CN113475500B - 一种全药级原料肿瘤组织冻存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种全药级原料肿瘤组织冻存液及其应用，所述组织冻存液包括以下组分：冷冻保护剂、人白蛋白注射液和复方电解质注射液，所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和海藻糖中的任意一种或几种。本发明还提供使用所述组织冻存液冻存肿瘤组织的方法，以及所述组织冻存液在冻存人肿瘤组织以及在制备人肿瘤组织冻存产品等中的应用。使用本发明的组织冻存液可在液氮条件下稳定冻存肿瘤组织长达12个月，且复苏后相对活力高，组织内细胞活率高、数量多、类型丰富，组织内核酸及蛋白的完整性好。
Description
技术领域
本发明涉及组织的存储方法技术领域。更具体地，涉及活肿瘤组织冻存液及其应用。
背景技术
世界卫生组织国际癌症研究署（IARC）数据表明， 2020年全球新发癌症病例1929万例，2020年全球癌症死亡病例996万例，癌症已成为人类健康的头号威胁。肿瘤组织对制定癌症诊疗方案、发现提高癌症治疗疗效的靶点及靶向药物、研究肿瘤发病机理具有重要意义，是推动个性化医疗发展的核心驱动力之一。
新鲜活肿瘤组织具有异型性和异质性特点，完整的保留了原始肿瘤组织的组织学信息、细胞学信息和基因组学信息，是临床诊疗和科学研究的最佳材料。例如，由于具有高度异质性和极强的肿瘤细胞识别及靶向能力，患者肿瘤组织分离的肿瘤浸润淋巴细胞已成为有望率先攻克实体瘤的新型细胞免疫疗法。截至2021年，全球应用肿瘤浸润淋巴细胞治疗各种癌症的注册临床研究多达386项，如肿瘤浸润淋巴细胞治疗转移性黑色素瘤（Metastatic Melanoma）（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02360579）。2017年，肿瘤浸润淋巴细胞疗法的市场规模约7亿美元，预计2021年市场规模将达12亿美元。领域内领头羊为美国Iovance Biotherapeutics公司，其领衔管线为Lifileucel（LN-144），LN-144在治疗转移性黑色素瘤中取得了显著疗效，客观缓解率（ORR）高达36.4%。该产品已向FDA提交上市申请，预计定价为25万美元/疗程。
肿瘤组织生物样本库是转化医学和个性化医疗的支撑和源泉。目前，全球已有超50个国家建立肿瘤组织生物样本库，美国休斯顿的MD Anderson Cancer Center和英国利物浦的University Hospital Aintree已建成全球最大的两个肿瘤组织生物样本库。2009年，我国成立了中国医药生物技术协会组织生物样本库（生物银行）分会。截至2021年4月，上海张江生物银行已建成我国最大的肿瘤组织生物样本库。活肿瘤组织超低温冻存是建立肿瘤组织生物样本库的核心技术之一，开发满足临床应用和工业生产关键质量属性的人活肿瘤组织超低温冻存方法和试剂具有重要意义。
首先，人活肿瘤组织冻存液属于细胞治疗产品的原材料。《中国药典》2020版明确指出，细胞治疗产品原材料的选择原则应基于风险控制原则，即在原料级别的选择上，药用级别优于非药用级别、化学源性优于生物源性、非动物源性优于动物源性。目前常用实验室配制和CN105850982B、CN111066778A及CN108669071A公开的人活肿瘤组织冻存液都含有一定浓度的胎牛血清（如8%或15% v/v）或小鼠血清（如15% v/v），属于含动物源性成分、非药级原料的冻存液，在细胞治疗产品的原材料风险控制和级别方面存在较大提升空间。研发成分明确、无动物源性成分、全药级原料的人活肿瘤组织冻存液将大幅提高其作为细胞治疗产品原材料的合规性。
其次，人活肿瘤组织冻存液应满足工业生产的关键质量指标，包括简便快速和成本低廉。目前最新的玻璃化冻存技术、CN106047812B公开和市场广泛应用的玻璃化肿瘤组织冻存液均存在以下不足：（1）操作繁琐、耗时长。需金属网筛等冻存载体辅助提高降温速率。冻存过程需按浓度梯度逐级渗透，单次操作需4步，单次耗时约1h。（2）成本高。上海赛立维生物科技有限公司LiveTissueTM 活肿瘤组织冻存试剂盒（货号LT2601）的价格为2000元/20 mL组织冻存液。使用该产品冻存肿瘤组织时，仅计算组织冻存液一种原材料，生产成本已高达1000元/个供者来源肿瘤样品。研发简便快速和成本低廉的人活肿瘤组织冻存液是实现普惠型组织保存及细胞治疗产品的工业基础。
最后，使用组织冻存液冻存的人活肿瘤组织是临床诊疗和细胞治疗产品的原材料，参考《ICH指导委员会．药品注册的国际技术要求--质量指导原则》，应能在液氮冻存条件下一定时间内保留原始肿瘤组织的组织学、细胞学和基因组学等基本生物学属性。基本生物学属性旨在鉴别复苏后组织相对活力，组织内细胞活率、数量及类型，组织内核酸及蛋白的完整性。稳定性研究方面，CN106047812B及CN105850982B公开和市场广泛应用的肿瘤组织冻存液均未进行合规的稳定性测试。基本生物学属性考察方面，CN106047812B和CN105850982B公开的肿瘤组织冻存液和上海赛立维生物科技有限公司LiveTissueTM 活肿瘤组织冻存试剂盒（货号LT2601）均仅检测了复苏后肿瘤组织移植成瘤率。美国CryoCrate公司C80EZ®-TISSUE活组织冻存液（货号502001）仅考察了复苏后极少量组织切片中TUNEL染色阳性的凋亡细胞比例。均未全面考察组织相对活力，仅能证明复苏后肿瘤组织中存在活细胞，无法评估相同体积下冻存复苏后组织与新鲜组织的相对活力。缺乏合规的质量研究，严重制约了人活肿瘤组织冻存液的产业转化和临床应用。
因此，亟待研发全药级原料、简便快速、成本可控、验证充分的人活肿瘤组织冻存液，满足日益迫切的临床应用和工业生产需求。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种人活肿瘤组织冻存液，该肿瘤组织冻存液成分明确、无动物源性成分、全药级原料，解决现有人活肿瘤组织冻存液的技术缺陷、满足临床应用和工业生产关键质量属性的要求。
本发明的第二个目的在于提供上述人活肿瘤组织冻存液在冻存人肿瘤组织中的应用或在制备人肿瘤组织冻存产品中的应用。
为达到第一个目的，本发明提供了一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液包括以下组分：冷冻保护剂、人白蛋白注射液和复方电解质注射液。其中，所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和海藻糖中的任意一种或几种。
在一个或多个实施方案中，二甲基亚砜的浓度为0-15% v/v，优选为1-15% v/v；乙二醇的浓度为0-15% v/v，优选为1-15% v/v；聚乙二醇的浓度为0-8% w/v；聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0-5% w/v，优选为0.1-5% w/v；蔗糖的浓度为0-15% w/v；海藻糖的浓度为0-15%w/v，优选为1-15% w/v。
在一个或多个实施方案中，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和海藻糖；优选地，各组分的浓度分别为：二甲基亚砜1-15% v/v、乙二醇1-15% v/v、聚乙烯吡咯烷酮0.5-2% w/v和海藻糖1-15% w/v；更优选地，所述二甲基亚砜的浓度为8-12% v/v、乙二醇的浓度为8-12% v/v、聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.8-1.5% w/v和海藻糖的浓度为10-12% w/v。
在一个或多个实施方案中，所述组织冻存液中，人白蛋白的浓度为2-6% w/v，优选为3-5% w/v，复方电解质注射液的浓度为40-88% v/v，优选为51-69% v/v。
在一个或多个实施方案中，所述人白蛋白注射液中人白蛋白的含量为20% w/v，所述组织冻存液中人白蛋白注射液的浓度为10-30% v/v，优选为15-25% v/v。
