KR101101308B1 - 인간 유래 단핵세포의 냉동보존용 배지 조성물 - Google Patents

인간 유래 단핵세포의 냉동보존용 배지 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간유래 단핵세포의 장기간 냉동보존을 위해 냉동보존기간 동안 세포의 손실을 막고, 목적하는 세포의 회수율을 최대화하기 위해 새로운 동결배지를 조성하여 인간유래 세포와 현탁하여 세포를 동결보존한 목적세포의 해동 후 기능 및 수율을 높이도록 한 동결배지 조성물에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따른 인간 유래 단핵세포의 냉동보존용 배지 조성물은, DMSO, 하이드록시에틸 스타치, 자가혈장(autologous plasma) 및 무동물혈청 배지(serum free media) 외에 에틸렌 글라이콜(ethlyene glycol)이 함유된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면 기존 인간유래 세포의 냉동보존 후 목적세포의 수율이 낮은 한계점을 극복하기 위하여 고안되었으며, 본 발명에 의한 새로운 동결배지 조성물을 목적세포와 현탁하여 최종 액화 질소탱크에 동결보존하여 해동 후 목적 세포의 수율을 높여 환자 치료에 이용시 치료 효율을 높이는 효과를 거둘 수 있다.
제대혈 유래 단핵세포, 말초혈액 유래 단핵세포, 냉동보존, 동결배지

Description

인간 유래 단핵세포의 냉동보존용 배지 조성물{The composition of cryo-medium for cryopreservation of human-derived mononuclear cells}
본 발명은 인간 유래 단핵세포의 냉동보존용 배지 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 향후 세포치료제의 제조에 이용될 수 있는 인간 제대혈 유래 단핵세포(MNC, mononuclear cell)와 말초혈액 단핵세포를 채집하여 최대한 세포의 기능을 안정하게 유지하면서 장기간 냉동보관하기 위한 특정 동결배지 조성물에 관한 것이다.
인간유래 세포의 동결보존의 중요성이 커져가고 있어 성공률이 높은 동결보존 기술이 활발히 연구되고 있다. 하지만, 아직도 방법만을 익혀 누구나 재현할 수 있는 방식은 개발되지 못하고 있다. 동결보존에 있어서 목적 세포의 생존율은 그 세포의 크기, 동결방지제 (cryoprotectant)의 조성, 농도 및 노출 시간, 세포의 냉동속도, 최종 냉동보존 온도 및 해동 속도에 의존한다. 특히 목적세포의 크기는 동결보존 공정전체에서 세포의 생존율에 영향을 끼치는 매우 중요한 매개변수이다. 즉, 세포에 다량 존재하는 수분이 냉동 과정 동안 세포 내 얼음 생성을 유발하기 때문에 생성된 세포 내 얼음은 세포의 구조 손상의 주요한 요인이다. 이런 손상을 방지하기 위해 일반적으로 동결방지제를 사용하는데, 세포 투과성 동결방지제(glycerol, DMSO, glycols류 등)와 비투과성 동결방지제(sucrose, raffinose, lactose, trehalose, PVP, dextran, serum 및 albumin 등)가 있다. 세포 투과성 동결방지제는 세포 내로 침투하여 세포내 수분량을 감소시켜 동결시 세포 내 빙정형성을 억제하여 세포를 보호하지만, 비투과성 동결방지제는 동결직전 세포 내 수분의 유출을 조장하여 세포 내외의 삼투평형을 초래하여 세포막의 손상을 방지한다.
