CN115135148A - 冷冻保存细胞的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开尤其提供一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：二甲亚砜(DMSO)、双醣、人血清，以及IL‑7和/或IL‑15。本公开尤其还提供一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：介于约1w/v％至10w/v％之间的二甲亚砜(DMSO)、介于约0.25w/v％至5w/v％之间的双醣，和介于约10w/v％至90w/v％之间的人血清。本公开尤其还提供一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：介于约1w/v％至10w/v％之间的二甲亚砜(DMSO)、介于约0.25w/v％至5w/v％之间的双醣，和介于约0.5w/v％至30w/v％之间的人血清白蛋白。

Description

冷冻保存细胞的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月21日提交的美国临时申请序列号第62/964,074号的优先权，其公开内容特此以引用的方式并入。
背景技术
细胞的冷冻长期以来用于在已从供体生物体去除或分离细胞后保存活细胞。然而，活细胞的冷冻保存和恢复仍颇具挑战。这至少是因为使经受冷冻和解冻条件的细胞暴露于严苛条件下，这反过来又导致存活率普遍较低。
冷冻对大多数活细胞具有破坏性。一般来说，当细胞外介质冷冻时，细胞试图跨膜维持渗透平衡，导致细胞内失水，这进一步增加细胞内溶质浓度，直到发生细胞内冷冻。据信细胞内冷冻和溶液效应均为细胞损伤的原因。所述细胞损伤包括(例如)由细胞的渗透性脱水引起的细胞质膜的损伤。
发明内容
发明人已意外发现容许冷冻并后续解冻活细胞的冷冻保存介质。使用本文描述的介质和方法冷冻并解冻细胞保持高存活率，容许所述细胞用于各种应用，包括(例如)过继细胞输入方法。
在一些方面，提供一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：二甲亚砜(DMSO)、双醣、人血清，以及IL-7或IL-15。
在一些方面，提供一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：二甲亚砜(DMSO)、双醣、人血清白蛋白，以及IL-7或IL-15。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括IL-7和IL-15。
在一些方面，提供一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：介于约1w/v％至10w/v％之间的二甲亚砜(DMSO)、介于约0.25w/v％至5w/v％之间的双醣，和介于约10w/v％至90w/v％之间的人血清。
在一些方面，提供一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：介于约1w/v％至10w/v％之间的二甲亚砜(DMSO)、介于约0.25w/v％至5w/v％之间的双醣，和介于约0.5w/v％至30w/v％之间的人血清白蛋白。
在一些实施例中，所述双醣为蔗糖。
在一些实施例中，所述介质进一步包含D-葡萄糖。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括一种或多种细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子选自IL-7和IL-15。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括IL-7和IL-15两者。
在一些实施例中，IL-7以介于约1ng/mL至50ng/mL之间的最终浓度存在。
在一些实施例中，IL-7以约5ng/mL的最终浓度存在。
在一些实施例中，IL-15以介于约1ng/mL至50ng/mL之间的最终浓度存在。
在一些实施例中，所述IL-15以约5ng/mL的最终浓度存在。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质进一步包括哺乳动物细胞培养基。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基以约介于10w/v％至90w/v％之间存在。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基不包含非人动物组分。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质进一步包括一种或多种氨基酸。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质进一步包括一种或多种无机盐。
在一些实施例中，所述pH介于约7至8之间。例如，所述pH为约7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7和7.8。在一些实施例中，所述pH为约7.4。
在一些实施例中，提供一种试剂盒，其包括本文描述的冷冻保存介质。
在一些方面，提供一种冷冻保存哺乳动物细胞的方法，其包括：(a)使所述细胞与本文描述的冷冻保存介质接触；和(b)以约1℃/分钟冷却所述细胞至-80℃或更低的温度。
在一些方面，提供一种冷冻保存并恢复活细胞的方法，其包括：(a)使所述细胞与本文描述的冷冻保存介质接触；(b)以约1℃/分钟冷却所述细胞至-80℃或更低的温度，从而冷冻保存所述细胞；和(c)解冻所述冷冻保存的细胞。
在一些实施例中，所述经解冻的冷冻保存的细胞在后续培养或植入个体内前未清洗。
在一些实施例中，相较于用非本文公开的冷冻保存介质冷冻并解冻的细胞，所述经解冻的冷冻保存的细胞具有增强的细胞存活。例如，相较于用一般购买获得的冷冻保存介质冷冻并解冻的细胞，所述经解冻的冷冻保存的细胞具有增强的细胞存活。
在一些实施例中，所述经解冻的冷冻保存的细胞具有体外增强的细胞存活。
在一些实施例中，所述经解冻的冷冻保存的细胞在植入个体内后具有增强的细胞存活。
在一些实施例中，所述哺乳动物细胞为淋巴细胞或祖细胞。
在一些实施例中，所述哺乳动物细胞为转基因淋巴细胞或祖细胞。
在一些实施例中，所述哺乳动物细胞为诱导性多能细胞(iPSC)衍生的淋巴细胞或祖细胞。
在一些实施例中，所述淋巴细胞为T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施例中，所述祖细胞为iPSC、造血祖细胞(HPC)或胚胎干细胞(ESC)。
在一些实施例中，所述哺乳动物细胞适用于过继细胞疗法。
下列章节中详细描述本发明的各方面。使用章节无意限制本发明。每个章节可适用于本发明的任何方面。在本申请案中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。如本文使用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式”一个(种)”和“所述”包括单数和复数个参考物。
图式简单说明
图1阐述一种实验设计，其包括不同冷冻调配物数量和其组成、其上测试每种调配物的小鼠的数量，以及细胞的iCART细胞活化和转导天数。
图2为由冷冻iPSC衍生的T细胞(“iT细胞”)制备iCART细胞的示意图。
图3A阐述一种实验设计以测试使用冷冻调配物#2、冷冻调配物#6和冷冻调配物#10冷冻保存的iCART细胞的体内功效。所述设计包括调配物组成、其上测试每种调配物的小鼠的数量、向小鼠施用的细胞的剂量，和细胞的活化/收集天数。图3B阐述使用冷冻调配物#2、冷冻调配物#6和冷冻调配物#10冷冻保存的iCART细胞的平均体内功效。图3C阐述使用冷冻调配物#2、冷冻调配物#6或冷冻调配物#10冷冻保存的每只小鼠中iCART细胞的体内功效。iCART细胞的体内功效以总辐射通量表示。
图4阐述一种实验设计以测试冷冻调配物的低水位和高水位清洗对野生型iCART细胞的体内功效的影响。所述设计包括三种不同的调配物、iCART细胞的剂量、其上测试每种调配物的小鼠的数量，以及靶细胞(即，Nalm6细胞)和iCART细胞的施用途径。