第二方面，本发明提供一种肿瘤组织冻存方法，包括以下步骤：
（1）肿瘤组织预处理；
（2）将预处理的肿瘤组织放入本文任一实施方案所述的组织冻存液中，孵育后降温冻存。
在一个或多个实施方案中，肿瘤组织预处理包括肿瘤组织的清洗和剪切，得到肿瘤组织块；优选地，肿瘤组织块的体积为0.5-3 mm3。
第二方面，本发明提供本文任一实施方案所述的组织冻存液在如下任一中的应用：
1）在冻存人肿瘤组织中的应用；
2）在制备用于冻存人肿瘤组织的产品中的应用；
3）在建立人肿瘤组织生物样本库中的应用；
4）在人肿瘤组织冻存复苏后原代细胞分离中的应用；
5）在人肿瘤组织冻存复苏后核酸和/或蛋白质提取和/或鉴别中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述人肿瘤组织为人原代活实体肿瘤组织；优选地，所述实体肿瘤组织选自内分泌肿瘤、肺与纵隔肿瘤、乳腺肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、头颈肿瘤、中枢神经系统肿瘤、皮肤肿瘤、骨及软组织肿瘤。
在一个或多个实施方案中，所述产品为试剂或试剂盒。
在一个或多个实施方案中，所述原代细胞为肿瘤细胞和/或肿瘤微环境中的正常细胞；优选地，所述肿瘤微环境中的正常细胞选自肿瘤浸润性免疫细胞（tumor-infiltrating immunocyte，TIC）、成纤维细胞、周细胞、内皮细胞等。
优选地，所述肿瘤浸润性免疫细胞选自肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）、髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）、1型巨噬细胞（macrophage 1，M1）、2型巨噬细胞（macrophage 2，M2）等。
优选地，所述肿瘤浸润性淋巴细胞选自T淋巴细胞(T lymphocyte)、B淋巴细胞（Blymphocyte）和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）。
优选地，T淋巴细胞选自毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL，CD3+CD8+）、辅助性T淋巴细胞（Helper T lymphocytes，Th，CD3+CD4+）和调节性T淋巴细胞（regulatoryT lymphocyte，Treg）。
在一个或多个实施方案中，所述核酸选自脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
在一个或多个实施方案中，DNA选自染色体基因组DNA、线粒体DNA、互补DNA（complementary DNA，cDNA）、染色体外环状DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA）、小分散环状DNA（small polydispersed circular DNA，spcDNA），B细胞或T细胞成熟中形成的小环状DNA、端粒序列形成的小环状DNA分子、Episomes、迷你染色体（minichromosomes）、双微体（double minute chromosomes，DM）等。
在一个或多个实施方案中，所述RNA选自信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）、转运RNA（transfer RNA，tRNA）和非编码RNA（noncoding RNA）；优选地，非编码RNA选自小RNA（microRNA，miRNA）、Piwi-interacting RNA （piRNA）、核仁小RNA（smallnucleolar RNA，snoRNA）、长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）和环形RNA（circular RNA，circRNA）等。
在一个或多个实施方案中，所述蛋白质选自核蛋白（nuclear protein）、膜蛋白（membrane protein）、胞浆蛋白（cytosolic protein）、细胞器蛋白和组织液蛋白。
本发明的有益效果：
本发明人活肿瘤组织冻存液极具产业转化和临床应用价值。具体表现在以下几个方面：
1)原料级别高。本发明人活肿瘤组织冻存液成分明确、无动物源性成分、采用全药级原料，符合细胞治疗产品原材料的选择原则。
2)简便快速。使用本发明组织冻存液单次操作仅需2步，单次耗时仅30 min。
3)成本低廉。与已上市组织冻存试剂/试剂盒相比，本发明组织冻存液的价格降低80%以上，满足普惠型组织保存及细胞治疗产品对原材料成本控制的要求。
4)普适性高。本发明组织冻存液适用于不同类型的肿瘤组织，且可冻存组织的形态范围为0.5-3 mm3，适用范围广。
5)质量研究充分、产品性能高。稳定性研究方面，使用本发明组织冻存液可在液氮条件下稳定冻存肿瘤组织长达12个月。生物学属性方面，复苏后相对活力高，组织内细胞活率高、数量多、类型丰富，组织内核酸及蛋白的完整性好。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出实验组（C）、市售玻璃化竞品（LiveTissueTM 活肿瘤组织冻存试剂盒）（A）、市售慢速冷冻竞品（C80EZ®-TISSUE活组织冻存液）（B）的肿瘤组织冻存流程及时间。
图2为实施例22中分别利用实施例12、实施例13冻存甲状腺肿瘤组织复苏后和阳性对照新鲜甲状腺肿瘤组织分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞形态图。
图3为实施例23中分别利用实施例12、实施例13、实施例16、实施例17冻存甲状腺肿瘤组织复苏后和阳性对照新鲜甲状腺肿瘤组织分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞活率图。
图4为实施例24中分别利用实施例11、实施例14冻存乳腺肿瘤组织复苏后和阳性对照新鲜乳腺肿瘤组织分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞形态图。
图5为实施例25中分别利用实施例11、实施例14、实施例16、实施例17冻存乳腺肿瘤组织复苏后和阳性对照新鲜乳腺肿瘤组织的获得的原代肿瘤浸润性淋巴细胞活率图。
图6为实施例26中分别对利用实施例12、实施例13、实施例16、实施例17冻存甲状腺肿瘤组织复苏后和阳性对照新鲜甲状腺肿瘤组织分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞进行表面标志物CD3、CD4和CD8表达检测图。
图7为实施例27中分别对利用实施例11、实施例14、实施例16、实施例17冻存乳腺肿瘤组织复苏后和阳性对照新鲜乳腺肿瘤组织分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞进行表面标志物CD3、CD4和CD8表达检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式鉴定任意组合。
组织冻存液
在此公开一种人活肿瘤组织冻存液（简称组织冻存液），该组织冻存液包括：冷冻保护剂、人白蛋白注射液和复方电解质注射液。
冷冻保护剂可选自二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和海藻糖中的任意一种或几种。
一些实施方式中，组织冻存液中二甲基亚砜的浓度为0-15% v/v，优选为1-15% v/v，更优选为8-12% v/v。
一些实施方式中，组织冻存液中乙二醇的浓度为0-15% v/v，优选为1-15% v/v，更优选为8-12% v/v。
一些实施方式中，组织冻存液中聚乙二醇的浓度为0-8% w/v。
一些实施方式中，组织冻存液中聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0-5% w/v，优选为0.1-5% w/v，更优选为0.8-1.5% w/v。