목적세포의 일반적인 냉동보존 공정에서는, 동결방지제가 첨가된 동결배지에 목적세포를 현탁한 후 냉동시킨다. 세포를 냉동시키는 방법은 완만동결법, 초급속동결법 및 초자화동결법으로 나눌 수 있다. 완만동결법은 동결속도가 미리 입력된 자동동결기 혹은 iso-propanol box를 이용하여 세포의 온도를 동결속도 -0.5℃/min 내지 4℃/min 속도로 -80℃ 내지 -100℃까지 낮추어 최종 냉동보존하는 것이다. 초급속동결법은 동결기기를 사용하지 않고 목적세포를 동결배지에 현탁시킨 후 액체질소에 직접 침지하는 방법이며, 초자화동결법은 목적세포를 고농도의 동해방지제에 노출하여 초자화(vitrification)를 통해 세포 내 빙정이 형성되지 않고 유리질 모양으로 고형화되어 세포의 손상을 최소할 수 있는 방법이다.
위의 방법 중 한 가지 방법으로 동결된 세포는 최종 초저온 탱크에 일정기간 동안 보존되는데, 일반적으로 -196℃ 액체 질소 용기에 보관한다. 동결세포가 장시간 가장 안전하게 보관될 수 있는 온도는 -130℃ 이하로서, 초저온 냉동고를 사용 하여 보관할 경우 -70℃를 유지하게 되는데 이 온도에서는 세포 내 물질대사가 완전히 멈춘 상태가 아니므로 1개월 이상의 장시간 보관은 불가능하다. -130℃ 이하의 온도에서는 물분자의 상변화가 완전히 정지하므로 거의 영구적으로 보관이 가능하다.
이후 세포의 해동 과정에서도 동결과정에서와 마찬가지의 기계적, 화학적, 물리적 영향을 받게 되는데 두 과정의 차이점은 처음 시작하는 세포의 상태에 있다. 동결과정의 경우 충분히 수화된 세포가 주변 환경과 평형을 이룬 상태에서 반응하지만 해동 과정의 경우 동결건조상태이거나 세포 내 얼음 결정이 존재하는 상태에서 반응하게 된다. 만약 해동과정이 천천히 이루어진다면 세포 외액으로부터 세포 내로 수분이 유입되면서 세포 내의 얼음 재결정화(recrystalization) 현상이 발생하게 된다. 즉 해동 시 전체 얼음의 양은 감소하지만 재결정화 현상이 발생하며 이것은 세포에 치명적인 손상을 입히게 된다. 따라서 해동과정을 최대한 신속히 진행하여야 해동 후 세포 생존율이 증가할 수 있다. 일반적으로 액체질소 용기에서 동결튜브를 37℃ 수조로 옮겨 1분 내에 해동시키는 방법으로 최대의 세포 생존율을 얻을 수 있다(1200℃/min).
동결보존기술의 진보로부터 크게 도움이 되는 특히 중요한 영역은 동결보존세포의 세포치료로서의 이용에 있다. 그 대표적인 분야가 제대혈 세포 이식 기술의 개발이다. 1980년대 인간의 태아 혈액에서 동종이형의 제대혈 이식이 최초로 성공한 이래, 이는 골수이식을 대체할 수 있는 중요한 조혈줄기세포 공급원으로 인식되 고 있다. 특히 최근에는 제대혈 속에 있는 조혈모세포 (hematopoietic stem cells, HSC)과 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSC)가 각각 거의 모든 종류의 혈구세포 및 조직세포로 분화할 수 있다는 것이 증명되면서 세포 치료제 개발을 위한 세포 증식 및 분화 연구에 널리 이용되고 있다. 그러나 아직까지 채취할 수 있는 제대혈이 한정적이며 또한 채취된 제대혈에 포함되어 있는 줄기세포의 양이 한정적이다. 이 때문에 제대혈 이식 대상이 이른 청소년기로 한정이 되어 있고, 또한 분리하여 연구에 이용하기에도 어려운 점이 있다. 따라서 이식용 혹은 연구용 제대혈 줄기세포를 미리 채취하여 장기간 보관한 후 필요할 때 모아서 사용하기 위한 연구도 활발히 진행 중에 있다. 하지만 현재까지 해동 후의 세포 생존율과 회수율이 높지 않아 사용에 있어서의 문제점을 극복하지 못하고 있는 실정이다.