图5阐述使用图4中阐述的调配物冷冻保存的iCART细胞的体内功效。在施用iCART细胞后一周，测量以荧光素酶表达表示的iCART细胞的体内功效。
图6阐述使用图4中阐述的调配物冷冻保存的iCART细胞的体内功效。在施用iCART细胞后两周，测量以荧光素酶表达表示的iCART细胞的体内功效。
图7A阐述用于制备冷冻储备的iCART细胞的五种不同的调配物/条件。图7B阐述一种实验设计以测试新鲜iCART细胞相比于冷冻储备的iCART细胞的体内功效。所述设计包括五种不同的调配物、iCART细胞的剂量、冷冻储备液的冷冻储备培养(termculture)和扩增，以及其上测试每种调配物的小鼠的数量。图7C为在图7B阐述的实验设计中，施用靶细胞和效应细胞(新鲜或冷冻储备的iCART细胞)后的时间表的示意图。
图8阐述在施用新鲜或冷冻储备的iCART细胞后六周，iCART细胞的体内功效。iCART细胞的体内功效以小鼠中的荧光素酶表达表示。
图9阐述在施用新鲜或冷冻储备的iCART细胞后六周，iCART细胞的体内功效。iCART细胞的体内功效已以总通量(荧光素酶表达程度的定量表达)表示。
图10阐述有和无细胞因子的十三种不同的冷冻调配物。
图11A和11B阐述一种实验设计以评估使用图10中阐述的调配物冷冻保存的iCART细胞的体内功效。
图12阐述在施用iCART细胞后三周，iCART细胞的体内功效(就荧光素酶表达来说)。
图13阐述在施用iCART细胞后四周，iCART细胞的体内功效(就荧光素酶表达来说)。
图14阐述在施用iCART细胞后四周，iCART细胞的体内功效。iCART细胞的体内功效以总通量表示。
图15阐述在施用iCART细胞后四周，iCART细胞的细胞动力学(就CD45+CD3+细胞来说)。iCART细胞的细胞动力学相对于不同调配物表示。
定义
施用：如本文使用，术语“施用”或“引入”在将受关注的一次冷冻细胞递送到有需要病患的上下文中可互换使用。所属领域中已知各种方法用于向病患载体施用细胞，包括(例如)通过静脉内或手术方法向有需要病患施用细胞。
过继细胞疗法：如本文使用，术语“过继细胞输入”或“ACT”是指将细胞输入有需要病患内。所述细胞可由有需要病患获得并繁殖或可已由非病患供体获得。在一些实施例中，所述细胞为免疫细胞，如淋巴细胞。各种细胞类型可用于ACT，如T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、δ-γT细胞、调节T细胞和外周血单核细胞。此外，已使用本文描述的组合物和/或方法冷冻保存的细胞可进一步转基因并针对ACT应用保留高存活率和适合性。例如，在一些实施例中，可转基因冷冻细胞以引入嵌合抗原受体(CAR)。或者，在一些实施例中，已预先转基因的细胞(例如，CAR-T细胞)可使用本文描述的冷冻保存介质和/或方法冷冻保存并针对ACT应用保留高存活率和适合性。
动物：如本文使用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施例中，所述非人动物为哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可为转基因动物、基因工程化动物和/或克隆。
大约或约：如本文使用，术语“大约”或“约”当应用于受关注的一个或多个值时，是指与规定参考值相似的值。在某些实施例中，除非另有说明或另外由上下文显而易见(除所述数字超过可能值的100％的情况外)，否则术语“大约”或“约”是指以任一方向(大于或小于)落于规定参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的一定范围的值。
冷冻保存：如本文使用，术语“冷冻保存”或“冷冻”一般是指冷冻细胞以维持细胞存活率的方法。冷冻保存的细胞在冷冻状态下维持存活率延长的时间周期，如在冷冻保存的状态下维持存活率1年、5年、10年或更多年。所述冷冻保存的细胞一经解冻即可繁殖用于体外和体内应用。
新鲜细胞：如本文使用，术语“新鲜”或“新鲜细胞”是指从未冷冻的哺乳动物细胞。
功能等同物或衍生物：如本文使用，在氨基酸序列的功能衍生物的上下文中，术语“功能等同物”或“功能衍生物”表示保留与原始序列的生物活性大体上相似的生物活性(功能或结构)的分子。功能衍生物或等同物可为天然衍生物或合成制备。示例性功能衍生物包括具有一种或多种氨基酸的取代、删除或添加的氨基酸序列，条件为蛋白质的生物活性为保守的。理想地，取代氨基酸具有与经取代的氨基酸的化学物理性质相似的化学物理性质。期望的相似化学物理性质包括电荷、膨松度、疏水性、亲水性等的相似性。
体外：如本文使用，术语“体外”是指在人造环境中，例如，在试管或反应容器中、在细胞培养物中等，而非于多细胞生物体内，发生的事件。
体内：如本文使用，术语“体内”是指于多细胞生物体(如人和非人动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，所述术语可用于是指活细胞(相对于，例如，体外系统)内发生的事件。
初生细胞：术语“初生细胞”是指直接从个体分离并后续繁殖的细胞。
多肽：如本文使用的术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的连续的氨基酸链。所述术语用于是指任何长度的氨基酸链，但所属领域的一般技术人员将了解，所述术语不限于长链并且可指包含经由肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如所属领域的技术人员已知，多肽可经处理和/或修饰。
蛋白质：如本文使用的术语“蛋白质”是指充当离散单元的一种或多种多肽。若单个多肽为离散功能单元并且无需永久或暂时物理结合其它多肽以形成离散功能单元，则术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。若所述离散功能单元包含超过一个彼此物理结合的多肽，则术语“蛋白质”是指物理偶联并一起充当离散单元的多个多肽。
个体(subject)：如本文使用，术语“个体”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后形式。在许多实施例中，个体为人类。个体可为病患，是指向医疗提供者呈递以诊断或治疗疾病的人。术语“个体”在本文中可与“个体(individual)”或“病患”互换使用。个体可罹患或易患疾病或疾患但可显示或可不显示所述疾病或疾患的症状。
大体上：如本文使用，术语“大体上”是指显示受关注的特性或性质的全部或接近全部的范围或程度的定性条件。生物领域的一般技术人员将了解生物和化学现象很少(若有)完成和/或继续完成或达成或避免绝对结果。因此，本文中使用术语“大体上”以捕获许多生物和化学现象中固有的完整性的潜在缺乏。
罹患：“罹患”疾病、疾患和/或病症的个体已诊断患有或显示所述疾病、疾患和/或病症的一种或多种症状。
治疗有效量：如本文使用，术语治疗剂的“治疗有效量”意指当向罹患或易患疾病、疾患和/或病症的个体施用时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟所述疾病、疾患和/或病症的一种或多种症状的发作的量。所属领域的一般技术人员应知晓，治疗有效量通常经由包含至少一个单位剂量的给药方案施用。
治疗：如本文使用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防特定疾病、疾患和/或病症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发病率的任何方法。出于降低发展与疾病相关联的病理学的风险的目的，可向未显示疾病的征象和/或仅显示所述疾病的早期征象的个体施用治疗。
本文中由端点详述的数值范围包括归入所述范围内的所有数字和分数(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.9、4和5)。还应了解，假定所有数字和其分数均由术语“约”修饰。
