v%、34.5 w/v%、35.0 w/v%、35.5 w/v%、36.0 w/v%、36.5 w/v%、37.0 w/v%、37.5 w/v%、38.0 w/v%、38.5 w/v%、39.0 w/v%、39.5 w/v%、40.0 w/v%、40.5 w/v%、41.0 w/v%、41.5 w/v%、42.0 w/v%、42.5 w/v%、43.0 w/v%、43.5 w/v%、44.0 w/v%、44.5 w/v%、45.0 w/v%、45.5 w/v%、46.0 w/v%、46.5 w/v%、47.0 w/v%、47.5 w/v%、48.0 w/v%、48.5 w/v%、49.0 w/v%、49.5 w/v%、50 w/v%之最終濃度存在於冷凍保存介質中。在一些實施例中，IL-7係以約5.0 w/v%之最終濃度存在於冷凍保存介質中。在一些實施例中，IL-15係以介於約1 ng/mL至50 ng/mL之間的最終濃度存在於冷凍保存介質中。因此，在一些實施例中，IL-15係以介於約1.0 w/v%、1.5 w/v%、2.0 w/v%、2.5 w/v%、3.0 w/v%、3.5 w/v%、4.0 w/v%、4.5 w/v%、5.0 w/v%、5.5 w/v%、6.0 w/v%、6.5 w/v%、7.0 w/v%、7.5 w/v%、8.0 w/v%、8.5 w/v%、9.0 w/v%、9.5 w/v%、10 w/v%、10.0 w/v%、10.5 w/v%、11.0 w/v%、11.5 w/v%、12.0 w/v%、12.5 w/v%、13.0 w/v%、13.5 w/v%、14.0 w/v%、14.5 w/v%、15.0 w/v%、15.5 w/v%、16.0 w/v%、16.5 w/v%、17.0 w/v%、17.5 w/v%、18.0 w/v%、18.5 w/v%、19.0 w/v%、19.5 w/v%、20.0 w/v%、20.5 w/v%、21.0 w/v%、21.5 w/v%、22.0 w/v%、22.5 w/v%、23.0 w/v%、23.5 w/v%、24.0 w/v%、24.5 w/v%、25.0 w/v%、25.5 w/v%、26.0 w/v%、26.5 w/v%、27.0 w/v%、27.5 w/v%、28.0 w/v%、28.5 w/v%、29.0 w/v%、29.5 w/v%、30.0 w/v%、30.5 w/v%、31.0 w/v%、31.5 w/v%、32.0 w/v%、32.5 w/v%、33.0 w/v%、33.5 w/v%、34.0 w/v%、34.5 w/v%、35.0 w/v%、35.5 w/v%、36.0 w/v%、36.5 w/v%、37.0 w/v%、37.5 w/v%、38.0 w/v%、38.5 w/v%、39.0 w/v%、39.5 w/v%、40.0 w/v%、40.5 w/v%、41.0 w/v%、41.5 w/v%、42.0 w/v%、42.5 w/v%、43.0 w/v%、43.5 w/v%、44.0 w/v%、44.5 w/v%、45.0 w/v%、45.5 w/v%、46.0 w/v%、46.5 w/v%、47.0 w/v%、47.5 w/v%、48.0 w/v%、48.5 w/v%、49.0 w/v%、49.5 w/v%、50 w/v%之最終濃度存在於冷凍保存介質中。在一些實施例中，IL-15係以約5.0 w/v%之最終濃度存在於冷凍保存介質中。在一些實施例中，IL-7及IL-15兩者均存在於冷凍保存介質中。在一些實施例中，IL-7及IL-15各以約5.0 w/v%之最終濃度存在於冷凍保存介質中。在一些實施例中，IL-7及IL-15各以約2.25 w/v%之最終濃度存在於冷凍保存介質中。
在一些實施例中，該冷凍保存介質包含人類血清。在一些實施例中，該冷凍保存介質包含人類血清白蛋白。在一些實施例中，該冷凍保存介質包括人類血清及人類血清白蛋白兩者。
冷凍保存介質中可使用各種濃度之人類血清。在一些實施例中，該冷凍保存介質包括介於約10 w/v%至90 w/v%之間的人類血清。因此，在一些實施例中，該冷凍保存介質含有約10 w/v%、15 w/v%、20 w/v%、25 w/v%、30 w/v%、35 w/v%、40 w/v%、45 w/v%、50 w/v%、55 w/v%、60 w/v%、65 w/v%、70 w/v%、75 w/v%、80 w/v%、85 w/v%或90 w/v%人類血清。
冷凍保存介質中可使用各種濃度之人類血清白蛋白。在一些實施例中，該冷凍保存介質包括介於約0.5 w/v%至30 w/v%之間的人類血清白蛋白。因此，在一些實施例中，該冷凍保存介質包括介於約0.5 w/v%、1.0 w/v%、1.5 w/v%、2.0 w/v%、2.5 w/v%、3.0 w/v%、3.5 w/v%、4.0 w/v%、4.5 w/v%、5.0 w/v%、6.0 w/v%、6.5 w/v%、7.0 w/v%、7.5 w/v%、8.0 w/v%、8.5 w/v%、9.0 w/v%、10.0 w/v%、10.5 w/v%、11.0 w/v%、11.5 w/v%、12.0 w/v%、12.5 w/v%、13.0 w/v%、13.5 w/v%、14.0 w/v%、14.5 w/v%、15.0 w/v%、15.5 w/v%、16.0 w/v%、16.5 w/v%、17.0 w/v%、17.5 w/v%、18.0 w/v%、18.5 w/v%、19.0 w/v%、19.5 w/v%、20.0 w/v%、20.5 w/v%、21.0 w/v%、21.5 w/v%、22.0 w/v%、22.5 w/v%、23.0 w/v%、23.5 w/v%、24.0 w/v%、24.5 w/v%、25.0 w/v%、25.5 w/v%、26.0 w/v%、26.5 w/v%、27.0 w/v%、27.5 w/v%、28.0 w/v%、28.5 w/v%、29.0 w/v%、29.5 w/v%或30.0 w/v%人類血清白蛋白。