제대혈 단핵세포의 안정한 냉동보존을 위하여 통제속도냉각장치(controlled-rate freezer)로 일정한 속도로 냉각시킨 후 액체질소탱크 (liquid nitrogen tank)에 보존하는 기법 혹은 -80℃ 냉동고에서 장기간 보존하는 방법이 사용되고 있는데, 이 두 가지 방법이 가진 장단점으로 인해 현재까지도 양자를 비교하여 연구가 진행되고 있다. 특히 상기의 단핵세포들은 다양한 세포를 함유하고 있어 몇십 년 이상의 장기보관에 사용하기 위해서는 안정적인 초저온 유지와 함께 보관기간 동안 세포에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 동결배지의 조성이 매우 중요하다. 현재까지 대표적인 동결보호제로 DMSO를 최종적으로 10중량%가 되도록 하여 Dextran-40, hepaspan(HES) 등과 함께 현탁한 것을 널리 사용하고 있으나, DMSO의 세포 독성으로 인해 장기간 동결보존을 위한 DMSO 농도를 낮추어 보존하려는 움직임이 활발하 지만 성공을 거두지 못하고 있다. 따라서 본 발명에서는 제대혈 세포를 포함한 인간 유래 단핵세포의 안정적인 장기간 동결보존을 위해, DMSO의 농도가 낮으면서도 최적의 효율을 갖는 동결배지 조성물을 제시하고자 한다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 종래에 비해 세포의 동결에 따라 CD3, CD14, CD34 등의 특정 표면항원을 발현하는 세포의 고회수율을 얻기 위해, 제대혈 유래 단핵세포, 말초혈액 유래 단핵세포 등의 인간 유래 단핵세포를 장기간 동안 보존할 수 있는 새로운 동결배지 조성물을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 인간 유래 단핵세포의 냉동보존용 배지 조성물은, DMSO, 헤스판(hespan, =하이드록시에틸 스타치), 자가혈장(autologous plasma) 및 무동물혈청 배지(serum free media) 외에 에틸렌 글라이콜(ethlyene glycol)이 함유된 것을 특징으로 한다.
이때, 에틸렌 글라이콜(ethlyene glycol)의 함량은 1~20중량%인 것을 특징으로 한다.
또한 0.1~5중량%의 DMSO, 1~20중량%의 하이드록시에틸 스타치, 1~20중량%의 에틸렌 글라이콜(ethlyene glycol), 1~50중량%의 자가 혈장(autologous plasma) 및 나머지의 무동물혈청 배지(serum free media)로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한 위 각 경우에 있어서, 인간 유래 단핵세포는 인간 제대혈, 골수 및 말초혈액 중의 어느 하나로부터 유래된 것임을 특징으로 한다.
위와 같은 본 발명의 동결배지 조성물은 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol)을 적정 비율로 첨가하는 것을 특징 중의 하나로 하는데, 이처럼 저분자량과 높은 투과력을 가져 세포 독성이 더욱 낮은 에틸렌 글라이콜을 첨가함으로써 현재까지 널리 이용되고 있는 배지 조성물에서 10중량%을 차지하는 DMSO의 농도를 줄여 세포의 안정성을 더욱 높일 수 있다.
뒤의 실험예에서 설명하듯이 본 발명은, 공여자인 사람의 제대혈 유래 단핵세포 및 말초혈액 단핵세포를 분리하는 1단계;
1단계와는 별도로 동결배지를 조성하는 2단계;
상기 1단계에서 분리된 단핵세포를 상기 2단계에서 조성된 동결배지에 현탁하여 동결튜브에 넣어 냉동보존하는 3단계; 및
상기 3단계에서 냉동보존한 세포를 해동하여 융해 복원한 후 세포의 회수율 측정, 표면항원 분석 및 콜로니 증식능 분석을 위해 배양하는 4단계를 통해 시험해 볼 수 있다.