本发明的各方面详细描述于下列章节中。使用章节无意限制本发明。各章节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。如本文使用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式”一个(种)”和“所述”包括单数和复数个参考物。
具体实施方式
用于冷冻保存细胞的组合物
本文提供适用于冷冻保存并后续解冻活哺乳动物细胞的各种冷冻保存介质。
在一些方面，适用于冷冻保存并后续解冻活细胞的冷冻保存介质包含：二甲亚砜(DMSO)、双醣、细胞因子。合适的冷冻保存介质还包含人血清白蛋白或人血清。
冷冻保存介质中可使用的合适细胞因子包括(例如)IL-7和IL-15。因此，在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括IL-7。在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括IL-15。在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括IL-7和IL-15两者。在一些实施例中，向所述冷冻保存介质添加一种或多种另外细胞因子。
冷冻保存介质中可使用各种浓度的细胞因子。例如，在一些实施例中，IL-7以介于约1ng/mL至50ng/mL之间的最终浓度存在于冷冻保存介质中。因此，在一些实施例中，IL-7以介于约1.0w/v％、1.5w/v％、2.0w/v％、2.5w/v％、3.0w/v％、3.5w/v％、4.0w/v％、4.5w/v％、5.0w/v％、5.5w/v％、6.0w/v％、6.5w/v％、7.0w/v％、7.5w/v％、8.0w/v％、8.5w/v％、9.0w/v％、9.5w/v％、10.0w/v％、10.5w/v％、11.0w/v％、11.5w/v％、12.0w/v％、12.5w/v％、13.0w/v％、13.5w/v％、14.0w/v％、14.5w/v％、15.0w/v％、15.5w/v％、16.0w/v％、16.5w/v％、17.0w/v％、17.5w/v％、18.0w/v％、18.5w/v％、19.0w/v％、19.5w/v％、20.0w/v％、20.5w/v％、21.0w/v％、21.5w/v％、22.0w/v％、22.5w/v％、23.0w/v％、23.5w/v％、24.0w/v％、24.5w/v％、25.0w/v％、25.5w/v％、26.0w/v％、26.5w/v％、27.0w/v％、27.5w/v％、28.0w/v％、28.5w/v％、29.0w/v％、29.5w/v％、30.0w/v％、30.5w/v％、31.0w/v％、31.5w/v％、32.0w/v％、32.5w/v％、33.0w/v％、33.5w/v％、34.0w/v％、34.5w/v％、35.0w/v％、35.5w/v％、36.0w/v％、36.5w/v％、37.0w/v％、37.5w/v％、38.0w/v％、38.5w/v％、39.0w/v％、39.5w/v％、40.0w/v％、40.5w/v％、41.0w/v％、41.5w/v％、42.0w/v％、42.5w/v％、43.0w/v％、43.5w/v％、44.0w/v％、44.5w/v％、45.0w/v％、45.5w/v％、46.0w/v％、46.5w/v％、47.0w/v％、47.5w/v％、48.0w/v％、48.5w/v％、49.0w/v％、49.5w/v％、50w/v％的最终浓度存在于冷冻保存介质中。在一些实施例中，IL-7以约5.0w/v％的最终浓度存在于冷冻保存介质中。在一些实施例中，IL-15以介于约1ng/mL至50ng/mL之间的最终浓度存在于冷冻保存介质中。因此，在一些实施例中，IL-15以介于约1.0w/v％、1.5w/v％、2.0w/v％、2.5w/v％、3.0w/v％、3.5w/v％、4.0w/v％、4.5w/v％、5.0w/v％、5.5w/v％、6.0w/v％、6.5w/v％、7.0w/v％、7.5w/v％、8.0w/v％、8.5w/v％、9.0w/v％、9.5w/v％、10w/v％、10.0w/v％、10.5w/v％、11.0w/v％、11.5w/v％、12.0w/v％、12.5w/v％、13.0w/v％、13.5w/v％、14.0w/v％、14.5w/v％、15.0w/v％、15.5w/v％、16.0w/v％、16.5w/v％、17.0w/v％、17.5w/v％、18.0w/v％、18.5w/v％、19.0w/v％、19.5w/v％、20.0w/v％、20.5w/v％、21.0w/v％、21.5w/v％、22.0w/v％、22.5w/v％、23.0w/v％、23.5w/v％、24.0w/v％、24.5w/v％、25.0w/v％、25.5w/v％、26.0w/v％、26.5w/v％、27.0w/v％、27.5w/v％、28.0w/v％、28.5w/v％、29.0w/v％、29.5w/v％、30.0w/v％、30.5w/v％、31.0w/v％、31.5w/v％、32.0w/v％、32.5w/v％、33.0w/v％、33.5w/v％、34.0w/v％、34.5w/v％、35.0w/v％、35.5w/v％、36.0w/v％、36.5w/v％、37.0w/v％、37.5w/v％、38.0w/v％、38.5w/v％、39.0w/v％、39.5w/v％、40.0w/v％、40.5w/v％、41.0w/v％、41.5w/v％、42.0w/v％、42.5w/v％、43.0w/v％、43.5w/v％、44.0w/v％、44.5w/v％、45.0w/v％、45.5w/v％、46.0w/v％、46.5w/v％、47.0w/v％、47.5w/v％、48.0w/v％、48.5w/v％、49.0w/v％、49.5w/v％、50w/v％的最终浓度存在于冷冻保存介质中。在一些实施例中，IL-15以约5.0w/v％的最终浓度存在于冷冻保存介质中。在一些实施例中，IL-7和IL-15两者均存在于冷冻保存介质中。在一些实施例中，IL-7和IL-15各以约5.0w/v％的最终浓度存在于冷冻保存介质中。在一些实施例中，IL-7和IL-15各以约2.25w/v％的最终浓度存在于冷冻保存介质中。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质包含人血清。在一些实施例中，所述冷冻保存介质包含人血清白蛋白。在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括人血清和人血清白蛋白两者。
冷冻保存介质中可使用各种浓度的人血清。在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括介于约10w/v％至90w/v％之间的人血清。因此，在一些实施例中，所述冷冻保存介质含有约10w/v％、15w/v％、20w/v％、25w/v％、30w/v％、35w/v％、40w/v％、45w/v％、50w/v％、55w/v％、60w/v％、65w/v％、70w/v％、75w/v％、80w/v％、85w/v％或90w/v％人血清。
冷冻保存介质中可使用各种浓度的人血清白蛋白。在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括介于约0.5w/v％至30w/v％之间的人血清白蛋白。因此，在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括介于约0.5w/v％、1.0w/v％、1.5w/v％、2.0w/v％、2.5w/v％、3.0w/v％、3.5w/v％、4.0w/v％、4.5w/v％、5.0w/v％、6.0w/v％、6.5w/v％、7.0w/v％、7.5w/v％、8.0w/v％、8.5w/v％、9.0w/v％、10.0w/v％、10.5w/v％、11.0w/v％、11.5w/v％、12.0w/v％、12.5w/v％、13.0w/v％、13.5w/v％、14.0w/v％、14.5w/v％、15.0w/v％、15.5w/v％、16.0w/v％、16.5w/v％、17.0w/v％、17.5w/v％、18.0w/v％、18.5w/v％、19.0w/v％、19.5w/v％、20.0w/v％、20.5w/v％、21.0w/v％、21.5w/v％、22.0w/v％、22.5w/v％、23.0w/v％、23.5w/v％、24.0w/v％、24.5w/v％、25.0w/v％、25.5w/v％、26.0w/v％、26.5w/v％、27.0w/v％、27.5w/v％、28.0w/v％、28.5w/v％、29.0w/v％、29.5w/v％或30.0w/v％人血清白蛋白。