冷凍保存介質中可使用各種濃度之DMSO。在一些實施例中，該介質包括介於約1至10 w/v%之間的DMSO。因此，在一些實施例中，該介質包括約1.0 w/v%、1.5 w/v%、2.0 w/v%、2.5 w/v%、3.0 w/v%、3.5 w/v%、4.0 w/v%、4.5 w/v%、5.0 w/v%、5.5 w/v%、6.0 w/v%、6.5 w/v%、7.0 w/v%、7.5 w/v%、8.0 w/v%、8.5 w/v%、9.0 w/v%、9.5 w/v%或10 w/v% DMSO。在一些實施例中，該冷凍保存介質包含約5.0 w/v% DMSO。
在一些實施例中，該冷凍保存介質包括至少一種雙醣。例如，在一些實施例中，該冷凍保存介質包括蔗糖、乳糖或麥芽糖中之至少一者。在一些實施例中，該冷凍保存介質包含蔗糖。
冷凍保存介質中可使用各種濃度之雙醣。例如，在一些實施例中，該冷凍保存介質以介於約0.25 w/v%、0.5 w/v%、0.75 w/v%、1.0 w/v%、1.25 w/v%、1.5 w/v%、1.75 w/v%、2.0 w/v%、2.25 w/v%、2.5 w/v%、2.75 w/v%、3.0 w/v%、3.25 w/v%、3.5 w/v%、3.75 w/v%、4.0 w/v%、4.25 w/v%、4.5 w/v%、4.75 w/v%、5.0 w/v%、5.5 w/v%、6.0 w/v%、6.5 w/v%、7.0 w/v%、7.5 w/v%、8.0 w/v%、8.5 w/v%、9.0 w/v%、9.5 w/v%或10 w/v%之間的濃度包括雙醣。
在一些實施例中，該冷凍保存介質包括D-葡萄糖。
在一些實施例中，該冷凍保存介質進一步包含哺乳動物細胞培養基。此項技術中已知各種哺乳動物細胞培養基。一般而言，典型細胞培養基包括各種胺基酸、維生素、葡萄糖、無機鹽及血清作為生長因子、激素及貼附因子(attachment factor)之來源。該細胞培養基亦有助於調節pH及滲透壓。本文描述之冷凍保存介質中可使用任何合適之哺乳動物細胞培養基。已知哺乳動物細胞培養基之實例包括(例如)伊斯科夫改良之杜爾貝科培養基(IMDM)、杜爾貝科改良之伊格爾培養基(DMEM)、最低基本培養基(MEM)、杜爾貝科改良之伊格爾培養基/營養素混合物F-12 (DMEM/F-12)。在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基係IMDM。在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基不包含非人類動物組分。在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基包含下列胺基酸中之一或多者：甘胺酸、L-丙胺酸、L-精胺酸鹽酸鹽、L-天冬醯胺酸(游離鹼)、L-天冬胺酸、L-胱胺酸2HCl、L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-組胺酸鹽酸鹽-H2O、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸鹽酸鹽、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸二鈉鹽、L-纈胺酸。在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基包含下列維生素中之一或多者：生物素、氯化膽鹼、D-泛酸鈣、葉酸、菸鹼醯胺、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12、i-肌醇。在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基包含下列無機鹽中之一或多者：氯化鈣(CaCl2) (無水)、硫酸鎂(MgSO4) (無水)、氯化鉀(KCl)、硝酸鉀(KNO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鈉(NaCl)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4-H2O)、亞硒酸鈉(Na2SeO3-5H20)。在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基包含下列中之一或多者：D-葡萄糖(右旋糖)、HEPES、酚紅、丙酮酸鈉。在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基包含：甘胺酸30.0 mg/L、L-丙胺酸25.0 mg/L、L-精胺酸鹽酸鹽84.0 mg/L、L-天冬醯胺酸(游離鹼) 25.0 mg/L、L-天冬胺酸30.0 mg/L、L-胱胺酸2HCl 91.4 mg/L、L-麩胺酸75.0 mg/L、L-麩醯胺酸584.0 mg/L、L-組胺酸鹽酸鹽-H2O 42.0 mg/L、L-異白胺酸105.0 mg/L、L-白胺酸105.0 mg/L、L-離胺酸鹽酸鹽146.0 mg/L、L-甲硫胺酸30.0 mg/L、L-苯丙胺酸66.0 mg/L、L-脯胺酸40.0 mg/L、L-絲胺酸42.0 mg/L、L-蘇胺酸95.0 mg/L、L-色胺酸16.0 mg/L、L-酪胺酸二鈉鹽104.0 mg/L、L-纈胺酸94.0 mg/L、生物素0.013 mg/L、氯化膽鹼4.0 mg/L、D-泛酸鈣4.0 mg/L、葉酸4.0 mg/L、菸鹼醯胺4.0 mg/L、鹽酸吡哆醛4.0 mg/L、核黃素0.4 mg/L、鹽酸硫胺素4.0 mg/L、維生素B12 0.013 mg/L、i-肌醇7.2 mg/L、氯化鈣(CaCl2) (無水) 165.0 mg/L、硫酸鎂(MgSO4) (無水) 97.67 mg/L、氯化鉀(KCl) 330.0 mg/L、硝酸鉀(KNO3) 0.076 mg/L、碳酸氫鈉(NaHCO3) 3024.0 mg/L、氯化鈉(NaCl) 4505.0 mg/L、磷酸二氫鈉(NaH2PO4-H2O) 125.0 mg/L、亞硒酸鈉(Na2SeO3-5H20) 0.017 mg/L、D-葡萄糖(右旋糖) 4500.0 mg/L、HEPES 5958.0 mg/L、酚紅15.0 mg/L、丙酮酸鈉110.0 mg/L。