一些实施方式中，组织冻存液中蔗糖的浓度为0-15% w/v。
一些实施方式中，组织冻存液中海藻糖的浓度为0-15% w/v，优选为1-15% w/v，更优选为10-12% w/v。
一些实施方式中，冷冻保护剂为二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和海藻糖。优选实施方式中，冷冻保护剂的各组分的浓度分别为：二甲基亚砜1-15% v/v、乙二醇1-15%v/v、聚乙烯吡咯烷酮0.5-2% w/v和海藻糖1-15% w/v。更优选实施方式中，二甲基亚砜的浓度为8-12% v/v、乙二醇的浓度为8-12% v/v、聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.8-1.5% w/v和海藻糖的浓度为10-12% w/v。
人白蛋白注射液的成分本领域公知，可包括人白蛋白和任选的其它辅料（例如辛酸钠、乙酰色氨酸等）。人白蛋白注射液中，白蛋白的浓度通常在5-20％（w/v）的范围内。例如，人白蛋白注射液可选用不同的规格，例如2g(白蛋白浓度5%)、40ml/瓶；5g(20%)、25ml/瓶；5g(10%)、50ml/瓶；10g (20%)、50ml/瓶等。可选用不同规格和不同用量的人白蛋白注射液，使得组织冻存液中人白蛋白的浓度为2-6% w/v。在优选的实施方案中，选用20%（w/v）的规格（即人白蛋白的浓度为20%（w/v）），组织冻存液中人白蛋白注射液的浓度为10-30% v/v，优选为15-25% v/v。
复方电解质注射液的成分本领域公知，可包括氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁等。组织冻存液中，复方电解质注射液的浓度可为40-88% v/v，优选为51-69% v/v。
组织冻存液可通过将各成分（包括将冷冻保护剂、人白蛋白注射液和复方电解质注射液）混合而得。
冻存液的配制可以使用定容法。一些实施方式中，先称量并混合冷冻保护剂和人白蛋白注射液，最后加复方电解质注射液定容至目标体积。可以由此计算复方电解质注射液在组织冻存液中的浓度。
一些实施方式中，所述组织冻存液中，冷冻保护剂为二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和海藻糖（各组分的浓度分别为：二甲基亚砜1-15% v/v、乙二醇1-15% v/v、聚乙烯吡咯烷酮0.5-2% w/v和海藻糖1-15% w/v），人白蛋白注射液的浓度为10-30% v/v（优选地，组织冻存液中人白蛋白的浓度为2-6% w/v），其余为复方电解质注射液。
肿瘤组织冻存方法
如图1所示，使用本公开的组织冻存液进行肿瘤组织冻存可包括以下步骤肿瘤组织预处理；将预处理的肿瘤组织放入组织冻存液中，孵育后进行程序降温；转入液氮中保存。
所述肿瘤组织没有特别限定，可以是本领域公知的各种肿瘤组织。肿瘤组织预处理可包括肿瘤组织的清洗和剪切，得到肿瘤组织块。一些实施方式中，肿瘤组织块的体积为0.5-3 mm3。一些实施方式中，孵育温度可为25±3℃。孵育时间可为10-20 min。每mL组织冻存液可用于冻存5-15个肿瘤组织块。如图1所示，使用本公开的组织冻存液单次操作仅需2步，单次耗时仅30 min左右，与现有的组织冻存液相比，简便快速。
本公开的组织冻存液可用于建立人肿瘤组织生物样本库。一些实施方式中，所述人肿瘤组织为人原代活实体肿瘤组织，包括但不限于内分泌肿瘤、肺与纵隔肿瘤、乳腺肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、头颈肿瘤、中枢神经系统肿瘤、皮肤肿瘤、骨及软组织肿瘤等。
冻存肿瘤组织的复苏方法
本公开中，冻存肿瘤组织的复苏方法没有特别限定，可采用本领域公知的复苏方法。一些实施方式中，从液氮容器中取出冻存管后，1-2min内完成37℃水浴复苏。将复苏后的组织转移至培养皿中，加入洗脱液洗涤。
复苏后的肿瘤组织可进行原代细胞分离。所述原代细胞可包括肿瘤细胞和肿瘤微环境中的正常细胞。肿瘤微环境中的正常细胞包括但不限于肿瘤浸润性免疫细胞（tumor-infiltrating immunocyte，TIC）、成纤维细胞、周细胞、内皮细胞等。肿瘤浸润性免疫细胞包括但不限于肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）、髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）、1型巨噬细胞（macrophage 1，M1）、2型巨噬细胞（macrophage 2，M2）等。肿瘤浸润性淋巴细胞包括但不限于T淋巴细胞(Tlymphocyte)、B淋巴细胞（B lymphocyte）和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）。T淋巴细胞中以毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL，CD3+CD8+）为主，其次还包括辅助性T淋巴细胞（Helper T lymphocytes，Th，CD3+CD4+）和调节性T淋巴细胞（regulatory Tlymphocyte，Treg）。在不同的培养时期，TIL表型也有所差异。初始分离的TIL表型以CD3+CD4+细胞为主，免疫功能处于抑制状态。经体外培养后CD8+细胞的比率明显升高，使得CD3+CD8+细胞成优势生长，毒性T淋巴细胞被激活。
原代细胞的分离方法没有特别限定，可采用本领域公知的方法。一些实施方式中，分离的原代细胞为肿瘤浸润性淋巴原代细胞。其分离方法可为：将复苏后的肿瘤组织放入TIL培养基中培养，根据TIL细胞数量及生长状态，每隔一段时间（例如两天）补加细胞因子或换液。
复苏后的肿瘤组织可进行核酸和/或蛋白质提取和鉴别。核酸可选自脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。DNA选自染色体基因组DNA、线粒体DNA、互补DNA（complementaryDNA，cDNA）、染色体外环状DNA（extrachromosomal DNA，ecDNA）、小分散环状DNA（smallpolydispersed circular DNA，spcDNA），B细胞或T细胞成熟中形成的小环状DNA、端粒序列形成的小环状DNA分子、Episomes、迷你染色体（minichromosomes）、双微体（double minutechromosomes，DM）等。蛋白质可选自核蛋白（nuclear protein）、膜蛋白（membraneprotein）、胞浆蛋白（cytosolic protein）、细胞器蛋白和组织液蛋白。
一些实施方式中，从冻存复苏后肿瘤组织中提取RNA。提取方法可为TRIzol法等。然后可对提取的RNA进行RNA完整性鉴定。
在此还提供一种试剂盒，其包括本公开的组织冻存液和任选的复苏液。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明的实施例中所使用的抗体、试剂来源如下：
LiveTissueTM 活肿瘤组织冻存试剂盒，上海赛立维生物科技有限公司，货号LT2601。
LiveTissueTM 活肿瘤组织复苏试剂盒，上海赛立维生物科技有限公司，货号LT2602。
C80EZ®-TISSUE活组织冻存液，CryoCrate公司，货号502001。
Anti-human CD3 PE-Cy5，CD4 PE和CD8 FITC 抗体，Biolegend公司，货号319001。
CCK-8试剂盒，碧云天生物技术公司，货号C0038。
DPBS（Dulbeco’s磷酸盐缓冲液，不含钙、镁、酚红，1×），麦克林生物，货号SJQT000090。
二甲基亚砜（CAS号67-68-5），WAK-Chemie Medical GmbH公司，货号为WAK-DMSO-70。
乙二醇（CAS号107-21-1），Sigma-Aldrich公司，货号为324558。