冷冻保存介质中可使用各种浓度的DMSO。在一些实施例中，所述介质包括介于约1至10w/v％之间的DMSO。因此，在一些实施例中，所述介质包括约1.0w/v％、1.5w/v％、2.0w/v％、2.5w/v％、3.0w/v％、3.5w/v％、4.0w/v％、4.5w/v％、5.0w/v％、5.5w/v％、6.0w/v％、6.5w/v％、7.0w/v％、7.5w/v％、8.0w/v％、8.5w/v％、9.0w/v％、9.5w/v％或10w/v％DMSO。在一些实施例中，所述冷冻保存介质包含约5.0w/v％DMSO。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括至少一种双醣。例如，在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括蔗糖、乳糖或麦芽糖中的至少一者。在一些实施例中，所述冷冻保存介质包含蔗糖。
冷冻保存介质中可使用各种浓度的双醣。例如，在一些实施例中，所述冷冻保存介质以介于约0.25w/v％、0.5w/v％、0.75w/v％、1.0w/v％、1.25w/v％、1.5w/v％、1.75w/v％、2.0w/v％、2.25w/v％、2.5w/v％、2.75w/v％、3.0w/v％、3.25w/v％、3.5w/v％、3.75w/v％、4.0w/v％、4.25w/v％、4.5w/v％、4.75w/v％、5.0w/v％、5.5w/v％、6.0w/v％、6.5w/v％、7.0w/v％、7.5w/v％、8.0w/v％、8.5w/v％、9.0w/v％、9.5w/v％或10w/v％之间的浓度包括双醣。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质包括D-葡萄糖。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质进一步包含哺乳动物细胞培养基。所属领域中已知各种哺乳动物细胞培养基。一般来说，典型细胞培养基包括各种氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐和血清作为生长因子、激素和贴附因子(attachment factor)的来源。所述细胞培养基还有助于调节pH和渗透压。本文描述的冷冻保存介质中可使用任何合适的哺乳动物细胞培养基。已知哺乳动物细胞培养基的实例包括(例如)伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)、杜尔贝科改良的伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)、最小基本培养基(MEM)、杜尔贝科改良的伊格尔培养基/营养素混合物F-12(DMEM/F-12)。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基为IMDM。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基不包含非人动物组分。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基包含下列氨基酸中的一或多者：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺(游离碱)、L-天冬氨酸、L-胱氨酸2HCl、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐、L-缬氨酸。
在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基包含下列维生素中的一或多者：生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、i-肌醇。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基包含下列无机盐中的一或多者：氯化钙(CaCl2)(无水)、硫酸镁(MgSO4)(无水)、氯化钾(KCl)、硝酸钾(KNO3)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)、亚硒酸钠(Na2SeO3-5H20)。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基包含下列中的一或多者：D-葡萄糖(右旋糖)、HEPES、酚红、丙酮酸钠。在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基包含：甘氨酸30.0mg/L、L-丙氨酸25.0mg/L、L-精氨酸盐酸盐84.0mg/L、L-天冬酰胺(游离碱)25.0mg/L、L-天冬氨酸30.0mg/L、L-胱氨酸2HCl 91.4mg/L、L-谷氨酸75.0mg/L、L-谷氨酰胺584.0mg/L、L-组氨酸盐酸盐-H2O 42.0mg/L、L-异亮氨酸105.0mg/L、L-亮氨酸105.0mg/L、L-赖氨酸盐酸盐146.0mg/L、L-甲硫氨酸30.0mg/L、L-苯丙氨酸66.0mg/L、L-脯氨酸40.0mg/L、L-丝氨酸42.0mg/L、L-苏氨酸95.0mg/L、L-色氨酸16.0mg/L、L-酪氨酸二钠盐104.0mg/L、L-缬氨酸94.0mg/L、生物素0.013mg/L、氯化胆碱4.0mg/L、D-泛酸钙4.0mg/L、叶酸4.0mg/L、烟酰胺4.0mg/L、盐酸吡哆醛4.0mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺素4.0mg/L、维生素B12 0.013mg/L、i-肌醇7.2mg/L、氯化钙(CaCl2)(无水)165.0mg/L、硫酸镁(MgSO4)(无水)97.67mg/L、氯化钾(KCl)330.0mg/L、硝酸钾(KNO3)0.076mg/L、碳酸氢钠(NaHCO3)3024.0mg/L、氯化钠(NaCl)4505.0mg/L、磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O)125.0mg/L、亚硒酸钠(Na2SeO3-5H20)0.017mg/L、D-葡萄糖(右旋糖)4500.0mg/L、HEPES 5958.0mg/L、酚红15.0mg/L、丙酮酸钠110.0mg/L。
冷冻保存介质中可存在各种浓度的哺乳动物细胞培养基并且包括(例如)介于约10w/v％至90w/v％之间的浓度。因此，在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养基以约10w/v％、15w/v％、20w/v％、25w/v％、30w/v％、35w/v％、40w/v％、45w/v％、50w/v％、55w/v％、60w/v％、65w/v％、70w/v％、75w/v％、80w/v％、8w/v％5或90w/v％存在于冷冻保存介质中。
在一些实施例中，所述冷冻保存介质具有介于约7.3至7.5之间的pH。因此，在一些实施例中，所述冷冻保存介质具有约7.3、7.35、7.4、7.45或7.5的pH。在一些实施例中，所述冷冻保存介质具有约7.5的pH。
冷冻保存细胞的方法
可冷冻保存的细胞一般包括任何哺乳动物细胞。在一些实施例中，可冷冻保存的细胞包括干细胞、其它祖细胞、红细胞和白细胞、精细胞、卵母细胞、卵细胞，以及源于组织和器官的细胞材料。合适的细胞的其它实例包括(例如)胰岛细胞、软骨细胞、神经源细胞、肝源细胞、眼源细胞、骨源细胞、来自结缔组织的细胞、生殖源细胞和心源细胞。在一些其它实施例中，细胞包括红细胞、中性粒细胞、嗜酸性和嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和血小板细胞。在一些实施例中，淋巴细胞包括B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、非B-淋巴细胞、非T-淋巴细胞、诱导性多能细胞衍生的淋巴细胞和转基因淋巴细胞。所述淋巴细胞进一步包括T细胞或自然杀伤(NK)细胞。所述祖细胞包括胚胎干细胞(ESC)、造血祖细胞(HPC)或诱导性多能细胞(iPSC)。