冷凍保存介質中可存在各種濃度之哺乳動物細胞培養基且包括(例如)介於約10 w/v%至90 w/v%之間的濃度。因此，在一些實施例中，該哺乳動物細胞培養基係以約10 w/v%、15 w/v%、20 w/v%、25 w/v%、30 w/v%、35 w/v%、40 w/v%、45 w/v%、50 w/v%、55 w/v%、60 w/v%、65 w/v%、70 w/v%、75 w/v%、80 w/v%、8 w/v%5或90 w/v%存在於冷凍保存介質中。
在一些實施例中，該冷凍保存介質具有介於約7.3至7.5之間的pH。因此，在一些實施例中，該冷凍保存介質具有約7.3、7.35、7.4、7.45或7.5之pH。在一些實施例中，該冷凍保存介質具有約7.5之pH。 冷凍保存細胞之方法
可冷凍保存之細胞一般包括任何哺乳動物細胞。在一些實施例中，可冷凍保存之細胞包括幹細胞、其他前驅細胞、紅血球及白血球、精細胞、卵母細胞、卵細胞，及源於組織及器官之細胞材料。合適之細胞之其他實例包括(例如)胰島細胞、軟骨細胞、神經起源之細胞、肝起源之細胞、眼科起源之細胞、骨科起源之細胞、來自結締組織之細胞、生殖起源之細胞及心臟起源之細胞。在一些其他實施例中，細胞包括紅血球、嗜中性球、嗜酸性及嗜鹼性顆粒球、淋巴球及血小板細胞。在一些實施例中，淋巴球包括B-淋巴球、T-淋巴球、非B-淋巴球、非T-淋巴球、誘導性多能細胞衍生之淋巴球及基改淋巴球。該等淋巴球進一步包括T細胞或自然殺手(NK)細胞。該等前驅細胞包括胚胎幹細胞(ESC)、造血前驅細胞(HPC)或誘導性多能細胞(iPSC)。
在一些實施例中，細胞之冷凍保存包括以下步驟：(i)將靶細胞引入稀釋之冷凍保存溶液(冷凍調配物或冷凍保存介質)內，(ii)冷凍或冷凍保存受保護之靶細胞，(iii)將冷凍溶液解凍至周圍條件，及(iv)將解凍之靶細胞引入需此等靶細胞之個體內。
在一些實施例中，在使用前將冷凍保存溶液維持在室溫下並將摻雜之靶細胞維持在室溫下長達三十分鐘，然後開始冷凍而細胞存活率無明顯損失。在一些其他實施例中，將冷凍保存溶液冷卻至約4℃，然後添加靶細胞，以加快冷凍過程，並要求在將該冷凍保存溶液添加至細胞後立即開始冷凍過程，以最小化由溶液之存在誘導之細胞死亡。
在一些實施例中，添加至靶細胞之稀釋之冷凍保存溶液之體積取決於含有靶細胞之溶液與冷凍保存溶液之體積比及靶細胞與冷凍保存溶液之比率。在一些實施例中，含有靶細胞之溶液與冷凍保存溶液之體積比應一般介於約1:1至1:10之間，及靶細胞與冷凍保存溶液之比率介於約l x l05 個細胞/ml至約l x l09 個細胞/ml之間。在一些實施例中，靶細胞與冷凍保存溶液之比率包括介於約1 x l08 個細胞/ml至3 x l08 個細胞/ml之間。大於彼等上文列舉者之比率可導致活細胞之濃度由於不足之冷凍保存溶液而降低，而小於彼等上文列舉者之比率僅可導致低效使用冷凍保存溶液且需將過量冷凍保存溶液引入個體內以引入有效量之靶細胞。靶細胞通常可僅以稀釋形式作為生物流體中之成分保存(例如，自外周血濃縮之幹細胞通常以約l x l06 個細胞/ml至約3 x l08 個細胞/ml之濃度含有幹細胞，及剩餘物包含其他血液組分(諸如血漿及血小板)。此等生物稀釋樣本可一般以約2:1至1:4之體積比(當然取決於許多因素，包括稀釋之冷凍保存溶液之特定調配物、生物稀釋樣本中靶細胞之濃度、靶細胞之類型等)與冷凍保存溶液組合以達成靶細胞與冷凍保存溶液之最佳比率。在一些實施例中，含有最終靶細胞之溶液一般含有約4至12重量%甘油及約2至10重量%白蛋白，及針對某些應用，審慎考慮此一般範圍外之變化。
在一些實施例中，將靶細胞懸浮於冷凍保存溶液中以製備細胞懸浮液，將因此製備之懸浮液分配至冷凍管內，並將所得冷凍管直接放置於-80℃之超低溫冰凍器中以冷凍細胞。在一些其他實施例中，可將該等冷凍管放置於程序化冰凍器中以緩慢冷凍細胞。冷凍細胞之保存可藉由將細胞維持在用於冷凍之溫度(例如，-80℃)下進行。為最佳冷凍，以使細胞存活率一經解凍即達成高於80至90%，吾人可使用緩慢冷凍方法。存在多種形式之電腦化冷凍室，其等可將溫度一次降低一定程度直至溫度達成-80℃；該等冷凍室通常包括電腦化策略，使細胞在冰開始形成之溫度下停留稍微較長之時間以最小化冰晶對細胞之損害。在一些實施例中，緩慢可程序冷凍包括以每分鐘約1℃之速率降低初始溫度直至達成最終溫度。因此，在一些實施例中，緩慢冷凍以每分鐘約0.25℃、0.5℃、0.75℃、1.0℃、1.25℃、1.5℃、1.75℃、2.0℃、2.25℃、2.5℃、2.75℃或3℃之速率發生。在一些實施例中，緩慢冷凍包括：(a)使用固體二氧化碳將細胞自初始溫度冷卻至約-80℃之最終溫度，或(b)使用液氮將細胞自初始溫度冷卻至約-196℃之最終溫度。
在一些實施例中，使用本文描述之介質及/或方法解凍之細胞具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或以上之存活率。
通常，可控緩慢冷卻速率可有效達成最佳細胞存活率。一般據信不同之細胞類型具有不同之最佳冷卻速率(參見，例如Rowe, A. W.及Rinfret, A. P., 1962, Blood 20:636；Ro We, A. W., 1966, Cryo Biology 3(1):12-18；Lewis, J.P.等人，1967, transfusion 7(1):17-32；及Mazur, P., 1970 Science 168:939-949 for effects of cooling velocity on survival of marrow-stem cells and on their transplantation potential)。
在一些實施例中，容納細胞之容器在冷凍溫度下穩定且容許快速熱傳以有效控制冷凍及解凍。密封塑膠小瓶(例如，Nunc及Wheaton cryules)或玻璃安瓿可用於多個小量(1至2 ml)，而100至200 ml之較大體積可冷凍於放置在金屬板之間的聚烯烴袋(諸如彼等自Fenwal購買獲得者)中。
在一些實施例中，然後將冷凍細胞轉移至長期冷凍儲備容器。在一些實施例中，將樣本冷凍儲備於液氮(-196℃)或液氮蒸氣(-105℃)中。高效液氮冷凍器之可用性極大促進此儲備。