聚乙二醇400（CAS号25322-68-3），湖南尔康制药股份有限公司。
聚乙烯吡咯烷酮（CAS号9003-39-8），Sigma-Aldrich公司，货号为1551503。
蔗糖（CAS号57-50-1），湖南九典制药股份有限公司，注册号为F20209990790。
海藻糖（CAS号6138-23-4），Hayashibara公司，货号为R007001。
人白蛋白注射液，Baxter公司，注册号为国药准字S10920009。配方见表1。
表1 人白蛋白注射液配方表
| 原料名称 | CAS号 | 浓度（g/L） |
| 人血白蛋白 | 70024-90-7 | 200 |
| 辛酸钠 | 1984-06-1 | 2.7 |
| N-乙酰基-DL-色氨酸钠 | 62307-74-8 | 4.3 |
复方电解质注射液，河北天成药业股份有限公司，注册号为国药准字H20123411。配方见表2。
表2 复方电解质注射液配方表
| 原料名称 | CAS号 | 浓度（g/L） |
| 氯化钠 | 7647-14-5 | 5.26 |
| 葡萄糖酸钠 | 527-07-1 | 5.02 |
| 醋酸钠 | 126-96-5 | 3.68 |
| 氯化钾 | 7447-40-7 | 0.37 |
| 氯化镁 | 7786-30-3 | 0.30 |
胎牛血清，Thermo Fisher公司，货号为16140071。
DMEM/F12 培养基，Thermo Fisher公司，货号为12400024。配方见表3。
表3 DMEM/F12 培养基配方表
| 原料名称 | 分子量 | 浓度（mg/L） |
| 甘氨酸 | 75.0 | 18.75 |
| L-丙氨酸 | 89.0 | 4.45 |
| L-精氨酸盐酸盐 | 211.0 | 147.5 |
| L-天冬酰胺一水合物 | 150.0 | 7.5 |
| L-天冬氨酸 | 133.0 | 6.65 |
| L-半胱氨酸盐酸盐一水合物 | 176.0 | 17.56 |
| L-胱氨酸二盐酸盐 | 313.0 | 31.29 |
| L-谷氨酸 | 147.0 | 7.35 |
| L-谷氨酰胺 | 146.0 | 365.0 |
| L-组氨酸单盐酸盐一水合物 | 210.0 | 31.48 |
| L-异亮氨酸 | 131.0 | 54.47 |
| L-亮氨酸 | 131.0 | 59.05 |
| L-赖氨酸盐酸盐 | 183.0 | 91.25 |
| L-蛋氨酸 | 149.0 | 17.24 |
| L-苯丙氨酸 | 165.0 | 35.48 |
| L-脯氨酸 | 115.0 | 17.25 |
| L-丝氨酸 | 105.0 | 26.25 |
| L-苏氨酸 | 119.0 | 53.45 |
| L-色氨酸 | 204.0 | 9.02 |
| L-酪氨酸二钠盐二水合物 | 261.0 | 55.79 |
| L-缬氨酸 | 117.0 | 52.85 |
| 生物素 | 244.0 | 0.0035 |
| 氯化胆碱 | 140.0 | 8.98 |
| D-泛酸钙 | 477.0 | 2.24 |
| 叶酸 | 441.0 | 2.65 |
| 烟酰胺 | 122.0 | 2.02 |
| 盐酸吡哆醇 | 206.0 | 2.031 |
| 核黄素 | 376.0 | 0.219 |
| 盐酸硫胺素 | 337.0 | 2.17 |
| 维生素B12 | 1355.0 | 0.68 |
| 肌醇 | 180.0 | 12.6 |
| 氯化钙 | 111.0 | 116.6 |
| 硫酸铜五水合物 | 250.0 | 0.0013 |
| 硝酸铁九水合物 | 404.0 | 0.05 |
| 硫酸亚铁七水合物 | 278.0 | 0.417 |
| 氯化镁 | 95.0 | 28.64 |
| 硫酸镁 | 120.0 | 48.84 |
| 氯化钾 | 75.0 | 311.8 |
| 氯化钠 | 58.0 | 6995.5 |
| 磷酸氢二钠 | 142.0 | 71.02 |
| 磷酸二氢钠二水合物 | 138.0 | 62.5 |
| 硫酸锌七水合物 | 288.0 | 0.432 |
| D-(+)-葡萄糖 | 180.0 | 3151.0 |
| 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸 | 238.0 | 3574.5 |
| 次黄嘌呤单钠盐 | 159.0 | 2.39 |
| 亚油酸 | 280.0 | 0.042 |
| 硫辛酸 | 206.0 | 0.105 |
| 酚红 | 376.4 | 8.1 |
| 腐胺二盐酸盐 | 161.0 | 0.081 |
| 胸苷 | 242.0 | 0.365 |
TRIzol，Thermo Fisher公司，货号为15596026。
氯仿（CAS号67-66-3），Sigma-Aldrich公司，货号为288306。
异丙醇（CAS号67-63-0），Sigma-Aldrich公司，货号为W292912。
乙醇（CAS号64-17-5），Sigma-Aldrich公司，货号为51976。
UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water，Thermo Fisher公司，货号为10977023。
下述实施例1-14中用于人原代活肿瘤组织的冻存方法，包括以下步骤：
1)用生理盐水漂洗肿瘤组织3次。
2)用眼科剪将肿瘤组织剪碎至0.5-3 mm3的小块。
3)用生理盐水漂洗肿瘤组织小块1次。
4)向1.8 mL冻存管中加入1 mL组织冻存液，向含有组织冻存液的冻存管中加入5-15个组织小块。
5)在26℃下孵育10-20 min后放入降温盒进行程序降温。
6)转入-196℃液氮中长期保存。
下述使用实施例1-14和实施例17冻存肿瘤组织的复苏方法，包括以下步骤：
1)从液氮中取出肿瘤组织，迅速在37℃水浴中快速摇动解冻。
2)将组织及冻存液倒入六孔板孔内，向孔内加入3 mL预热的实施例15的洗脱液。
3)吹吸3次后，吸弃液体。
下述实施例16中用于人原代活肿瘤组织的冻存方法，包括以下步骤：
1)水浴加热并维持玻璃化液1、玻璃化液2为26℃。
2)用生理盐水清洗肿瘤组织3次。
3)使用眼科剪、眼科镊修剪去除血管、包膜以及坏死组织。
4)使用组织处理模具将肿瘤组织切成1 mm厚的薄片。
5)用生理盐水再次清洗切好的组织3次。
6)用无菌纱布吸除组织表面的液体。
7)用平口镊将肿瘤组织切片浸入已含有10 mL玻璃化液1的管中，26℃孵育25min。
8)将管中的液体及组织切片全部倒入100 mm培养皿中。
9)用无菌纱布吸除组织表面的液体。
10)用平口镊将肿瘤组织切片浸入已含有10 mL玻璃化液2的管中，26℃孵育15min。如组织切片在15 min内没有自然沉降至管底，则延长孵育时间至组织切片自然沉降至管底。
11)取出组织切片，平铺摆放于组织支架上。
12)将组织支架平放于无菌纱布上，尽量吸除组织切片表面的液体。
13)用有齿镊将组织支架快速浸入液氮，浸泡时间不少于5 min。
14)快速将组织支架移入组织冻存管内，旋紧冻存管，将冻存管移入液氮罐中保存。
下述使用实施例16冻存肿瘤组织的复苏方法，包括以下步骤：
1)水浴加热并维持LiveTissueTM 活肿瘤组织复苏试剂盒复苏液1为37℃，LiveTissueTM 活肿瘤组织复苏试剂盒复苏液2、3、4为26℃。
2)用有齿镊在液氮中旋开组织冻存管并取出组织支架。
3)迅速将组织支架沉浸入37℃的复苏液1，不断轻摇。
4)待组织切片从组织支架上脱落后取出支架，让组织切片在复苏液1中浸泡3min。
5)将液体及组织切片全部倒入100 mm培养皿中，用平口镊将组织切片移入已含有10 mL复苏液2的管中，26℃孵育5 min。
6)将液体及组织切片全部倒入100 mm培养皿中，用平口镊将组织切片移入已含有10 mL复苏液3的管中，26℃孵育10 min。
7)将液体及组织切片全部倒入100 mm培养皿中，用平口镊将组织切片移入已含有10 mL复苏液4的管中，26℃孵育10 min。