在一些实施例中，细胞的冷冻保存包括以下步骤：(i)将靶细胞引入稀释的冷冻保存溶液(冷冻调配物或冷冻保存介质)内，(ii)冷冻或冷冻保存受保护的靶细胞，(iii)将冷冻溶液解冻到环境条件，和(iv)将解冻的靶细胞引入需所述靶细胞的个体内。
在一些实施例中，在使用前将冷冻保存溶液维持在室温下并将掺杂的靶细胞维持在室温下长达三十分钟，然后开始冷冻而细胞存活率无明显损失。在一些其它实施例中，将冷冻保存溶液冷却到约4℃，然后添加靶细胞，以加快冷冻过程，并要求在将所述冷冻保存溶液添加到细胞后立即开始冷冻过程，以最小化由溶液的存在诱导的细胞死亡。
在一些实施例中，添加到靶细胞的稀释的冷冻保存溶液的体积取决于含有靶细胞的溶液与冷冻保存溶液的体积比和靶细胞与冷冻保存溶液的比率。在一些实施例中，含有靶细胞的溶液与冷冻保存溶液的体积比应一般介于约1:1至1:10之间，并且靶细胞与冷冻保存溶液的比率介于约l×l05个细胞/ml至约l×l09个细胞/ml之间。在一些实施例中，靶细胞与冷冻保存溶液的比率包括介于约1×l08个细胞/ml至3×l08个细胞/ml之间。大于那些上文列举者的比率可导致活细胞的浓度由于不足的冷冻保存溶液而降低，而小于那些上文列举者的比率仅可导致低效使用冷冻保存溶液并且需将过量冷冻保存溶液引入个体内以引入有效量的靶细胞。靶细胞通常可仅以稀释形式作为生物流体中的成分保存(例如，从外周血浓缩的干细胞通常以约l×l06个细胞/ml至约3×l08个细胞/ml的浓度含有干细胞，并且其余部分包含其它血液组分(如血浆和血小板))。这些生物稀释样本可一般以约2:1至1:4的体积比(当然取决于许多因素，包括稀释的冷冻保存溶液的特定调配物、生物稀释样本中靶细胞的浓度、靶细胞的类型等)与冷冻保存溶液组合以达成靶细胞与冷冻保存溶液的最佳比率。在一些实施例中，含有最终靶细胞的溶液一般含有约4至12重量％甘油和约2至10重量％白蛋白，并且针对某些应用，审慎考虑这个一般范围外的变化。
在一些实施例中，将靶细胞悬浮于冷冻保存溶液中以制备细胞悬浮液，将因此制备的悬浮液分配到冷冻管内，并将所得冷冻管直接放置于-80℃的超低温冰冻器中以冷冻细胞。在一些其它实施例中，可将所述冷冻管放置于编程冰冻器中以缓慢冷冻细胞。冷冻细胞的保存可通过将细胞维持在用于冷冻的温度(例如，-80℃)下进行。为最佳冷冻，以使细胞存活率一经解冻即达成高于80至90％，可使用缓慢冷冻方法。存在多种形式的计算机化冷冻室，其可将温度一次降低一定程度直到温度达成-80℃；所述冷冻室通常包括计算机化策略，使细胞在冰开始形成的温度下停留稍微较长的时间以最小化冰晶对细胞的损害。在一些实施例中，缓慢可程序冷冻包括以每分钟约1℃的速率降低初始温度直到达成最终温度。因此，在一些实施例中，缓慢冷冻以每分钟约0.25℃、0.5℃、0.75℃、1.0℃、1.25℃、1.5℃、1.75℃、2.0℃、2.25℃、2.5℃、2.75℃或3℃的速率发生。在一些实施例中，缓慢冷冻包括：(a)使用固体二氧化碳将细胞从初始温度冷却到约-80℃的最终温度，或(b)使用液氮将细胞从初始温度冷却到约-196℃的最终温度。
在一些实施例中，使用本文描述的介质和/或方法解冻的细胞具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上的存活率。
通常，可控缓慢冷却速率可有效达成最佳细胞存活率。一般据信不同的细胞类型具有不同的最佳冷却速率(参见，例如Rowe,A.W.和Rinfret,A.P.,1962,《血液(Blood)》20:636；Ro We,A.W.,1966,《低温生物学(Cryo Biology)》3(1):12-18；Lewis,J.P.等人，1967,《输注(transfusion)》7(1):17-32；和Mazur,P.,1970《科学(Science)》168:939-949关于冷却速度对骨髓干细胞的生存和对其移植潜力的影响)。
在一些实施例中，容纳细胞的容器在冷冻温度下稳定并且容许快速热传以有效控制冷冻和解冻。密封塑料小瓶(例如，Nunc和Wheaton cryules)或玻璃安瓿可用于多个小量(1至2ml)，而100至200ml的较大体积可冷冻于放置在金属板之间的聚烯烃袋(如由Fenwal购得的聚烯烃袋)中。
在一些实施例中，然后将冷冻细胞转移到长期冷冻储备容器。在一些实施例中，将样本冷冻储备于液氮(-196℃)或液氮蒸气(-105℃)中。高效液氮冷冻器的可用性极大促进这种储备。
当需细胞时，冷冻细胞和组合物经受解冻过程，然后可恢复所述细胞。此外，用于解冻细胞的方法也没有特别限制；例如，所述细胞可通过将冷冻保存的冷冻管放置于37℃的水浴中解冻。合适的解冻的其它非限制性实例包括：(i)解冻冷冻保存的细胞；(ii)添加第一缓冲溶液；(iii)从冷冻保存介质和第一缓冲溶液分离细胞；和(iv)将所述细胞重悬浮于第二缓冲溶液中。在一些实施例中，在用于体外或体内应用前，解冻的细胞未清洗或冲洗冷冻溶液。
在一些实施例中，所述第一和/或第二缓冲溶液包含血清或血清替代培养基。在一些实施例中，所述血清为人血清或非人动物衍生的血清，如胎牛血清(FBS)。在一些实施例中，所述血清替代培养基为GIBCO剔除血清替代培养基和久保田(Kubota)培养基中的一或多者，任选地用白蛋白补充，所述白蛋白进一步任选地为人血清衍生的白蛋白。在一些实施例中，所述血清以介于约2％至20％之间，任选地介于约10％至20％之间，约10％，或约20％的浓度。应知晓，这一“高血清”解冻方法可有利于最小化冰晶形成，其中使用非等渗缓冲液，因为这一方法中需高脂质含量。在一些实施例中，所述血清以介于约2％至5％之间的浓度。应知晓，可使用这一“低血清”解冻方法，其中使用等渗缓冲液，因为无需高脂质含量。在一些实施例中，所述血清替代培养基包含浓度介于约1％至5％之间的白蛋白。
在一些实施例中，所述第一和/或第二缓冲溶液包含解冻缓冲液。应知晓，一些可购买获得的解冻缓冲液包含血清或血清替代物。还应知晓，一些实施例可包括通过除那些本文上文规定者外的方式解冻。
应进一步知晓，存在多种方法以从上清液(例如培养基、缓冲溶液和/或冷冻保存溶液)分离细胞。非限制性实例包括离心细胞；通过筛或过滤器过滤细胞；和法压式过滤。
在一项实施例中，冷冻保存的细胞首先用1×冷介质清洗，接着用冷DPBS清洗一次，并且然后将所述细胞重悬浮于冷DPBS中，接着将细胞注射到个体内。低剂量(已清洗)意指每剂量1.5E7 CAR阳性细胞，并且高剂量(已清洗)意指每剂量4.0E7 CAR阳性细胞。
在一些实施例中，由于冷冻保存溶液的生理相容性，因此可将解冻的靶细胞引入个体内而不分离靶细胞和冷冻保存溶液。因此，在一些实施例中，解冻的细胞在使用前未清洗。将解冻的靶细胞和伴随的冷冻保存溶液优选在引入个体内前升温到体温(即，约37℃)。在这一情况下，细胞的剂量基于冷冻前细胞计数。
在一些实施例中，解冻的靶细胞在室温下维持数小时而细胞存活率无明显损失。在一些实施例中，解冻的溶液用生理盐水或其它适当的离子溶液缓慢稀释以便于将溶液的渗透压从500至2,000mOsm/kg的所需冷冻保存范围降低到260至320mOsm/kg的生理范围以便于减小由渗透压突然变化引起的对细胞壁的冲击。
在一些实施例中，进一步培养解冻的细胞。在一些实施例中，培养涉及将细胞放置于培养器中；去除缓冲溶液；并用针对细胞的生长和/或分化设计的培养基替代缓冲溶液。在一些实施例中，在培养器中将细胞培养介于约6至7小时之间。在一些实施例中，针对细胞的生长和/或分化设计的培养基包含久保田培养基和/或用于细胞的分化的激素定义的培养基(HDM)。
解冻的细胞的存活率可体外和体内评定。在一些实施例中，体外细胞存活率测试包括台盼蓝(Trypan Blue)排除分析。在一些实施例中，可使用其它分析方法以通过使用RT-qPCR等评定已用不同冷冻保存溶液冷冻的解冻细胞的细胞存活率(例如，基因表达)。所属领域的一般技术人员可选择任何分析方法以评定解冻的细胞的存活率，所述存活率可适用于评定原本新鲜细胞的细胞存活率。