상기 1단계에서는 트리플백이나 채집을 통해 채혈한 제대혈 혹은 말초혈액을 Histopaque-1077 용액을 이용하여 단핵세포(MNC)를 분리할 수 있다. 분리된 단핵세포(MNC)는 CD3, CD14 그리고 CD34 단클론항체 등과 반응시켜 각 항원의 세포표면의 발현율을 측정한다. 그리고 상기 1단계와는 별도로 상기 2단계에서는 동결배지 조성물을 이용하여 조성물의 농도를 달리하여 동결배지를 조성한다. 이들 조성물을 이용하여 세포의 동결보존 후 해동세포의 특징을 분석하여 최적의 동결배지 조성물 을 선택한다.
상기 제1단계에 대해 더 설명하면, 이는 제대혈에서 단핵세포를 분리하는 단계로서 종래의 공지된 방법을 사용한다. 채혈방법으로서는 태아 분만 후 산모의 탯줄에서 혈액 채취백을 이용하여 제대혈을 채취하여 단핵세포를 얻을 수 있으며, 그 외 단핵세포를 함유하는 것이라면 어느 것도 재료로 할 수 있다. 채혈량으로서는 1ml 내지 200ml 정도의 제대혈이 좋다. 채혈한 제대혈에는 응고가 일어나지 않도록 헤파린, EDTA, CPD-A 또는 구연산을 첨가할 수 있다. 채취한 제대혈에서 단핵세포를 분리하고 단핵세포의 생존율을 측정하고, 유세포 분석기를 통해 단핵세포의 표현형을 검사한 후 단핵세포의 동결을 실시한다.
제2단계는 제1단계와 별도로 동결배지를 조성하는 단계로, 보존하는 단핵세포의 농도에 따라서 세포 보존액에 현탁하는 밀도를 적당히 선택할 수 있다. Dextran-40과 HES의 경우는 DMSO와 함께 주로 제대혈 유래 세포의 동결보존에 사용하는 것으로 보통 각각 1~10%와 1~5%의 농도를 많이 사용하고 있으며, PROH와 EG의 경우는 주로 난자나 배아의 동결보존에 사용하는 것으로 두 성분 모두 주로 0.5~2M의 농도를 사용하고 있다. 현재까지 인간 유래 단핵세포의 장기간 동결보존을 위해 상기의 성분들이 함께 배합되어 사용된 적은 없으며, 따라서 본 발명에서 최적의 농도 조합을 통한 조성물을 제공하고자 한다.
제3단계는 상기 2단계에서 조성된 동결배지에 단핵세포를 현탁하여 동결튜브에 넣어 냉동보존하는 단계로, 일반적으로 동결보존하는 밀도인 1×106개/ml 이상의 목적 세포를 동결 보존액에 현탁하여 동결 보존한다. 종래에 알려진 동결배지(10중량% DMSO, 1~2중량% Dextran-40, 1~2중량% HES 및 나머지는 자가혈청으로 조합)를 사용하여 냉동보존하면 해동 후 세포의 생존율과 회수율이 높지 않은 단점을 가지고 있으나, 본 발명에 따를 경우 위와 같은 밀도에서 최적의 상태로 세포를 냉동보존하는 것이 가능해진다. 또한 본 발명에 의한 동결배지 조성물은 제대혈 유래 단핵세포뿐만 아니라 그 세포 조성이 유사한 골수 유래 단핵세포 및 말초혈액 유래 단핵세포를 포함한 인간 유래 단핵세포의 장기간 동결보존에 사용할 수 있다. 동결보존액의 양은 0.1ml~1000ml의 범위로 사용할 수 있다. 제조된 동결 보존액은 제조 후 사용 시까지 냉장고(4℃) 혹은 냉동고(-20℃ 혹은 -70℃)에 보존할 수 있다. 동결 세포가 보존될 동결 튜브는 시판 중인 세포 동결 튜브를 사용하는 것이 바람직하나 동결 백을 사용할 수도 있으며, 그 크기는 적당하게 선택할 수 있다. 동결하는 세포의 수는, 각 동결 튜브당 1×106~1×1010개가 적당하며 동결하는 튜브의 수는 채혈량에 따라 달라지며 1~1000개의 단위 수까지 보존 가능하고, 사용 시에 이것을 해동, 융해하고 복원한다. 한편, 동결의 경우에서는 이소프로판올(iso-propanol) 박스에 동결튜브를 넣은 후 -70℃ 냉동고에서 하룻밤 보존 후 질소탱크에 장기간 보존하거나, 자동동결시스템(controlled rate freezing system)을 사용할 수 있다. 상기 자동동결시스템은 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 상기 자동동결시스템에서 질소탱크로 옮길 때는 cane이나 동결튜브상자를 포함하여 질소탱크에 들어갈 수 있는 어느 물건을 사용해도 무방하다.