8)生理盐水冲洗复苏后的肿瘤组织。
下述实施例17中用于人原代活肿瘤组织的冻存方法，包括以下步骤：
1)用生理盐水漂洗肿瘤组织3次。
2)用眼科剪将肿瘤组织剪碎至1-2 mm3的小块。
3)用生理盐水漂洗肿瘤组织小块3次。
4)向1.5/2.0 mL冻存管中加入1 mL C80EZ®培养基，向含有组织冻存液的冻存管中加入组织小块，孵育30-60 min。
5)在C80EZ®培养基中加入DMSO（v/v 19:1）配制C80EZ®组织冻存液。
6)向2.0 mL冻存管中加入1 mL组织冻存液，向含有组织冻存液的冻存管中加入组织小块（组织小块总体积不超过0.1 cm3）。
7)在26℃下孵育10 min后放入降温盒进行程序降温。
8)转入-196℃液氮中长期保存。
下述实施例中复苏后肿瘤组织相对活力检测方法，包括以下步骤：
1)将新鲜以及复温后的组织铺板至96孔板中，并加入100 uL DMEM/F12培养基培养，在培养箱（37℃，5%CO2）中孵育2 h；
2)每孔加入10 μL Cell count kit-8（CCK-8）溶液，37℃孵育1h；
3)使用酶标仪在450 nm处测量OD 值。计算复苏后肿瘤组织相对新鲜组织的活力：
其中As为实验孔（含有复温后组织、培养基以及CCK-8溶液）的OD值；Ac为对照孔（含有新鲜组织、培养基以及CCK-8溶液）的OD值；Ab为空白孔（含有培养基以及CCK-8溶液）的OD值。
下述实施例中复苏后肿瘤组织分离肿瘤浸润性淋巴原代细胞、采集原代肿瘤浸润性淋巴细胞形态及活率的方法，包括以下步骤：
将新鲜或复苏后的肿瘤组织直接放入TIL培养基中培养，根据TIL细胞数量及生长状态，每隔两天补加细胞因子或换液。在培养第7天，光学显微镜下观察TIL细胞形态并拍照。同时，采用NucleoCounter® NC-200™（ChemoMetec）进行TIL细胞数量和存活率的检测。
下述实施例中肿瘤浸润性淋巴原代细胞进行免疫荧光染色和流式细胞分析的方法，包括以下步骤：
1)加入200 μL含1*106个活TIL细胞的细胞悬液至1.5 mL离心管中，离心并弃上清。每管中再加入1 mL PBS重悬，离心并弃上清。
2)每管加入100 μL CD3、CD4和CD8抗体。轻轻振荡充分混匀后，置于4℃冰箱避光孵育30min。
3)每管加入1 mL PBS，离心。
4)弃上清，每管加入1 mL PBS重悬，离心。
5)弃上清，每管加入500 μL PBS重悬，流式细胞仪检测各组TIL细胞表面CD3、CD4和CD8分子的表达。
6)
下述实施例中从新鲜和冻存复苏后肿瘤组织中提取RNA和鉴定RNA完整性（RNAintegrity number，RIN）的方法，包括以下步骤：
1)将肿瘤组织（新鲜/冻存）液氮研磨至粉末状后，按50-100 mg组织/mL加入TRIzol。TRIzol裂解细胞，促使核蛋白复合体解离，而且有效抑制RNase活性。
2)将混合液吸入1.5 mL离心管（RNase-Free），再加入200 μL4℃预冷的氯仿，剧烈震荡30 s后，室温放置15 min。
3)4℃ 12000 g离心15 min。
4)取上清于新的1.5 mL离心管（RNase-Free），再加入200 μL4℃预冷的氯仿，吹打混匀，4℃ 12000 g离心15 min。
5)取上清于新的1.5 mL离心管（RNase-Free），加入等体积的异丙醇，室温放置5-10 min。
6)4℃ 12000 g离心10min弃上清。
7)加入1 mL75%乙醇，温和震荡获得沉淀。
8)4℃ 8000 g离心5 min弃上清。
9)打开离心管管盖，室温自然风干5-10 min。
10) 加入10 μL DNase/RNase-Free Distilled Water溶解沉淀，并吹打混匀。
11) 送样，使用Agilent 2100 生物分析仪系统进行RNA完整性鉴定。
实施例1 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜1% v/v、乙二醇1% v/v、聚乙二醇1% w/v、聚乙烯吡咯烷酮0.1% w/v、蔗糖1% w/v、海藻糖1% w/v、人白蛋白注射液10% v/v，复方电解质注射液88% v/v。
实施例2 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜15% v/v、乙二醇12% v/v、聚乙二醇8% w/v、聚乙烯吡咯烷酮5% w/v、蔗糖15% w/v、海藻糖15% w/v、人白蛋白注射液30% v/v，复方电解质注射液43% v/v。
实施例3 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：乙二醇15% v/v、聚乙烯吡咯烷酮4% w/v、蔗糖10% w/v、海藻糖10% w/v、人白蛋白注射液20% v/v，复方电解质注射液65% v/v。
实施例4 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜10% v/v、聚乙二醇5% w/v、聚乙烯吡咯烷酮3% w/v、蔗糖5% w/v、海藻糖5% w/v、人白蛋白注射液15% v/v，复方电解质注射液75% v/v。
实施例5 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜12% v/v、乙二醇10% v/v、聚乙烯吡咯烷酮2% w/v、海藻糖12% w/v、人白蛋白注射液30% v/v，复方电解质注射液48% v/v。
实施例6 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜15% v/v、乙二醇7% v/v、聚乙二醇4% w/v、海藻糖7% w/v、人白蛋白注射液25% v/v，复方电解质注射液53% v/v。
实施例7 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜8% v/v、乙二醇4% v/v、聚乙二醇8% w/v、聚乙烯吡咯烷酮1% w/v、蔗糖15% w/v、人白蛋白注射液10% v/v，复方电解质注射液78% v/v。
实施例8 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜15% v/v、乙二醇15% v/v、聚乙二醇8% w/v、聚乙烯吡咯烷酮5% w/v、蔗糖15% w/v，复方电解质注射液70%v/v。
实施例9 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜1% v/v、乙二醇1% v/v、聚乙烯吡咯烷酮0.5% w/v、海藻糖1% w/v、人白蛋白注射液10% v/v、复方电解质注射液88% v/v。
实施例10 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜15% v/v、乙二醇15% v/v、聚乙烯吡咯烷酮2% w/v和海藻糖15% w/v、人白蛋白注射液30% v/v，复方电解质注射液40% v/v。
实施例11 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜8% v/v、乙二醇8% v/v、聚乙烯吡咯烷酮0.8% w/v和海藻糖10% w/v、人白蛋白注射液15% v/v、复方电解质注射液69% v/v。
实施例12 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜12% v/v、乙二醇12% v/v、聚乙烯吡咯烷酮1.5% w/v和海藻糖12% w/v、人白蛋白注射液25% v/v、复方电解质注射液51% v/v。
实施例13 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜10% v/v、乙二醇10% v/v、聚乙烯吡咯烷酮1% w/v和海藻糖10% w/v、人白蛋白注射液20% v/v、复方电解质注射液60% v/v。
实施例14 肿瘤组织冻存液