体内细胞存活率一般可通过评估体内施用细胞的功能特性评定。在一些实施例中，体内细胞存活率可通过评估已引入有需要个体内的细胞的细胞数量评定。所属领域中已知用于追踪细胞并测定施用细胞的存活率的各种方法。
试剂盒
本发明提供本文描述的组合物中的任一者于试剂盒中，任选地包括使用所述组合物(例如，用于保存淋巴细胞或祖细胞和/或其它细胞)的说明书。即，所述试剂盒可包括在本文描述的任何方法中使用组合物的说明书。如本文使用，“试剂盒”通常定义包括本发明的组分中的一或多者，和/或与本发明相关联的(例如，如先前描述的)其它组分的包装、总成或容器(如隔热容器)。在一些实施例中，所述试剂盒的组分中的每一种呈液体形式(例如，呈溶液形式)，或呈固体形式(例如，干燥粉末、冷冻物等)提供。
在一些实施例中，所述试剂盒包括一种或多种组分，所述组分可于相同容器内或于两个或更多个容器内，和/或以其任何组合。所述容器可含有液体，并且非限制性实例包括瓶子、小瓶、广口瓶、管、烧瓶、烧杯等。在一些实施例中，所述容器为防溢的(当关闭时，无论容器处于任何方向，液体均无法离开所述容器)。
在一些实施例中，试剂盒包含分开包装或包装在一起的冷冻保存介质的组分。在一些实施例中，所述试剂盒在室温下(约25℃)运输，冷冻(例如，在约4℃下)，和/或所述组分中的任何一或多者被冷冻(例如，介于-20℃至-80℃之间，在约-150℃下等)或在液氮(约-196℃)中运输。在一些情况下，所述组分中的一或多者被冷冻和/或在干冰(约-80℃)上运输。
关于冷冻保存溶液，若存在多于一种组分(例如，如上文描述)，则在一些实施例中，将所述组分一起冷冻在一种共同液体中(例如，于一个共同容器内)，或冷冻成两种或更多种不同液体(例如，于不同容器内)。
在一些实施例中，所述组分中的一些为可加工的(例如，加工成活性形式)，例如，通过添加可与或可不与试剂盒一起提供的合适的溶剂或其它物质。例如，可加热所述组分或可向所述组分添加液体(例如，若所述组分被冷冻、冻干、以浓缩形式运输等)。
在一些情况下，所述试剂盒将包括冷冻容器，其为适用于在冷冻温度下容纳材料(例如，液氮)的容器。所属领域的一般技术人员应知晓，合适的冷冻容器，例如，杜瓦(Dewar)烧瓶(例如，由不锈钢和/或铝等制成)、气态运输罐、不锈钢容器、保丽龙(Styrofoam)容器等。通常，冷冻温度包括低于约-150℃、低于约-170℃，或低于约-190℃的温度。例如，液氮具有约-196℃的沸点。
在一些实施例中，所述试剂盒含有用于容纳细胞的容器。例如，所述容器可经构造使得其可抵挡冷冻温度而不破裂或断裂。在一些实施例中，将所述容器放置于冷冻容器内(例如，使用浮子(例如，可漂浮于冷冻容器内的液氮或其它冷冻液体上的浮子))。用于细胞的容器的非限制性实例包括细胞吸管、玻璃安瓿、冷冻管、冷冻小瓶等。在某些情况下，所述容器可预先贴上标签。
与本发明相关联的其它组合物或组分的实例包括(但不限于)稀释剂、盐、缓冲液、螫合剂、防腐剂、干燥剂、抗菌剂、针、注射器、包装材料、管、瓶子、烧瓶、烧杯等，例如，用于使用、修饰、组装、储备、包装、制备、混合、稀释和/或保存特定用途的组分。在使用所述组分中任一者的液体形式的实施例中，所述液体形式被浓缩或随时可用。
本发明的试剂盒一般包括以针对结合本发明的组分和/或方法使用所述试剂盒提供的任何形式的说明书或网站或其它来源的说明书。例如，所述说明书可包括用于使用、修饰、混合、稀释、保存、组装、储备、包装和/或制备组分和/或与所述试剂盒相关联的其它组分的说明书。在一些情况下，所述说明书还包括用于递送组分(例如，用于在室温、零下温度、冷冻温度等下运输)的说明书。所述说明书以对所述试剂盒的用户有用的任何形式提供，如以任何方式提供，书面或口头(例如，电话)、数字、光学、视觉(例如，录像带、DVD等)和/或电子通信(包括互联网或基于网络的通信)。
冷冻保存的细胞的用途
使用本文描述的冷冻保存介质冷冻保存和解冻的细胞容许出于初生细胞或新鲜细胞分离物可具有的任何目的使用所述细胞。冷冻保存和解冻的细胞保留其天然状态的高存活率(例如，大于70％、75％、80％、85％或90％)并保留生理特性，其容许所述细胞用于各种应用，如用于细胞的遗传操作，和用于细胞疗法目的，举例来说，用于过继细胞疗法应用中。
各种基因修饰和相关用途可用如本文描述冷冻保存的细胞成功进行。作为一项实例，从iPS来源直接分离或制备的T细胞(即，iT细胞)可如本文描述冷冻保存。这些细胞可接着以所需方式(例如通过引入所需嵌合抗原受体(CAR))解冻和转基因。这些经转基因以表达CAR的iT细胞(即，iCART细胞)可接着冷冻保存或通过过继细胞疗法引入有需要病患内。所述细胞保留高存活率并可于受体个体内增殖。
实例
本发明的其它特征、目标和优势在以下实例中显而易见。然而，应了解实例(尽管指示本发明的实施例)仅以阐述而非限制的方式给定。本发明范围内的各种变化和修饰对于所属领域的技术人员来说由所述实例将变得显而易见。
实例1：制备冷冻调配物以冷冻保存细胞
本实例阐述经制备以冷冻保存iCART细胞的不同冷冻调配物。
在本实例中，制备十一种不同的冷冻调配物。所述冷冻调配物为冷冻调配物#1、冷冻调配物#2、冷冻调配物#3、冷冻调配物#4、冷冻调配物#5、冷冻调配物#6、冷冻调配物#7、冷冻调配物#8、冷冻调配物#9、冷冻调配物#10和冷冻调配物#11。所有这些冷冻调配物的组成均显示于图1中。这些冷冻调配物的功效通过冷冻保存野生型iCART细胞，并且然后评估其在NOD/Shi-scid，IL-2Rγ基因剔除小鼠(“NSG小鼠”)中的体内功效来测试。T细胞活化为抗原依赖性过程，其导致初始T细胞增殖并分化为效应细胞。初生CART细胞和新鲜CART细胞用作阳性对照。详细程序提供于下文实例3中。
实例2：iCART细胞的制备
本实例阐述在评估iCART细胞的体内功效前制备所述iCART细胞。图2为由冷冻iT细胞制备iCART细胞的示意图。
iCART细胞源于iT细胞。将冷冻iT细胞解冻(第1天)，并容许在接下来三天内恢复。在第4天，容许iT细胞经受第一活化步骤(活化-1)。这通过以如根据已知方法(例如，WO2017/221975中描述的方法)进行的活化培养所述iT细胞来进行。
在第7天，细胞经受第一转导步骤(转导×1)，这通过在涂布重组人纤维连接蛋白(retronectin)的板上用反转录病毒载体旋转接种所述iT细胞进行。在第8天，所述细胞经受第二转导步骤(转导×2)。这通过在涂布重组人纤维连接蛋白的板上用反转录病毒载体旋转接种转导×1中获得的细胞进行。在第16天，这些细胞经受第二活化(活化-2)。这通过在涂布CD3的烧瓶中用活化培养基(其含有IMDM(Thermo Fisher)、15％FBS、1×PSG)、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、抗坏血酸2-磷酸盐、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、TL-1A、泛胱天蛋白酶FMK抑制剂Z-VAD和CD30激动抗体)将转导×2中获得的细胞培养3天进行。活化三天后，将细胞扩增12天(扩增1)，同时经受活化和转导过程。第二活化后，将细胞再扩增8天(扩增2)。在第24天，使用不同冷冻调配物冷冻保存扩增2中获得的细胞(即，iCART细胞)。在第28天，如此制备的iCART细胞已准备好注射到NSG小鼠内。
实例3：使用不同冷冻调配物保存的野生型iCART细胞的体内功效的比较
本实例比较使用三种不同的冷冻调配物(冷冻调配物#2、冷冻调配物#6和冷冻调配物#10)冷冻保存的野生型iCART细胞的体内功效。包括这三种冷冻调配物和剂量的不同治疗组显示于图3A中。
在NSG小鼠中测试野生型iCART细胞的体内功效。所述NSG小鼠移植表达荧光素酶的Nalm6细胞(ATCC；癌细胞)。所述NSG小鼠，雄性，4至5周龄源于Jackson实验室。移植Nalm6细胞后四天，经由尾静脉向移植Nalm6的NSG小鼠施用使用不同冷冻调配物冷冻保存的iCART细胞。在向小鼠施用iCART细胞或初生CART细胞或新鲜细胞后，经由尾静脉向所述小鼠施用荧光素。在Nalm6接种后60天内，使用IVIS成像系统(PerkinElmer)根据总辐射通量测量荧光素酶活性。此处描述的相同程序也将适用于讨论细胞的体内功效的其它实例。
这些实验指示，冷冻调配物#6具有最显著的FLUX降低，指示减少测试动物中Nalm6细胞的量的体内功效(图3B和3C)。