상기 제4단계는 상기 냉동보존 단계의 제대혈 단핵세포를 융해, 복원하는 단계를 말하는데 냉동보존된 상기의 단핵세포를 37℃에서 융해 후 배양 배지에 현탁한 후 생존율과 회수율 및 CD3, CD14, CD34 표면항원을 발현하는 세포들의 회수율을 측정하였고, 융해된 상기의 세포를 콜로니 증식 배양하여 이식 효율을 높일 수 있음을 확인하였다. 37℃에서의 융해를 위해 heat block이나 항온조(water bath)를 사용할 수 있다. 상기의 배지는 일반적으로 사용되는 세포배양용 무혈청동물배지를 사용하였다.
상기와 같은 본 발명에 따르면 기존 제대혈 유래 세포 동결의 한계점을 극복하기 위하여, 세포 독성이 큰 DMSO를 동결 배지 내에서 농도를 최소한으로 줄임을 통해, 본 발명에 의해 개발된 동결배지 조성에서 동결 보존된 세포의 안전성과 활성을 높일 수 있다. 이로 인해 활성이 높은 이식용 조혈모세포를 얻을 수 있으며, 또한 이 세포를 이용하여 품질이 우수한 세포치료제를 제공하는 게 가능해진다.
또한 본 발명에 의한 동결배지 조성물은 제대혈 유래 단핵세포뿐만 아니라 같은 혹은 유사한 성질의 세포를 가지고 있는 골수 유래 단핵세포, 말초혈액 유래 단핵세포 등의 인간 혈액 유래 단핵세포의 장기간 동결보존에도 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실험예(실시예)와 함께 상세히 설명한다.
이하의 실시예에서는 본 발명에 따른 동결배지 조성으로 제대혈 세포 및 인간유래 세포의 장기간 동결보존에 사용하기 위한 것으로, 제대혈 유래 단핵세포 및 말초혈액 유래 단핵세포의 동결보존을 위한 동결배지 조성과 장기보관 처리방법을 상세히 설명하였다. 이들 실시 예는 단지 본 발명의 실험 예를 설명한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 제대혈 및 말초혈액으로부터 단핵세포분리
제대혈 혹은 말초혈액 유래 백혈구 농축액(buffy coat)을 생리식염수(또는 PBS)로 희석하여 Histopaque-1077 위에 올린 후, 400g~600g에서 30분간 실온에서 원심분리 하여 제대혈로부터 단핵세포(MNC, mononuclear cell)를 얻었다. 얻어진 단핵세포를 PBS로 2~3회 세척 후, 무동물혈청 배지에 현탁(1× 106/㎖)하여 트립판블루용액을 통해 세포 생존율을 계산한다. 또한 특정 세포의 비율을 측정하기 위하여 제대혈 유래 단핵세포의 경우 CD3, CD14 그리고 CD34 단클론항체들과 반응시키고, 말초혈액 단핵세포의 경우 CD3과 CD14 단클론항체들과 반응시켜 유세포 분석기를 통해 상기의 항원들을 발현하는 세포의 비율을 측정하였다.