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液由二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、人白蛋白注射液和复方电解质注射液组成，所述各组分浓度为：二甲基亚砜11% v/v、乙二醇11% v/v、聚乙烯吡咯烷酮1.2% w/v和海藻糖11% w/v、人白蛋白注射液22% v/v、复方电解质注射液56% v/v。
实施例15 肿瘤组织洗脱液
一种肿瘤组织洗脱液，所述组织洗脱液由蔗糖、葡萄糖和DMEM/F12 培养基组成，所述各组分浓度为：蔗糖15% w/v、葡萄糖15% w/v，其余为DMEM/F12 培养基。
实施例16 肿瘤组织冻存液（玻璃化冻存液）
一种肿瘤组织冻存液，所述组织冻存液为LiveTissueTM 活肿瘤组织冻存试剂盒。所述组织冻存液由玻璃化液1和玻璃化液2组成。
实施例17 组织冻存液（慢速冷冻冻存液）
一种组织冻存液，所述组织冻存液为C80EZ®-TISSUE活组织冻存液。所述组织冻存液由C80EZ®培养基和二甲基亚砜组成，所述C80EZ®培养基浓度为95% v/v，所述二甲基亚砜浓度为5% v/v。
实施例18 使用不同冻存液冻存甲状腺肿瘤组织复苏后组织相对活力对比试验
以相同供者来源的甲状腺肿瘤组织为受试组织，以实施例1至实施例14的组织冻存液为受试冻存液，以实施例16的玻璃化冻存液和实施例17的慢速冷冻冻存液作为对照冻存液，同时以新鲜甲状腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个甲状腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后进行肿瘤组织相对活力检测，统计数据并计算甲状腺肿瘤组织活率，以比较不同冻存液对甲状腺肿瘤组织的冻存效果。
由表4可以看出，实施例11、实施例12、实施例13和实施例14组织冻存液的冻存复苏后甲状腺肿瘤组织相对活力可达70%以上，其余组织冻存液的冻存复苏后甲状腺肿瘤组织相对活力较低，低于60%。
表4冻存复苏后甲状腺肿瘤组织相对活力（n=3）
| 实验组 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | 实施例8 |
| 相对活力（%） | 42.2±6.27 | 45.3±6.31 | 19.8±7.56 | 22.9±7.21 | 53.7±6.91 | 23.1±8.85 | 31.3±8.53 | 30.6±4.47 |
| 实验组 | 实施例9 | 实施例10 | 实施例11 | 实施例12 | 实施例13 | 实施例14 | 实施例16 | 实施例17 |
| 相对活力（%） | 47.1±7.24 | 51.8±8.92 | 70.9±9.35 | 75.6±8.34 | 82.7±6.45 | 79.2±7.37 | 58.6±7.62 | 46.3±5.19 |
实施例19 使用不同冻存液冻存乳腺肿瘤组织复苏后组织相对活力对比试验
以相同供者来源的乳腺肿瘤组织为受试组织，以实施例9、实施例10、实施例11、实施例12、实施例13和实施例14的组织冻存液为受试冻存液，以实施例16的玻璃化冻存液和实施例17的慢速冷冻冻存液作为对照冻存液，同时以新鲜乳腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个乳腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后进行肿瘤组织相对活力检测，统计数据并计算乳腺肿瘤组织活率，以比较不同冻存液对乳腺肿瘤组织的冻存效果。
由表5可以看出，实施例11、实施例12、实施例13和实施例14组织冻存液的冻存复苏后乳腺肿瘤组织相对活力可达60%以上，其余组织冻存液的冻存复苏后乳腺肿瘤组织相对活力较低，低于50%。
表5冻存复苏后乳腺肿瘤组织相对活力（n=3）
| 实验组 | 实施例9 | 实施例10 | 实施例11 | 实施例12 | 实施例13 | 实施例14 | 实施例16 | 实施例17 |
| 相对活力（%） | 35.9±5.74 | 39.6±9.71 | 60.7±8.15 | 69.3±9.28 | 76.9±6.53 | 80.2±8.67 | 49.7±9.21 | 39.1±7.33 |
实施例20使用不同冻存液冻存甲状腺肿瘤组织复苏后组织相对活力稳定性试验
以相同供者来源的甲状腺肿瘤组织为受试组织，以实施例13和实施例14的组织冻存液为受试冻存液，以实施例16的玻璃化冻存液和实施例17的慢速冷冻冻存液作为对照冻存液，同时以新鲜甲状腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个甲状腺肿瘤组织小块进行冻存。分别冻存1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月后进行复苏，复苏后进行肿瘤组织相对活力检测，统计数据并计算甲状腺肿瘤组织活率，以比较不同冻存液对甲状腺肿瘤组织长期冻存的稳定性。
由表6可以看出，冻存时长相同时，实施例13和实施例14组织冻存液的冻存复苏后甲状腺肿瘤组织相对活力最高，实施例16和实施例17组织冻存液的冻存复苏后甲状腺肿瘤组织相对活力较低。冻存液相同时，随着冻存时长增加，冻存复苏后甲状腺肿瘤组织相对活力逐渐降低。使用实施例13和实施例14组织冻存液的冻存甲状腺肿瘤组织，复苏后甲状腺肿瘤组织相对活力最高，长期冻存稳定性最好。使用实施例16和实施例17组织冻存液的冻存甲状腺肿瘤组织，复苏后甲状腺肿瘤组织相对活力较低，长期冻存稳定性最差。
表6 冻存不同时间的甲状腺肿瘤组织复苏后相对活力（n=3）
实施例21使用不同冻存液冻存乳腺肿瘤组织复苏后组织相对活力稳定性试验
以相同供者来源的乳腺肿瘤组织为受试组织，以实施例13和实施例14的组织冻存液为受试冻存液，以实施例16的玻璃化冻存液和实施例17的慢速冷冻冻存液作为对照冻存液，同时以新鲜乳腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个乳腺肿瘤组织小块进行冻存。分别冻存1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月后进行复苏，复苏后进行肿瘤组织相对活力检测，统计数据并计算乳腺肿瘤组织活率，以比较不同冻存液对乳腺肿瘤组织长期冻存的稳定性。
由表7可以看出，冻存时长相同时，实施例13和实施例14组织冻存液的冻存复苏后乳腺肿瘤组织相对活力最高，实施例16和实施例17组织冻存液的冻存复苏后乳腺肿瘤组织相对活力较低。冻存液相同时，随着冻存时长增加，冻存复苏后乳腺肿瘤组织相对活力逐渐降低。使用实施例13和实施例14组织冻存液的冻存乳腺肿瘤组织，复苏后乳腺肿瘤组织相对活力最高，长期冻存稳定性最好。使用实施例16和实施例17组织冻存液的冻存乳腺肿瘤组织，复苏后乳腺肿瘤组织相对活力较低，长期冻存稳定性最差。
表7 冻存不同时间的乳腺肿瘤组织复苏后相对活力（n=3）
实施例22冻存甲状腺肿瘤组织复苏后原代肿瘤浸润性淋巴细胞分离试验
以相同供者来源的甲状腺肿瘤组织为受试组织，以实施例12、实施例13、实施例16和实施例17的组织冻存液为受试冻存液，以新鲜甲状腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个甲状腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后按上述方法进行肿瘤浸润性淋巴细胞原代分离，采集原代肿瘤浸润性淋巴细胞的形态数据。如图2所示，与新鲜甲状腺肿瘤一致，使用实施例12和实施例13冻存的甲状腺肿瘤组织复苏培养7天后可分离出原代肿瘤浸润性淋巴细胞。使用实施例16和实施例17冻存的甲状腺肿瘤组织复苏培养7天后几乎分离不出原代肿瘤浸润性淋巴细胞。
实施例23冻存甲状腺肿瘤组织复苏后分离原代肿瘤浸润性淋巴细胞的活率及数量对比试验