实例4：清洗冷冻调配物对野生型iCART细胞的体内功效的影响
本实例阐述在向小鼠施用iCART细胞前，在制备使用不同冷冻调配物冷冻保存的iCART细胞中包括清洗步骤的效应。在本实例中，测试如表1中提供的下列三种调配物。
表1
Figure BDA0003802751900000181
清洗步骤包括用1×冷培养基清洗冷冻保存的iCART细胞，用冷DPBS清洗一次，并将所述细胞重悬浮于冷DPBS中，接着将其注射到小鼠内。低水位和高水位清洗完全按照您于此处提及的进行：用1×冷介质清洗，用冷DPBS清洗一次，并将所述细胞重悬浮于冷DPBS中，接着将其注射到小鼠内。针对低剂量和高剂量，将最终CAR+细胞浓度分别重悬到1.5E7/200μL和4.0E7/200μLDPBS。细胞的剂量基于解冻后细胞数量计数。在未清洗情况下，冷冻保存的细胞在注射到小鼠内前未清洗。将所述细胞解冻并在解冻后连同所述冷冻调配物一起立即注射。在未清洗情况下，细胞的剂量基于冷冻前细胞计数。
为测试清洗步骤对iCART细胞的体内功效的影响，采用如图4中阐述的实验设计。iCART细胞的体内功效通过在两周内使用IVIS成像系统(PerkinElmer)测量荧光素酶活性评定。
图5阐述在施用iCART细胞后一周，iCART细胞的体内功效。仅接受PBS缓冲液而无iCART细胞的小鼠显示非常高的荧光素酶表达。接受初生CART细胞的小鼠不显示荧光素酶表达的任何征象。经不同调配物处理的小鼠显示可忽略的荧光素酶表达的征象，所述征象证实使用不同冷冻调配物冷冻保存的iCART细胞的体内功效。一只接受清洗调配物2/低水位清洗并在图中由矩形框标识的小鼠受注射相关问题影响。
图6阐述在施用iCART细胞后两周，iCART细胞的体内功效。相较于第1周，仅接受PBS缓冲液而无iCART细胞的小鼠显示甚至更强烈的荧光素酶表达。接受初生CART细胞的小鼠仍不显示荧光素酶表达的任何征象。一般来说，经不同调配物处理的小鼠未显示荧光素酶表达的征象，甚至显示的征象可忽略不计，所述征象证实使用不同冷冻调配物冷冻保存的iCART细胞的体内功效。然而，不同于经其它调配物处理的小鼠，经调配物2/低水位清洗和调配物3/低水位清洗处理的小鼠显示一些荧光素酶表达，其指示高水位清洗或无清洗步骤更好地保存iCART细胞。
实例5：新鲜iCART细胞相比于冷冻储备的iCART细胞的体内功效
本实例比较新鲜iCART细胞相比于冷冻储备的iCART细胞的体内功效。在本实例中，测试如图7A中提供的五种不同调配物。在条件#1、2和4中，IL-7和IL-15作为细胞因子添加。
在调配前扩增iCART细胞。为进行iCART细胞的扩增培养，将细胞以2,000,000个细胞的形式悬浮于含有15％FBS和表2中显示的细胞因子的15mL IMDM培养基中，并接种于T25烧瓶上，于其中固定化抗CD3抗体(OKT3)和重组人纤维连接蛋白(Takara Bio)。在5％CO2/37℃下进行细胞培养。3天后，收集细胞，并使用NucleoCounter NC-200(ChemoMetec)计数细胞数量。以适当量将所述细胞悬浮于含有15％FBS和表3中显示的细胞因子的IMDM培养基(Thermo Fisher)中，然后添加到非固化G-REX 6M板(WILSONWOLF)上并在5％CO2/37℃下培养四天。
表2
项目 供应商 最终浓度
胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂 Invitrogen 1×
抗坏血酸2-磷酸盐 Sigma 50μg/mL
IL-7 Peprotech 10ng/mL
IL-12 Merck 50ng/mL
IL-15 Peprotech 10ng/mL
IL-18 MBL 50ng/mL
IL-21 Peprotech 20ng/mL
TL-1A Peprotech 50ng/mL
z-VAD-FMK R&D 10μM
抗CD30抗体 R&D 300ng/mL
表3
项目 供应商 最终浓度
胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂 Invitrogen 1×
抗坏血酸2-磷酸盐 Sigma 50μg/mL
IL-7 Peprotech 10ng/mL
IL-15 Peprotech 10ng/mL
在iCART细胞扩增步骤后，由G-REX获得细胞，然后用清洗缓冲液(5％HSA于Isolyte S中)使用Sefia S-2000细胞处理仪器清洗并将所述细胞浓缩到大约50mL的最终体积，以制备调配物和冷冻储备液。所述冷冻储备液通过使用CryoMEDTM冷冻保存细胞并储备于-150℃冷冻器中制备。
为比较新鲜iCART细胞和冷冻储备的iCART细胞的体内功效，使用如图7B中阐述的实验设计。冷冻保存后17天，图7B中Gr-10和11的冷冻储备的iCART细胞由ThawSTAR解冻并用冷IMDM清洗两次并以1.0E+07 CART细胞/剂量的浓度重悬浮于D-PBS中。冷冻保存后7至14天，Gr-2-9的冷冻保存的细胞由ThawSTAR解冻并用IMDM清洗，然后经培养或扩增，然后清洗并以1.0E+07 CART细胞/剂量的浓度重悬浮于D-PBS中(如图7B中描述)。如图7C中阐述，在NSG小鼠中，在接种靶细胞(即，Nalm6细胞)后四天，施用新鲜iCART细胞或冷冻储备的iCART细胞。经由尾静脉施用iCART细胞的悬浮液。施用相同体积的PBS作为对照。施用概况描述于图7B中。Gr-2、4和6中的iCART细胞以与上文相同的方式扩增7天。Gr-3、5、7、8和9中的iCART细胞在用IL-7和IL-15补充的IMDM中培养3天。iCART细胞的体内功效通过在六周内使用IVIS成像系统(IVIS LUMINAⅡ，由CaliperLS制造)测量荧光素酶活性评定。
图8阐述在施用新鲜或冷冻储备的iCART细胞六周后，iCART细胞的体内功效。如图8中由交叉(×)符号显示，仅接受PBS缓冲液(对照)或Gr-10/条件#3/清洗冷冻储备液或Gr-11/条件#4/清洗冷冻储备液的小鼠无法存活六周。接受Gr-12(初生CART细胞)/冷冻储备液的小鼠显示非常微不足道的荧光素酶表达。接受Gr-2/新鲜细胞的小鼠不显示任何荧光素酶表达。经其它调配物/条件处理的小鼠未显示荧光素酶表达的征象，甚至显示的征象可忽略不计，所述征象证实使用不同冷冻调配物冷冻保存的冷冻储备的iCART细胞的体内功效。经Gr-2，条件#2处理，冷冻恢复的所有小鼠均存活超过六周并且不显示荧光素酶表达的任何征象，指示这一调配物为最有效调配物之一。
图9阐述在施用新鲜或冷冻储备的iCART细胞后六周，iCART细胞的体内功效。iCART细胞的体内功效已以总通量(荧光素酶表达程度的定量表达)表示。除Gr-1，对照；Gr-10，条件#3，冷冻清洗；和Gr-11，条件#4，冷冻清洗外，所有治疗组在六周结束时均显示iCART细胞的体内功效。重要地，Gr-3，条件#1，冷冻恢复；Gr-5，条件#2，冷冻恢复；和Gr-8，条件#4，冷冻恢复为最有效调配物中的一些。
实例6：评估使用有和无细胞因子的调配物冷冻保存的iCART细胞的体内功效
本实例阐述使用有和无细胞因子(IL-2、IL-7和IL-15)的调配物冷冻保存的iCART细胞的体内功效的评估。本实例中的iCART细胞以与实例5相同的方式获得。在T细胞扩增步骤后，由G-REX获得细胞，然后用清洗缓冲液(5％HAS于Isolyte S中)使用Sefia S-2000细胞处理仪器清洗并将细胞浓缩到大约50mL的最终体积，以制备冷冻调配物。所述冷冻调配物通过使用CryoMEDTM冷冻保存细胞并储备于-150℃冷冻器中制备。在本实例中，制备十三种不同的冷冻调配物。所述冷冻调配物为调配物#1、调配物#2、调配物#3、调配物#4、调配物#5、调配物#6、调配物#7、调配物#8、调配物#9、调配物#10、调配物#11、调配物#12和调配物#13。所有这些调配物的组合物均显示于图10中。
为评估使用这些调配物(有和无细胞因子(IL-7和IL-15))冷冻保存的iCART细胞的体内功效，使用如图11A和11B中阐述的实验设计。经由尾静脉施用iCART细胞的悬浮液。施用相同体积的PBS作为对照。施用概况描述于图11A中。