실시예 2. 동결배지 조성
상기 실시예 1에서 얻은 제대혈 유래 단핵세포의 최적 냉동보존을 위한 동결배지의 조성물을 위하여 몇 가지 실험군으로 조합하였다. DMSO, Dextran-40, 1,2-propanediol(PROH) 및 ethylene glycol(EG) 및 세포의 안정화를 돕기 위한 단백질 성분을 첨가하기 위하여 인간혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 혹은 자가 혈장(autologous plasma)을 추가로 첨가하여 최종적인 동결성분을 선택하기 위한 실험을 단계적으로 실시하였다. 우선 단핵세포의 회수율이 비교적 높은 샘플 군을 선택하기 위하여 대조군 없이 단핵세포가 1×107/mL의 농도가 되도록 RPMI-1640 배지(GIBCO, USA)와 표 1의 조합으로 조성된 동량의 동결배지에 혼합하였다. 우선 세포에 독성이 상대적으로 큰 DMSO의 농도를 줄이고 세포 독성이 비교적 낮거나 없는 몇 가지 물질들을 선택하여 최적의 세포 동결조건을 도출하고자 하였다. 즉, 아래의 [표 1]에서 보여 주는 동결배지 조성으로 세포를 1차적으로 동결을 실시하였다. [여기서 사용한 RPMI-1640 배지는 무혈청동물배지의 일종으로 인간유래 세포뿐만 아니라 동물세포 배양을 위해 널리 쓰이는 배지이다. 따라서 본 발명에서의 동결배지 조성물 제조를 위해서는 RPMI-1640배지 대신 다른 무혈청동물배지 인 DMEM배지, M-199 배지, alpha-MEM 배지 등을 사용할 수도 있다.]
Figure 112010087651259-pat00008
위의 표 1의 조성 동결배지로 동결 보존된 제대혈 유래 단핵세포를 해동 후 회수율을 측정한 후, 상대적으로 회수율이 높은 샘플군의 조성물을 선택하여 최종적으로 아래의 표 2와 같은 새로운 동결배지 조성물을 제조하였다.
Figure 112010087651259-pat00009
실시예 3. 단핵세포의 냉동보존
상기 1단계에서 얻은 제대혈 유래 단핵세포 혼합액을 원심분리한 후 각각의 상기 인산염 완충용액을 제거하고 단핵세포 침전물을 얻었다. 상기 단핵세포를 상기 2단계에서 조성된 동결배지와 잘 혼합한 후 배양 조건별로 1.8ml의 세포 동결 튜브에 각각 1.0ml씩 분주하였다. 그런 다음, 전술한 바와 같이 동결 튜브를 이소프로판놀 박스에 넣은 후 -70도 냉동고에 하룻밤 동안 냉동한 후 질소탱크로 옮겨서 보관하였다. 또한 제대혈 유래 단핵세포의 냉동보존 결과에 의해 최적의 세포 회수율을 얻은 동결배지 조성물을 이용하여 말초혈액 유래 단핵세포를 상기의 방법으로 냉동보존하였다.
실시예 4. 동결보존 단핵세포의 융해, 복원 및 배양
보관 후, 상기 실시예 3에서 냉동보존해둔 튜브를 꺼내 37℃ 항온조 (water bath)에서 약 1~4분간 해동하고 냉동보존 단핵세포의 융해, 복원을 시행하였다. 원심분리용 튜브 안에 배지 8~11mL와 융해한 냉동보존 단핵세포를 포함한 세포보존액 약 1mL을 넣어 현탁시켰다. 세포보존액을 제거하기 위하여 배양배지를 이용하여 3회 원심세척하고 상기의 배양배지 40mL로 현탁하였다. 상기 세포 현탁액 20μL를 trypan blue 용액 20uL와 혼합한 후 혈구 계산판에 옮긴 후 현미경(올림푸스)하에서 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 측정하였다.