以相同供者来源的甲状腺肿瘤组织为受试组织，以实施例12和实施例13的组织冻存液为受试冻存液，以实施例16的玻璃化冻存液和实施例17的慢速冷冻冻存液作为对照冻存液，同时以新鲜甲状腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个甲状腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后按上述方法进行肿瘤浸润性淋巴细胞原代分离，采集原代肿瘤浸润性淋巴细胞的活率及数量数据，以比较使用不同冻存液冻存甲状腺肿瘤组织，组织复苏后获得原代肿瘤浸润性淋巴细胞的能力。
不同冻存液冻存甲状腺肿瘤组织复苏培养7天后分离原代肿瘤浸润性淋巴细胞的活率如图3所示，由图3可以看出，新鲜甲状腺肿瘤分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞活率为97.5±0.31%（n=3），使用实施例12和实施例13冻存的甲状腺肿瘤组织复苏后分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞活率分别为86.53±0.45%和94.5±0.42%（n=3）。使用实施例16和实施例17冻存的甲状腺肿瘤组织复苏后分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞活率低于新鲜组41.6-54.3%，分别为55.9±4.02%和43.2±2.01%，具有极显著性差异（p < 0.01）。实验结果表明使用实施例12和实施例13冻存的甲状腺肿瘤组织复苏后分离原代细胞的活率更高。
不同冻存液冻存甲状腺肿瘤组织复苏后分离原代肿瘤浸润性淋巴细胞的数量如表8所示。
表8 冻存甲状腺肿瘤组织复苏后分离原代肿瘤浸润性淋巴细胞的数量（n=3）
实施例24冻存乳腺肿瘤组织复苏后原代肿瘤浸润性淋巴细胞分离试验
以相同供者来源的乳腺肿瘤组织为受试组织，以实施例11、实施例14、实施例16和实施例17的组织冻存液为受试冻存液，以新鲜乳腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个乳腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后按上述方法进行肿瘤浸润性淋巴细胞原代分离，采集原代肿瘤浸润性淋巴细胞的形态数据。如图4所示，与新鲜乳腺肿瘤一致，使用实施例11和实施例14冻存的乳腺肿瘤组织复苏后培养7天可分离出原代肿瘤浸润性淋巴细胞。使用实施例16和实施例17冻存的乳腺肿瘤组织复苏培养7天后几乎分离不出原代肿瘤浸润性淋巴细胞。
实施例25冻存乳腺肿瘤组织复苏后分离原代肿瘤浸润性淋巴细胞的活率及数量对比试验
以相同供者来源的乳腺肿瘤组织为受试组织，以实施例11和实施例14的组织冻存液为受试冻存液，以实施例16的玻璃化冻存液和实施例17的慢速冷冻冻存液作为对照冻存液，同时以新鲜乳腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个乳腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后按上述方法进行肿瘤浸润性淋巴细胞原代分离，采集原代肿瘤浸润性淋巴细胞的活率及数量数据，以比较不同冻存液冻存乳腺肿瘤组织，组织复苏后分离原代肿瘤浸润性淋巴细胞的能力。
不同冻存液冻存乳腺肿瘤组织复苏后分离原代肿瘤浸润性淋巴细胞的活率如图5所示，新鲜乳腺肿瘤分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞活率为95.0±0.09%（n=3）。使用实施例11和实施例14冻存的乳腺肿瘤组织复苏后分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞活率分别为86.4±0.86%和90.86±0.63%（n=3），使用实施例16和实施例17冻存的乳腺肿瘤组织复苏后分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞活率低于新鲜组47.8-50.9%，分别为47.2±4.63%和44.1±2.93%，具有极显著性差异（p < 0.01）。实验结果表明使用实施例11和实施例14冻存的乳腺肿瘤组织复苏后分离原代细胞的活率更高。
不同冻存液冻存乳腺肿瘤组织复苏后分离原代肿瘤浸润性淋巴细胞的数量如表9所示。
表9冻存乳腺肿瘤组织复苏后分离原代肿瘤浸润性淋巴细胞的数量（n=3）
实施例26冻存甲状腺肿瘤组织复苏后分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞的鉴定
以相同供者来源的甲状腺肿瘤组织为受试组织，以实施例12和实施例13的组织冻存液为受试冻存液，以实施例16的玻璃化冻存液和实施例17的慢速冷冻冻存液作为对照冻存液，同时以新鲜甲状腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个甲状腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后按上述方法进行肿瘤浸润性淋巴细胞原代分离、免疫荧光染色和流式分析，采集原代肿瘤浸润性淋巴细胞培养30天的表面标志物表达数据，以鉴定不同冻存液冻存甲状腺肿瘤组织复苏后分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞类型。
如图6所示，使用实施例12获得的原代肿瘤浸润性淋巴细胞表达CD3、CD4和CD8的细胞比例分别为88.71±2.35%、3.23±1.34%和91.83±0.65%（n=3），使用实施例13获得的原代肿瘤浸润性淋巴细胞表达CD3、CD4和CD8的细胞比例分别为99.57±0.11%、3.49±0.55%和93.51±1.85%（n=3），与由新鲜组织分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞类型一致（CD3+细胞比例为99.21±0.28%，CD4+细胞比例为1.86±0.96%，CD8+细胞比例为93.64±1.58%；n=3）。而使用实施例16获得的原代肿瘤浸润性淋巴细胞表达CD3、CD4和CD8的细胞比例分别为99.00±0.40%、38.63±3.54%和55.81±5.33%（n=3），使用实施例17获得的原代肿瘤浸润性淋巴细胞表达CD3、CD4和CD8的细胞比例分别为70.62±1.37%、11.17±1.55%和60.45±3.6%（n=3），与由新鲜组织分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞类型差异较大。
实施例27冻存乳腺肿瘤组织复苏后分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞的鉴定
以相同供者来源的乳腺肿瘤组织为受试组织，以实施例11和实施例14的组织冻存液为受试冻存液，以实施例16的玻璃化冻存液和实施例17的慢速冷冻冻存液作为对照冻存液，同时以新鲜乳腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个乳腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后按上述方法进行肿瘤浸润性淋巴细胞原代分离、免疫荧光染色和流式分析，采集原代肿瘤浸润性淋巴细胞培养30天的表面标志物表达数据，以鉴定不同冻存液冻存乳腺肿瘤组织复苏后分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞类型。