图12阐述在施用iCART细胞后三周，iCART细胞的体内功效。iCART细胞的体内功效已根据荧光素酶表达程度表达。如图12中由交叉(×)符号指示，经PBS缓冲液(对照)，或Gr-6调配物#2或Gr-14调配物#7或Gr-19调配物#12或Gr-20调配物#13处理的小鼠无法存活三周。在五只经处理的小鼠的一者中，接受Gr-3(初生CART细胞)的小鼠显示非常微不足道的荧光素酶表达。在五只经处理的小鼠的两者中，接受Gr-2(新鲜iCART细胞)的小鼠显示一些荧光素酶表达。经其它调配物/条件处理的小鼠显示指示使用不同冷冻调配物冷冻保存的iCART细胞的不同体内功效的不同程度的荧光素酶表达。在经一种调配物或其它调配物处理的小鼠中，治疗组：Gr-7调配物#3、Gr-8调配物#3、Gr-9调配物#4和Gr-10调配物#4，为最有效的调配物。
图13阐述在施用iCART细胞后四周，iCART细胞的体内功效。在四周结束时，Gr-7调配物#3和Gr-8调配物#3为最有效的调配物。
图14阐述在施用iCART细胞后四周，iCART细胞的体内功效。iCART细胞的体内功效以总通量表示。接受Gr-2(新鲜iCART细胞)的小鼠(阳性对照组)显示最低总通量，其指示所述组最有效。在四周结束时，Gr-7调配物#3、Gr-8调配物#3和Gr-9调配物#4为最有效的调配物。
图15阐述在施用iCART细胞后四周内，iCART细胞的细胞动力学。为评估体内持久性，分析iCART在小鼠中的细胞动力学。从尾静脉收集30μL血液。将0.3μL抗人CD3抗体(克隆UCHT1,BioLegend)和0.3μL抗人CD45抗体(克隆HI30,BioLegend)直接添加到血液，并在室温下反应20分钟。在所述反应后，用FACS裂解溶液(BD Biosciences)进行溶血和固定，并用LSR Fortessa(BD Biosciences)将人CD3和CD45双重阳性细胞均作为iCART检测。iCART细胞的细胞动力学以CD45+CD3+细胞表示。在所述调配物中，相较于其它调配物，调配物#3、调配物#4、调配物#5、调配物#10和调配物#11显示更高的CD45+CD3+细胞的表达。这一数据与体内抗肿瘤功效的结果一致。例如，用#3、4和5调配的iCART显示比其它条件更高的体内持久性，其与更高的抗肿瘤效应密切相关。实例5和6中使用的调配物的各组分的供应商汇总于表4中。
表4
Figure BDA0003802751900000231
等同物和范围
仅使用例行性实验，所属领域的技术人员应知晓或可确定本文描述的本发明的特定实施例的许多等同物。本发明的范围无意仅限于上文实施方式，而是如下列权利要求书中阐述。

Claims (33)

1.一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：二甲亚砜(DMSO)、双醣、人血清，和IL-7或IL-15。
2.一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：二甲亚砜(DMSO)、双醣、人血清白蛋白，和IL-7或IL-15。
3.根据权利要求1或2所述的冷冻保存介质，其中所述介质包含：IL-7和IL-15。
4.一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：介于约1w/v％至10w/v％之间的二甲亚砜(DMSO)、介于约0.25w/v％至5w/v％之间的双醣，和介于约10w/v％至90w/v％之间的人血清。
5.一种用于冷冻保存哺乳动物细胞的冷冻保存介质，所述介质包含：介于约1w/v％至10w/v％之间的二甲亚砜(DMSO)、介于约0.25w/v％至5w/v％之间的双醣，和介于约0.5w/v％至30w/v％之间的人血清白蛋白。
6.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存介质，其中所述双醣为蔗糖。
7.根据权利要求6所述的冷冻保存介质，其中所述介质基进一步包含D-葡萄糖。
8.根据权利要求4至7所述的冷冻保存介质，其进一步包含一种或多种细胞因子。
9.根据权利要求8所述的冷冻保存介质，其中所述细胞因子选自IL-7和IL-15。
10.根据权利要求4至9所述的冷冻保存介质，其包含IL-7和IL-15。
11.根据权利要求10所述的冷冻保存介质，其中IL-7以介于约1ng/mL至50ng/mL之间的最终浓度存在。
12.根据权利要求11所述的冷冻保存介质，其中IL-7以约5ng/mL的最终浓度存在。
13.根据权利要求10所述的冷冻保存介质，其中IL-15以介于约1ng/mL至50ng/mL之间的最终浓度存在。
14.根据权利要求13所述的冷冻保存介质，其中所述IL-15以约5ng/mL的最终浓度存在。
15.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存介质，其进一步包含哺乳动物细胞培养基。
16.根据权利要求15所述的冷冻保存介质，其中所述哺乳动物细胞培养基以约介于10w/v％至90w/v％之间存在。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的冷冻保存介质，其中所述哺乳动物细胞培养基不包含非人动物组分。
18.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存介质，其进一步包含一种或多种氨基酸。
19.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存介质，其进一步包含一种或多种无机盐。
20.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存介质，其中所述pH介于约7至8之间。
21.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存介质的试剂盒。
22.一种冷冻保存哺乳动物细胞的方法，其包括：
(a)使所述细胞与根据权利要求1至20中任一项所述的冷冻保存介质接触；和
(b)以约1℃/分钟冷却所述细胞到-80℃或更低的温度。
23.一种冷冻保存并恢复活细胞的方法，其包括：
(a)使所述细胞与根据权利要求1至20中任一项所述的冷冻保存介质接触；
(b)以约1℃/分钟冷却所述细胞到-80℃或更低的温度，从而冷冻保存所述细胞；和
(c)解冻所述冷冻保存的细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述经解冻的冷冻保存的细胞在后续培养或植入个体内前未清洗。
25.根据权利要求24所述的方法，其中相较于用非根据权利要求1至20中任一项所述的冷冻保存介质冷冻并解冻的细胞，所述经解冻的冷冻保存的细胞具有增强的细胞存活。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述经解冻的冷冻保存的细胞具有体外增强的细胞存活。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述经解冻的冷冻保存的细胞在植入个体内后具有增强的细胞存活。
28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为淋巴细胞或祖细胞。
29.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为转基因淋巴细胞或祖细胞。
30.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为诱导性多能细胞(iPSC)衍生的淋巴细胞或祖细胞。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞为T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述祖细胞为iPSC、造血祖细胞(HPC)或胚胎干细胞(ESC)。
33.根据权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物细胞适用于过继细胞疗法。
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