[실험 결과]
1. 최적 세포 동결을 위한 1차 동결 조성물 선택을 위하여 위 표 1과 같은 동결배지 조성물에 세포를 동결한 후 해동하여 측정한 세포 생존율과 회수율은 다음 표 3과 같다. 샘플군 No.1-2, No.1-7 그리고 No.1-8이 생존율이 각각 93%, 87% 그리고 98% 였으며, 해동한 세포를 효율적으로 사용하는데 중요한 세포의 회수율이 각각 43%, 41%, 45%,로 다른 군에 비하여 비교적 높았다. 이들의 샘플군에 사용된 주요 동결 조성물은 DMSO와 EG였다(표 3).
Figure 112008065926156-pat00003
2. 따라서 DMSO의 농도를 최대한 낮추면서 최적의 최종 세포 동결배지 조성물을 제조하기 위하여 비교적 세포독성이 낮은 EG를 선택하였고, 세포 독성이 없는 하이드록시에틸 스타치와 자가 혈장을 추가로 첨가하여 상기 실시예 2에서 표 2와 같은 동결배지 조성물을 제조한 후, 제대혈 유래 단핵세포와 현탁하여 동결하였다.
3. 동결 10일 후, 해동 세포의 생존율과 회수율, 그리고 제대혈 유래 단핵세포 이식시 필수적으로 충분한 양으로 존재해야 하는 조혈모세포(CD34 양성 세포)의 회수율을 보기 위해, CD34 표면항원을 발현하는 세포의 회수율을 분석한 결과는 다음 표 4와 같다. 샘플군 No.2-1과 No.2-2에서 CD34 표면항원을 발현하는 세포가 동결 전의 각각 94%와 99%로 회수되었다. 이는 대조군의 회수율인 85%보다 높은 수치였다.
Figure 112008065926156-pat00004
장기간 동결보존에 따른 동결세포의 안정성을 알아보기 위하여, 상대적으로 높은 회수율을 보인 샘플군 No.2-1과 No.2-2 그리고 No.2-3을 대조군과 함께 56일 동안 보관 후 세포의 생존율과 회수율을 측정하였다. 또한 림프구에서 발현하는 CD3 표면항원과 수지상세포로 분화할 수 있는 단세포에서 발현하는 CD14 그리고 조 혈모세포 표면항원인 CD34를 발현하는 세포들의 회수율도 분석하였다. 측정한 결과는 다음 표 5와 같다. CD3과 CD34 표면항원을 발현하는 세포의 회수율은 76%와 96%로 샘플군 No.2-2가 상대적으로 높았다. CD14 표면항원을 발현하는 세포 회수율만 볼 때 No.2-1이 96%로 제일 높았고, CD34 표면항원을 발현하는 세포의 회수율도 비교적 94%로 높았다. 생존율 또한 NO.2-1이 92%로 제일 높았다.
Figure 112008065926156-pat00005
4. 제대혈 유래 단핵세포를 융해, 복원하여 세포의 회수율을 상기와 같이 분석한 결과 No.2-2를 이용한 세포의 동결보존이 최적 조건임을 알 수 있었다. 따라서 말초혈액 유래 단핵세포의 최적 냉동보존을 위해 기존에 사용하던 동결배지 조성물 (DMSO 10중량%+인간 혈청 알부민 20중량% in RPMI medium) 혹은 상기의 No.2-2와 현탁하여 31일 동안 냉동보존한 후 융해 복원하여 세포의 회수율을 측정하였다. 측정 결과, 향후 활성화 림프구 세포 치료제와 수지상 세포 치료제로 각각 사용될 수 있는 CD3 양성 세포 및 CD14 양성 세포의 회수율이 No.2-2에 현탁하여 동 결보존한 세포가 대조군에 비하여 더욱 높았다(표 6). 특히 CD3 양성 세포의 회수율의 경우 99%로 높았다. 따라서 본 발명에 의한 동결배지 조성물 No.2-2는 제대혈 유래 단핵세포뿐만 아니라 말초혈액 유래 단핵세포의 장기간 동결보존에도 사용할 수 있다.