當需細胞時，冷凍細胞及組合物經受解凍過程，然後可恢復該等細胞。此外，亦未明確限制用於解凍細胞之方法；例如，該等細胞可藉由將冷凍保存之冷凍管放置於37℃之水浴中解凍。合適之解凍之其他非限制性實例包括：(i)解凍冷凍保存之細胞；(ii)添加第一緩衝溶液；(iii)自冷凍保存介質及第一緩衝溶液分離細胞；及(iv)將該等細胞重懸浮於第二緩衝溶液中。在一些實施例中，在用於活體外或活體內應用前，解凍之細胞未清洗或沖洗冷凍溶液。
在一些實施例中，該第一及/或第二緩衝溶液包含血清或血清替代培養基。在一些實施例中，該血清係人類血清或非人類動物衍生之血清諸如胎牛血清(FBS)。在一些實施例中，該血清替代培養基係GIBCO剔除血清替代培養基及Kubota培養基中之一或多者，視需要用白蛋白補充，該白蛋白進一步視需要為人類血清衍生之白蛋白。在一些實施例中，該血清係以介於約2%至20%之間，視需要介於約10%至20%之間，約10%，或約20%之濃度。應知曉，此「高血清」解凍方法可有利於最小化冰晶形成，其中使用非等滲緩衝液，因為此方法中需高脂質含量。在一些實施例中，該血清係以介於約2%至5%之間的濃度。應知曉，可使用此「低血清」解凍方法，其中使用等滲緩衝液，因為無需高脂質含量。在一些實施例中，該血清替代培養基包含濃度介於約1%至5%之間的白蛋白。
在一些實施例中，該第一及/或第二緩衝溶液包含解凍緩衝液。應知曉，一些可購買獲得之解凍緩衝液包含血清或血清替代物。亦應知曉，一些實施例可包括通過除彼等本文上文規定者外之方式解凍。
應進一步知曉，存在多種方法以自上清液(例如培養基、緩衝溶液及/或冷凍保存溶液)分離細胞。非限制性實例包括離心細胞；通過篩或過濾器過濾細胞；及法壓式過濾。
在一項實施例中，冷凍保存之細胞首先用1x冷介質清洗，接著用冷DPBS清洗一次，及然後將該等細胞重懸浮於冷DPBS中，接著將細胞注射至個體內。低劑量(已清洗)意謂每劑量1.5E7 CAR陽性細胞，及高劑量(已清洗)意謂每劑量4.0E7 CAR陽性細胞。
在一些實施例中，由於冷凍保存溶液之生理相容性，因此可將解凍之靶細胞引入個體內而不分離靶細胞及冷凍保存溶液。因此，在一些實施例中，解凍之細胞在使用前未清洗。將解凍之靶細胞及伴隨之冷凍保存溶液較佳在引入個體內前升溫至體溫(即，約37℃)。在此情況下，細胞之劑量係基於冷凍前細胞計數。
在一些實施例中，解凍之靶細胞在室溫下維持數小時而細胞存活率無明顯損失。在一些實施例中，解凍之溶液用生理鹽水或其他適當之離子溶液緩慢稀釋以便於將溶液之滲透壓自500至2,000 mOsm/kg之所需冷凍保存範圍降低至260至320 mOsm/kg之生理範圍以便於減小由滲透壓突然變化引起之對細胞壁之衝擊。
在一些實施例中，進一步培養解凍之細胞。在一些實施例中，培養涉及將細胞放置於培養器中；移除緩衝溶液；並用針對細胞之生長及/或分化設計之培養基替代緩衝溶液。在一些實施例中，在培養器中將細胞培養介於約6至7小時之間。在一些實施例中，針對細胞之生長及/或分化設計之培養基包含Kubota培養基及/或用於細胞之分化之激素定義之培養基(HDM)。
解凍之細胞之存活率可活體外及活體內評定。在一些實施例中，活體外細胞存活率測試包括台盼藍(Trypan Blue)排除分析。在一些實施例中，可使用其他分析方法以通過使用RT-qPCR及類似物評定已用不同冷凍保存溶液冷凍之解凍細胞之細胞存活率(例如，基因表現)。一般技術者可選擇任何分析方法以評定解凍之細胞之存活率，該存活率可適用於評定原本新鮮細胞之細胞存活率。
活體內細胞存活率一般可藉由評估活體內投與細胞之功能特性評定。在一些實施例中，活體內細胞存活率可藉由評估已引入有需要個體內之細胞之細胞數量評定。此項技術中已知用於追蹤細胞並測定投與細胞之存活率之各種方法。 套組
本發明提供本文描述之組合物中之任一者於套組中，視需要包括使用該等組合物(例如，用於保存淋巴球或前驅細胞及/或其他細胞)之說明書。即，該套組可包括在本文描述之任何方法中使用組合物之說明書。如本文使用，「套組」通常定義包括本發明之組分中之一或多者，及/或與本發明相關聯之(例如，如先前描述之)其他組分之包裝、總成或容器(諸如隔熱容器)。在一些實施例中，該套組之組分中之各者係呈液體形式(例如，呈溶液形式)，或呈固體形式(例如，乾燥粉末、冷凍物等)提供。
在一些實施例中，該套組包括一或多種組分，該等組分可於相同容器內或於兩個或更多個容器內，及/或以其任何組合。該容器可含有液體，且非限制性實例包括瓶子、小瓶、廣口瓶、管、燒瓶、燒杯，或類似物。在一些實施例中，該容器係防溢的(當關閉時，無論容器處於任何方向，液體均無法離開該容器)。
在一些實施例中，套組包含分開包裝或包裝在一起之冷凍保存介質之組分。在一些實施例中，該套組係在室溫下(約25℃)運輸，冷凍(例如，在約4℃下)，及/或該等組分中之任何一者或多者係經冷凍(例如，介於-20℃至-80℃之間，在約-150℃下等)或在液氮(約-196℃)中運輸。在一些情況下，該等組分中之一或多者係經冷凍及/或在乾冰(約-80℃)上運輸。
關於冷凍保存溶液，若存在多於一種組分(例如，如上文描述)，則在一些實施例中，將該等組分一起冷凍在一種共同液體中(例如，於一個共同容器內)，或冷凍成兩種或更多種不同液體(例如，於不同容器內)。
在一些實施例中，該等組分中之一些係可加工的(例如，加工成活性形式)，例如，藉由添加可與或可不與套組一起提供之合適之溶劑或其他物質。例如，可加熱該組分或可向該組分添加液體(例如，若該組分係經冷凍、凍乾、以濃縮形式運輸等)。
在一些情況下，該套組將包括冷凍容器，其係適用於在冷凍溫度下容納材料(例如，液氮)之容器。一般技術者應知曉，合適之冷凍容器，例如，杜瓦(Dewar)燒瓶(例如，由不銹鋼及/或鋁等製成)、氣態運輸罐、不銹鋼容器、保麗龍(Styrofoam)容器，或類似物。通常，冷凍溫度包括低於約-150℃、低於約-170℃，或低於約-190℃之溫度。例如，液氮具有約-196℃之沸點。
在一些實施例中，該套組含有用於容納細胞之容器。例如，該容器可經構築使得其可抵擋冷凍溫度而不破裂或斷裂。在一些實施例中，將該容器放置於冷凍容器內(例如，使用浮子(例如，可漂浮於冷凍容器內之液氮或其他冷凍液體上之浮子))。用於細胞之容器之非限制性實例包括細胞吸管、玻璃安瓿、冷凍管、冷凍小瓶等。在某些情況下，該容器可預先貼上標籤。