如图7所示，使用实施例11获得的原代肿瘤浸润性淋巴细胞表达CD3、CD4和CD8的细胞比例分别为93.12±2.67%、9.61±1.56%和86.14±3.17%（n=3），使用实施例14获得的原代肿瘤浸润性淋巴细胞表达CD3、CD4和CD8的细胞比例分别为97.51±1.63%、4.58±1.00%和92.28±0.78%（n=3），与由新鲜组织分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞类型一致（CD3+细胞比例为98.50±0.57%，CD4+细胞比例为3.04±1.07%，CD8+细胞比例为91.52±1.77%；n=3）。而使用实施例16获得的原代肿瘤浸润性淋巴细胞表达CD3、CD4和CD8的细胞比例分别为97.8±1.22%、6.71±1.74%和65.44±3.68%（n=3），使用实施例17获得的原代肿瘤浸润性淋巴细胞表达CD3、CD4和CD8的细胞比例分别为69.46±2.94%、9.32±1.66%和35.56±4.82%（n=3），与由新鲜组织分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞类型差异较大。
实施例28冻存甲状腺肿瘤组织复苏后分离RNA的完整值检测
以相同供者来源的甲状腺肿瘤组织为受试组织，以实施例11、实施例12、实施例13和实施例14的组织冻存液为受试冻存液，同时以新鲜甲状腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个甲状腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后按上述方法进行甲状腺肿瘤组织RNA提取和生物分析仪分析，采集RNA完整值数据。不同冻存液冻存甲状腺肿瘤组织复苏后分离RNA的完整值如表10所示，实验结果表明使用实施例11、实施例12、实施例13和实施例14获得的甲状腺肿瘤组织RNA的RNA完整值与新鲜甲状腺肿瘤组织分离的RNA的RNA完整值一致，高于RNA完整值需>7的RNA测序质量控制要求。
表10 冻存甲状腺肿瘤组织复苏后分离RNA的完整值（n=3）
| 实验组 | 阳性对照 | 实施例11 | 实施例12 | 实施例13 | 实施例14 |
| RNA完整值 | 9.76±0.11 | 8.04±0.35 | 8.66±0.29 | 8.63±0.32 | 8.28±0.39 |
实施例29冻存乳腺肿瘤组织复苏后分离RNA的完整值检测
以相同供者来源的乳腺肿瘤组织为受试组织，以实施例11、实施例12、实施例13和实施例14的组织冻存液为受试冻存液，以新鲜乳腺肿瘤组织为阳性对照，按照本发明中上述方法对相同供者来源的10个乳腺肿瘤组织小块进行冻存。冻存1个月后进行复苏，复苏后按上述方法进行乳腺肿瘤组织RNA提取和生物分析仪分析，采集RNA完整值数据。不同冻存液冻存乳腺肿瘤组织复苏后分离RNA的完整值如表11所示，实验结果表明使用实施例11、实施例12、实施例13和实施例14获得的乳腺肿瘤组织RNA的RNA完整值与新鲜乳腺肿瘤组织分离的RNA的RNA完整值一致，高于RNA完整值需>7的RNA测序质量控制要求。
表11 冻存乳腺肿瘤组织复苏后分离RNA的完整值（n=3）
| 实验组 | 阳性对照 | 实施例11 | 实施例12 | 实施例13 | 实施例14 |
| RNA完整值 | 9.68±0.18 | 7.83±0.44 | 8.16±0.45 | 8.20±0.38 | 8.02±0.26 |
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (19)
1.一种全药级原料肿瘤组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下组分：冷冻保护剂、人白蛋白注射液和复方电解质注射液；其中，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜、乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和海藻糖，各组分的浓度分别为：二甲基亚砜的浓度为8-12% v/v、乙二醇的浓度为8-12% v/v、聚乙烯吡咯烷酮的浓度为0.8-1.5% w/v，海藻糖的浓度为10-12%w/v；其中，所述全药级原料肿瘤组织冻存液中，所述复方电解质注射液的浓度为51-69% v/v，所述人白蛋白的浓度为3-5% w/v。
2.如权利要求1所述的组织冻存液，其特征在于，所述人白蛋白注射液中人白蛋白的含量为20% w/v，所述组织冻存液中人白蛋白注射液的浓度为15-25% v/v。
3.一种肿瘤组织冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）肿瘤组织预处理；
（2）将预处理的肿瘤组织放入权利要求1-2任一所述的组织冻存液中，孵育后降温冻存。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，肿瘤组织预处理包括肿瘤组织的清洗和剪切，得到肿瘤组织块。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述肿瘤组织块的体积为0.5-3 mm3。
6.权利要求1-2任一所述的组织冻存液在如下任一中的应用：
1）在冻存人肿瘤组织中的应用；
2）在制备用于冻存人肿瘤组织的产品中的应用；
3）在建立人肿瘤组织生物样本库中的应用；
4）在人肿瘤组织冻存复苏后原代细胞分离中的应用；
5）在人肿瘤组织冻存复苏后核酸和/或蛋白质提取和/或鉴别中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，2）所述的产品为试剂或试剂盒。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述人肿瘤组织为人原代活实体肿瘤组织。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述实体肿瘤组织选自内分泌肿瘤、纵隔肿瘤、乳腺肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、头颈肿瘤、中枢神经系统肿瘤、皮肤肿瘤、骨及软组织肿瘤。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述原代细胞为肿瘤细胞和/或肿瘤微环境中的正常细胞。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤微环境中的正常细胞选自肿瘤浸润性免疫细胞、成纤维细胞、周细胞和内皮细胞。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤浸润性免疫细胞选自肿瘤浸润性淋巴细胞、髓源性抑制细胞、1型巨噬细胞和2型巨噬细胞。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述肿瘤浸润性淋巴细胞选自T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述T淋巴细胞选自CD3+CD8+毒性T细胞、CD3+CD4+辅助性T淋巴细胞和调节性T淋巴细胞。
15.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核酸选自DNA和RNA。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述DNA选自染色体基因组DNA、线粒体DNA、互补DNA、染色体外环状DNA和双微体。
17.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述RNA选自信使RNA、核糖体RNA、转运RNA和非编码RNA。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述非编码RNA选自小RNA、Piwi-interacting RNA、核仁小RNA、长链非编码RNA和环形RNA。
19.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛋白质选自核蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白、细胞器蛋白和组织液蛋白。
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