Figure 112008065926156-pat00006
실시예 5. 냉동보존 제대혈 유래 단핵세포 집락 형성능
동결보존 10일과 56일 후, 샘플군 No.2-2와 대조군의 증식 능력이 있는 세포를 정량적으로 측정할 수 있는 콜로니의 수는 반고형 배지인 MethocultTM배지를 사용하여 CFU-GM(colonyforming units granulocyte/macrophage), BFU-E(burst-forming units erythroid), CFU-GEMM(colony-forming units granulocyte/erythrocyte, macrophage, and megakaryocyte)을 측정하였다. 제대혈 단핵세포를 MethocultTM배지 1 ml 당 10000개의 비율로 35 mm plastic dish(SPL, Korea)에 4배수(n=4)로 접종한 후 습한 조건에서 37℃의 CO2 인큐베이터에서 배양하였으며, 14일 후에 위상차 현미경을 사용하여 형성된 콜로니의 수를 측정하였다. 콜로니를 형성하는 세포의 수가 50개 이상일 때 1개의 콜로니로 개수하였다.
동일한 주입 세포 농도당 콜로니 형성능은 10일째, 동결 전에 비하여 No.2-2와 대조군 모두에서 약 80% 이상의 콜로니 형성능을 보였다. 56일 째, No.2-2는 콜로니 형성능을 10일째와 변함없이 유지하고 있는 반면, 대조군은 콜로니 형성능은 다소 떨어졌다. 즉, 새로운 동결배지에서 동결 보존된 세포의 경우 동결기간에 관계없이 안정적으로 보존되고 있음을 알 수 있다(그래프 1. 10일과 56일 동안 동결보존한 후 해동한 제대혈 유래 단핵세포의 콜로니 형성능을 분석한 결과 참조).
Figure 112008065926156-pat00007
그래프 1.
위에서 본 바와 같이, 사람의 제대혈 단핵세포 및 말초혈액 단핵세포를 본 발명에 따라 동결튜브당 새로운 동결배지 조성과 함께 안정하게 냉동보관 후 융해했을 때, 종전의 동결배지 내 동결에 비하여 탁월한 세포 생존율 및 회수율을 보였 다. 특히 특정 표면항원을 발현하는 세포들 즉, 제대혈 단핵세포의 경우 CD3, CD14, CD34 표면항원 그리고 말초혈액 단핵세포의 경우 CD3, CD14 표면항원을 발현하는 세포들의 회수율이 대조군보다 더욱 높았다. 이를 근거로, 본 발명은 제대혈 유래 단핵세포 및 말초혈액 유래 단핵세포를 동결튜브당 새로운 동결배지 조성 내에서 안정하게 장기간 냉동보관 후 추후 이식치료 혹은 세포치료를 위하여 효율적으로 이용할 수 있다. 또한 본 발명에 의한 동결배지 조성물은 제대혈 유래 단핵세포 및 말초혈액 유래 단핵세포뿐만 아니라 같은 혹은 유사한 성질의 세포를 가지고 있는 골수 유래 단핵세포 등의 인간 혈액유래 단핵세포의 장기간 동결보존에도 사용할 수 있다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 2~5중량%의 DMSO, 0.5~1.5중량%의 하이드록시에틸 스타치, 5~15중량%의 에틸렌 글라이콜(ethlyene glycol), 20~30중량%의 자가 혈장(autologous plasma) 및 나머지의 무동물혈청 배지(serum free media)로 구성되는 것을 특징으로 하는,
    인간 유래 단핵세포의 냉동보존용 배지 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    인간 유래 단핵세포는 인간 제대혈, 골수 및 말초혈액 중의 어느 하나로부터 유래된 것임을 특징으로 하는,
    인간 유래 단핵세포의 냉동보존용 배지 조성물.
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Human Reproduction, 제17권, 제8호, 제2146-2151면 (2002년)

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