與本發明相關聯之其他組合物或組分之實例包括(但不限於)稀釋劑、鹽、緩衝液、螫合劑、防腐劑、乾燥劑、抗菌劑、針、注射器、包裝材料、管、瓶子、燒瓶、燒杯，及類似物，例如，用於使用、修飾、組裝、儲備、包裝、製備、混合、稀釋及/或保存特定用途之組分。在使用該等組分中任一者之液體形式之實施例中，該液體形式係經濃縮或隨時可用。
本發明之套組一般包括以針對結合本發明之組分及/或方法使用該套組提供之任何形式之說明書或網站或其他來源之說明書。例如，該等說明書可包括用於使用、修飾、混合、稀釋、保存、組裝、儲備、包裝及/或製備組分及/或與該套組相關聯之其他組分之說明書。在一些情況下，該等說明書亦包括用於遞送組分(例如，用於在室溫、零下溫度、冷凍溫度等下運輸)之說明書。該等說明書係以對該套組之使用者有用之任何形式提供，諸如以任何方式提供，書面或口頭(例如，電話)、數位、光學、視覺(例如，錄影帶、DVD等)及/或電子通訊(包括網際網路或基於網路之通訊)。 冷凍保存之細胞之用途
使用本文描述之冷凍保存介質冷凍保存及解凍之細胞容許出於初生細胞或新鮮細胞分離物可具有之任何目的使用該等細胞。冷凍保存及解凍之細胞保留其等天然狀態之高存活率(例如，大於70%、75%、80%、85%或90%)且保留生理特性，其容許該等細胞用於各種應用，諸如用於細胞之遺傳操作，及用於細胞療法目的，諸如，舉例而言，用於過繼細胞療法應用中。
各種基因修飾及相關用途可用如本文描述冷凍保存之細胞成功進行。作為一項實例，自iPS來源直接分離或製備之T細胞(即，iT細胞)可如本文描述冷凍保存。此等細胞可接著以所需方式(例如通過引入所需嵌合抗原受體(CAR))解凍及基改。此等經基改以表現CAR之iT細胞(即，iCART細胞)可接著冷凍保存或藉由過繼細胞療法引入有需要病患內。此等細胞保留高存活率且可於受體個體內增殖。 實例
本發明之其他特徵、目標及優勢在以下實例中顯而易見。然而，應瞭解實例(儘管指示本發明之實施例)僅以闡述而非限制之方式給定。本發明範圍內之各種變化及修飾對於熟習此項技術者而言自該等實例將變得顯而易見。 實例1：製備冷凍調配物以冷凍保存細胞
此實例闡述經製備以冷凍保存iCART細胞之不同冷凍調配物。
在此實例中，製備十一種不同之冷凍調配物。該等冷凍調配物為冷凍調配物#1、冷凍調配物#2、冷凍調配物#3、冷凍調配物#4、冷凍調配物#5、冷凍調配物#6、冷凍調配物#7、冷凍調配物#8、冷凍調配物#9、冷凍調配物#10及冷凍調配物#11。所有此等冷凍調配物之組成均顯示於圖1中。此等冷凍調配物之效用係藉由冷凍保存野生型iCART細胞，及然後評估其等在NOD/Shi-scid，IL-2R γ基因剔除小鼠(「NSG小鼠」)中之活體內效用來測試。T細胞活化係抗原依賴性過程，其導致初始T細胞增殖並分化為效應細胞。初生CART細胞及新鮮CART細胞用作陽性對照。詳細程序提供於下文實例3中。 實例2：iCART細胞之製備
此實例闡述在評估iCART細胞之活體內效用前製備該等iCART細胞。圖2係自冷凍iT細胞製備iCART細胞之示意圖。
iCART細胞源於iT細胞。將冷凍iT細胞解凍(第1天)，並容許在接下來三天內恢復。在第4天，容許iT細胞經受第一活化步驟(活化-1)。此藉由以如根據已知方法(例如，WO 2017/221975中描述之方法)進行之活化培養該等iT細胞來進行。
在第7天，細胞經受第一轉導步驟(轉導x 1)，此係藉由在塗佈重組人類纖維連接蛋白(retronectin)之板上用反轉錄病毒載體旋轉接種該等iT細胞進行。在第8天，該等細胞經受第二轉導步驟(轉導x 2)。此係藉由在塗佈重組人類纖維連接蛋白之板上用反轉錄病毒載體旋轉接種轉導x 1中獲得之細胞進行。在第16天，此等細胞經受第二活化(活化-2)。此係藉由在塗佈CD3之燒瓶中用活化培養基(其含有IMDM (Thermo Fisher)、15% FBS、1xPSG)、胰島素-轉鐵蛋白-硒補充劑、抗壞血酸2-磷酸鹽、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、TL-1A、泛凋亡蛋白酶FMK抑制劑Z-VAD及CD30激動抗體)將轉導x 2中獲得之細胞培養3天進行。活化三天後，將細胞擴增12天(擴增1)，同時經受活化及轉導過程。第二活化後，將細胞再擴增8天(擴增2)。在第24天，使用不同冷凍調配物冷凍保存擴增2中獲得之細胞(即，iCART細胞)。在第28天，如此製備之iCART細胞已準備好注射至NSG小鼠內。 實例3：使用不同冷凍調配物保存之野生型iCART細胞之活體內效用之比較
此實例比較使用三種不同之冷凍調配物(冷凍調配物#2、冷凍調配物#6及冷凍調配物#10)冷凍保存之野生型iCART細胞之活體內效用。包括此等三種冷凍調配物及劑量之不同治療組顯示於圖3A中。
在NSG小鼠中測試野生型iCART細胞之活體內效用。該等NSG小鼠移植表現螢光素酶之Nalm6細胞(ATCC；癌細胞)。該等NSG小鼠，雄性，4至5週齡源於Jackson實驗室。移植Nalm6細胞後四天，經由尾靜脈向移植Nalm6之NSG小鼠投與使用不同冷凍調配物冷凍保存之iCART細胞。在向小鼠投與iCART細胞或初生CART細胞或新鮮細胞後，經由尾靜脈向該等小鼠投與螢光素。在Nalm6接種後60天內，使用IVIS成像系統(PerkinElmer)根據總輻射通量量測螢光素酶活性。此處描述之相同程序亦將適用於討論細胞之活體內效用之其他實例。
此等實驗指示，冷凍調配物#6具有最顯著之FLUX降低，指示減少測試動物中Nalm6細胞之量之活體內效用(圖3B及3C)。 實例4：清洗冷凍調配物對野生型iCART細胞之活體內效用之影響
此實例闡述在向小鼠投與iCART細胞前，在製備使用不同冷凍調配物冷凍保存之iCART細胞中包括清洗步驟之效應。在此實例中，測試如表1中提供之下列三種調配物。 表1
調配物編號 調配物組成
調配物1 50% CS10 + 50%擴增培養基(IMDM + 15%人類血清+細胞介素*)；*細胞介素：IL-7及IL-15，最終濃度5 ng/mL
調配物2 50% CS10 + 50%擴增培養基(IMDM + 5% HSA +細胞介素*)；*細胞介素：IL-7及IL-15，最終濃度5 ng/mL
調配物3 STEM-CELLBANKER® GMP級
清洗步驟包括用1x冷培養基清洗冷凍保存之iCART細胞，用冷DPBS清洗一次，及將該等細胞重懸浮於冷DPBS中，接著將其等注射至小鼠內。低水位及高水位清洗完全按照您於此處提及之進行：用1x冷介質清洗，用冷DPBS清洗一次，及將該等細胞重懸浮於冷DPBS中，接著將其等注射至小鼠內。針對低劑量及高劑量，吾人將最終CAR+細胞濃度分別重懸至1.5E7/200 μL及4.0E7/200 μL DPBS。細胞之劑量係基於解凍後細胞數量計數。在未清洗情況下，冷凍保存之細胞在注射至小鼠內前未清洗。將該等細胞解凍且在解凍後連同該冷凍調配物一起立即注射。在未清洗情況下，細胞之劑量係基於冷凍前細胞計數。
為測試清洗步驟對iCART細胞之活體內效用之影響，採用如圖4中闡述之實驗設計。iCART細胞之活體內效用係藉由在兩週內使用IVIS成像系統(PerkinElmer)量測螢光素酶活性評定。
圖5闡述在投與iCART細胞後一週，iCART細胞之活體內效用。僅接受PBS緩衝液而無iCART細胞之小鼠顯示非常高之螢光素酶表現。接受初生CART細胞之小鼠不顯示螢光素酶表現之任何徵象。經不同調配物處理之小鼠顯示證實使用不同冷凍調配物冷凍保存之iCART細胞之活體內效用之可忽略之螢光素酶表現之徵象。一隻接受清洗調配物2/低水位清洗且在圖中由矩形框標識之小鼠受注射相關問題影響。
圖6闡述在投與iCART細胞後兩週，iCART細胞之活體內效用。相較於第1週，僅接受PBS緩衝液而無iCART細胞之小鼠顯示甚至更強烈之螢光素酶表現。接受初生CART細胞之小鼠仍不顯示螢光素酶表現之任何徵象。一般而言，經不同調配物處理之小鼠顯示證實使用不同冷凍調配物冷凍保存之iCART細胞之活體內效用之無至可忽略之螢光素酶表現之徵象。然而，不同於經其他調配物處理之小鼠，經調配物2/低水位清洗及調配物3/低水位清洗處理之小鼠顯示一些螢光素酶表現，其指示高水位清洗或無清洗步驟更好地保存iCART細胞。 實例5：新鮮iCART細胞相比於冷凍儲備之iCART細胞之活體內效用
此實例比較新鮮iCART細胞相比於冷凍儲備之iCART細胞之活體內效用。在此實例中，測試如圖7A中提供之五種不同調配物。在條件#1、2及4中，IL-7及IL-15係作為細胞介素添加。
在調配前擴增iCART細胞。為進行iCART細胞之擴增培養，將細胞以2,000,000個細胞之形式懸浮於含有15% FBS及表2中顯示之細胞介素之15 mL IMDM培養基中，並接種於T25燒瓶上，於其中固定化抗CD3抗體(OKT3)及重組人類纖維連接蛋白(Takara Bio)。在5% CO2 / 37℃下進行細胞培養。3天後，收集細胞，並使用NucleoCounter NC-200 (ChemoMetec)計數細胞數量。以適當量將該等細胞懸浮於含有15% FBS及表3中顯示之細胞介素之IMDM培養基(Thermo Fisher)中，然後添加至非固化G-REX 6M板(WILSONWOLF)上並在5% CO2 / 37℃下培養四天。 表2
項目 供應商 最終濃度
胰島素-轉鐵蛋白-硒補充劑 Invitrogen 1 x
抗壞血酸2-磷酸鹽 Sigma 50 μg/mL
IL-7 Peprotech 10 ng/mL
IL-12 Merck 50 ng/mL
IL-15 Peprotech 10 ng/mL
IL-18 MBL 50 ng/mL
IL-21 Peprotech 20 ng/mL
TL-1A Peprotech 50 ng/mL
z-VAD-FMK R&D 10 μM
抗CD30抗體 R&D 300 ng/mL
表3
項目 供應商 最終濃度
胰島素-轉鐵蛋白-硒補充劑 Invitrogen 1 x
抗壞血酸2-磷酸鹽 Sigma 50 μg/mL
IL-7 Peprotech 10 ng/mL
IL-15 Peprotech 10 ng/mL
在iCART細胞擴增步驟後，自G-REX獲得細胞，然後用清洗緩衝液(5%HSA於Isolyte S中)使用Sefia S-2000細胞處理儀器清洗並將該等細胞濃縮至大約50 mL之最終體積，以製備調配物及冷凍儲備液。該冷凍儲備液係藉由使用CryoMEDTM 冷凍保存細胞並儲備於-150℃冷凍器中製備。
為比較新鮮iCART細胞及冷凍儲備之iCART細胞之活體內效用，使用如圖7B中闡述之實驗設計。冷凍保存後17天，圖7B中Gr-10及11之冷凍儲備之iCART細胞係由ThawSTAR解凍並用冷IMDM清洗兩次且以1.0E+07 CART細胞/劑量之濃度重懸浮於D-PBS中。冷凍保存後7至14天，Gr-2-9之冷凍保存之細胞係由ThawSTAR解凍並用IMDM清洗，然後經培養或擴增，然後清洗並以1.0E+07 CART細胞/劑量之濃度重懸浮於D-PBS中(如圖7B中描述)。如圖7C中闡述，在NSG小鼠中，在接種靶細胞(即，Nalm6細胞)後四天，投與新鮮iCART細胞或冷凍儲備之iCART細胞。經由尾靜脈投與iCART細胞之懸浮液。投與相同體積之PBS作為對照。投與概況描述於圖7B中。Gr-2、4及6中之iCART細胞以與上文相同之方式擴增7天。Gr-3、5、7、8及9中之iCART細胞在用IL-7及IL-15補充之IMDM中培養3天。iCART細胞之活體內效用係藉由在六週內使用IVIS成像系統(IVIS LUMINAⅡ，由CaliperLS製造)量測螢光素酶活性評定。
圖8闡述在投與新鮮或冷凍儲備之iCART細胞六週後，iCART細胞之活體內效用。如圖8中由交叉(x)符號顯示，僅接受PBS緩衝液(對照)或Gr-10/條件#3/清洗冷凍儲備液或Gr-11/條件#4/清洗冷凍儲備液之小鼠無法存活六週。接受Gr-12 (初生CART細胞)/冷凍儲備液之小鼠顯示非常微不足道之螢光素酶表現。接受Gr-2/新鮮細胞之小鼠不顯示任何螢光素酶表現。經其他調配物/條件處理之小鼠顯示證實使用不同冷凍調配物冷凍保存之冷凍儲備之iCART細胞之活體內效用之無至可忽略之螢光素酶表現之徵象。經Gr-2，條件#2處理，冷凍恢復之所有小鼠均存活超過六週且不顯示螢光素酶表現之任何徵象，指示此調配物為最有效調配物中之一者。
圖9闡述在投與新鮮或冷凍儲備之iCART細胞後六週，iCART細胞之活體內效用。iCART細胞之活體內效用已以總通量(螢光素酶表現程度之定量表現)表示。除Gr-1，對照；Gr-10，條件#3，冷凍清洗；及Gr-11，條件#4，冷凍清洗外，所有治療組在六週結束時均顯示iCART細胞之活體內效用。重要地，Gr-3，條件#1，冷凍恢復；Gr-5，條件#2，冷凍恢復；及Gr-8，條件#4，冷凍恢復係最有效調配物中之一些。 實例6：評估使用有及無細胞介素之調配物冷凍保存之iCART細胞之活體內效用
此實例闡述使用有及無細胞介素(IL-2、IL-7及IL-15)之調配物冷凍保存之iCART細胞之活體內效用之評估。此實例中之iCART細胞係以與實例5相同之方式獲得。在T細胞擴增步驟後，自G-REX獲得細胞，然後用清洗緩衝液(5%HAS於Isolyte S中)使用Sefia S-2000細胞處理儀器清洗並將細胞濃縮至大約50 mL之最終體積，以製備冷凍調配物。該等冷凍調配物係藉由使用CryoMEDTM 冷凍保存細胞並儲備於-150℃冷凍器中製備。在此實例中，製備十三種不同之冷凍調配物。該等冷凍調配物係調配物#1、調配物#2、調配物#3、調配物#4、調配物#5、調配物#6、調配物#7、調配物#8、調配物#9、調配物#10、調配物#11、調配物#12及調配物#13。所有此等調配物之組合物均顯示於圖10中。
為評估使用此等調配物(有及無細胞介素(IL-7及IL-15))冷凍保存之iCART細胞之活體內效用，使用如圖11A及11B中闡述之實驗設計。經由尾靜脈投與iCART細胞之懸浮液。投與相同體積之PBS作為對照。投與概況描述於圖11A中。
圖12闡述在投與iCART細胞後三週，iCART細胞之活體內效用。iCART細胞之活體內效用已根據螢光素酶表現程度表現。如圖12中由交叉(x)符號指示，經PBS緩衝液(對照)，或Gr-6調配物#2或Gr-14調配物#7或Gr-19調配物#12或Gr-20調配物#13處理之小鼠無法存活三週。在五隻經處理之小鼠之一者中，接受Gr-3 (初生CART細胞)之小鼠顯示非常微不足道之螢光素酶表現。在五隻經處理之小鼠之兩者中，接受Gr-2 (新鮮iCART細胞)之小鼠顯示一些螢光素酶表現。經其他調配物/條件處理之小鼠顯示指示使用不同冷凍調配物冷凍保存之iCART細胞之不同活體內效用之不同程度之螢光素酶表現。在經一種調配物或其他調配物處理之小鼠中，治療組：Gr-7調配物#3、Gr-8調配物#3、Gr-9調配物#4及Gr-10調配物#4，為最有效之調配物。
圖13闡述在投與iCART細胞後四週，iCART細胞之活體內效用。在四週結束時，Gr-7調配物#3及Gr-8調配物#3為最有效之調配物。
圖14闡述在投與iCART細胞後四週，iCART細胞之活體內效用。iCART細胞之活體內效用係以總通量表示。接受Gr-2 (新鮮iCART細胞)之小鼠(陽性對照組)顯示最低總通量，其指示該組最有效。在四週結束時，Gr-7調配物#3、Gr-8調配物#3及Gr-9調配物#4為最有效之調配物。
圖15闡述在投與iCART細胞後四週內，iCART細胞之細胞動力學。為評估活體內持久性，分析iCART在小鼠中之細胞動力學。自尾靜脈收集30 μL血液。將0.3 μL抗人類CD3抗體(純系UCHT1, BioLegend)及0.3 μL抗人類CD45抗體(純系HI30, BioLegend)直接添加至血液，並在室溫下反應20分鐘。在該反應後，用FACS裂解溶液(BD Biosciences)進行溶血及固定，並用LSR Fortessa (BD Biosciences)將人類CD3及CD45雙重陽性細胞均作為iCART偵測。iCART細胞之細胞動力學係以CD45+CD3+細胞表示。在該等調配物中，相較於其他調配物，調配物#3、調配物#4、調配物#5、調配物#10及調配物#11顯示更高之CD45+CD3+細胞之表現。此資料係與活體內抗腫瘤效用之結果一致。例如，用#3、4及5調配之iCART顯示比其他條件更高之活體內持久性，其係與更高之抗腫瘤效應緊密相連。實例5及6中使用之調配物之各組分之供應商匯總於表4中。 表4
組分 供應商
Isolyte S B. Braun
IMDM(伊斯科夫改良之杜爾貝科培養基) Thermo Fisher
PSG (青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸) Thermo Fisher
ITS (胰島素-轉鐵蛋白-硒) Invitrogen
pAA (抗壞血酸2-磷酸鹽) Sigma
人類男性AB血清，HI GI Access Cell Culture
Albuminar-25 (人類) CSL Behring
IL-2 PeproTech
IL-7 PeproTech
IL-15 PeproTech
CryoStor® CS10 BioLife Solutions
Stem Cell Banker ZENOAQ
Bambanker hRM Lymphotec
BloodStor® 100 (DMSO) BioLife Solutions
蔗糖 WAKO
等同物及範圍
僅使用例行性實驗，熟習此項技術者應知曉或可確定本文描述之本發明之特定實施例之許多等同物。本發明之範圍無意僅限於上文實施方式，而是如下列申請專利範圍中闡述。
圖1闡述一種實驗設計，其包括不同冷凍調配物數量及其等組成、其上測試各調配物之小鼠之數量，及細胞之iCART細胞活化及轉導天數。
圖2係自冷凍iPSC衍生之T細胞(「iT細胞」)製備iCART細胞之示意圖。
圖3A闡述一種實驗設計以測試使用冷凍調配物#2、冷凍調配物#6及冷凍調配物#10冷凍保存之iCART細胞之活體內效用。該設計包括調配物組成、其上測試各調配物之小鼠之數量、向小鼠投與之細胞之劑量/s，及細胞之活化/收集天數。圖3B闡述使用冷凍調配物#2、冷凍調配物#6及冷凍調配物#10冷凍保存之iCART細胞之平均活體內效用。圖3C闡述使用冷凍調配物#2、冷凍調配物#6或冷凍調配物#10冷凍保存之各小鼠中iCART細胞之活體內效用。iCART細胞之活體內效用係以總輻射通量表示。
圖4闡述一種實驗設計以測試冷凍調配物之低水位及高水位清洗對野生型iCART細胞之活體內效用之影響。該設計包括三種不同之調配物、iCART細胞之劑量、其上測試各調配物之小鼠之數量，及靶細胞(即，Nalm6細胞)及iCART細胞之投與途徑。
圖5闡述使用圖4中闡述之調配物冷凍保存之iCART細胞之活體內效用。在投與iCART細胞後一週，量測以螢光素酶表現表示之iCART細胞之活體內效用。
圖6闡述使用圖4中闡述之調配物冷凍保存之iCART細胞之活體內效用。在投與iCART細胞後兩週，量測以螢光素酶表現表示之iCART細胞之活體內效用。
圖7A闡述用於製備冷凍儲備之iCART細胞之五種不同之調配物/條件。圖7B闡述一種實驗設計以測試新鮮iCART細胞相比於冷凍儲備之iCART細胞之活體內效用。該設計包括五種不同之調配物、iCART細胞之劑量、冷凍儲備液之冷凍儲備培養(termculture)及擴增，及其上測試各調配物之小鼠之數量。圖7C係在圖7B闡述之實驗設計中，投與靶細胞及效應細胞(新鮮或冷凍儲備之iCART細胞)後之時間表之示意圖。
圖8闡述在投與新鮮或冷凍儲備之iCART細胞後六週，iCART細胞之活體內效用。iCART細胞之活體內效用係以小鼠中之螢光素酶表現表示。
圖9闡述在投與新鮮或冷凍儲備之iCART細胞後六週，iCART細胞之活體內效用。iCART細胞之活體內效用已以總通量(螢光素酶表現程度之定量表現)表示。
圖10闡述有及無細胞介素之十三種不同之冷凍調配物。
圖11A及11B闡述一種實驗設計以評估使用圖10中闡述之調配物冷凍保存之iCART細胞之活體內效用。
圖12闡述在投與iCART細胞後三週，iCART細胞之活體內效用(就螢光素酶表現而言)。
圖13闡述在投與iCART細胞後四週，iCART細胞之活體內效用(就螢光素酶表現而言)。
圖14闡述在投與iCART細胞後四週，iCART細胞之活體內效用。iCART細胞之活體內效用係以總通量表示。
圖15闡述在投與iCART細胞後四週，iCART細胞之細胞動力學(就CD45+CD3+細胞而言)。iCART細胞之細胞動力學係相對於不同調配物表示。

Claims (33)

  1. 一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：二甲亞碸(DMSO)、雙醣、人類血清，及IL-7或IL-15。
  2. 一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：二甲亞碸(DMSO)、雙醣、人類血清白蛋白，及IL-7或IL-15。
  3. 如請求項1或2之冷凍保存介質，其中該介質包含：IL-7及IL-15。
  4. 一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：介於約1 w/v%至10 w/v%之間的二甲亞碸(DMSO)、介於約0.25 w/v%至5 w/v%之間的雙醣，及介於約10 w/v%至90 w/v%之間的人類血清。
  5. 一種用於冷凍保存哺乳動物細胞之冷凍保存介質，該介質包含：介於約1 w/v%至10 w/v%之間的二甲亞碸(DMSO)、介於約0.25 w/v%至5 w/v%之間的雙醣，及介於約0.5 w/v%至30 w/v%之間的人類血清白蛋白。
  6. 如前述請求項中任一項之冷凍保存介質，其中該雙醣係蔗糖。
  7. 如請求項6之冷凍保存介質，其中該介質基進一步包含D-葡萄糖。
  8. 如請求項4至7之冷凍保存介質，其進一步包含一或多種細胞介素。
  9. 如請求項8之冷凍保存介質，其中該等細胞介素係選自IL-7及IL-15。
  10. 如請求項4至9之冷凍保存介質，其包含IL-7及IL-15。
  11. 如請求項10之冷凍保存介質，其中IL-7係以介於約1 ng/mL至50 ng/mL之間的最終濃度存在。
  12. 如請求項11之冷凍保存介質，其中IL-7係以約5 ng/mL之最終濃度存在。
  13. 如請求項10之冷凍保存介質，其中IL-15係以介於約1 ng/mL至50 ng/mL之間的最終濃度存在。
  14. 如請求項13之冷凍保存介質，其中該IL-15係以約5 ng/mL之最終濃度存在。
  15. 如前述請求項中任一項之冷凍保存介質，其進一步包含哺乳動物細胞培養基。
  16. 如請求項15之冷凍保存介質，其中該哺乳動物細胞培養基係以約介於10 w/v%至90 w/v%之間存在。
  17. 如請求項15至16中任一項之冷凍保存介質，其中該哺乳動物細胞培養基不包含非人類動物組分。
  18. 如前述請求項中任一項之冷凍保存介質，其進一步包含一或多種胺基酸。
  19. 如前述請求項中任一項之冷凍保存介質，其進一步包含一或多種無機鹽。
  20. 如前述請求項中任一項之冷凍保存介質，其中該pH介於約7至8之間。
  21. 一種套組，其包含如前述請求項中任一項之冷凍保存介質。
  22. 一種冷凍保存哺乳動物細胞之方法，該方法包括： (a)使該等細胞與如請求項1至20中任一項之冷凍保存介質接觸；及 (b)以約1℃/分鐘冷卻該等細胞至-80℃或以下之溫度。
  23. 一種冷凍保存並恢復活細胞之方法，該方法包括： (a)使該等細胞與如請求項1至20中任一項之冷凍保存介質接觸； (b)以約1℃/分鐘冷卻該等細胞至-80℃或以下之溫度，藉此冷凍保存該等細胞；及 (c)解凍該等冷凍保存之細胞。
  24. 如請求項23之方法，其中該等經解凍之冷凍保存之細胞在後續培養或植入個體內前未清洗。
  25. 如請求項24之方法，其中相較於用非如請求項1至20中任一項之冷凍保存介質冷凍並解凍之細胞，該等經解凍之冷凍保存之細胞具有增強之細胞存活。
  26. 如請求項25之方法，其中該等經解凍之冷凍保存之細胞具有活體外增強之細胞存活。
  27. 如請求項25之方法，其中該等經解凍之冷凍保存之細胞在植入個體內後具有增強之細胞存活。
  28. 如請求項22至27中任一項之方法，其中該等哺乳動物細胞係淋巴球或前驅細胞。
  29. 如請求項22至27中任一項之方法，其中該等哺乳動物細胞係基改淋巴球或前驅細胞。
  30. 如請求項22至27中任一項之方法，其中該等哺乳動物細胞係誘導性多能細胞(iPSC)衍生之淋巴球或前驅細胞。
  31. 如請求項28至30中任一項之方法，其中該等淋巴球係T細胞或自然殺手(NK)細胞。
  32. 如請求項28之方法，其中該等前驅細胞係iPSC、造血前驅細胞(HPC)或胚胎幹細胞(ESC)。
  33. 如請求項28之方法，其中該等哺乳動物細胞係適用於過繼細胞療法。
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