CN110583622A - 一种t细胞无血清冻存液及其使用方法 - Google Patents

一种t细胞无血清冻存液及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种T细胞无血清冻存液及其使用方法，该冻存液包括基础培养基、冻存保护剂及添加成分，所述添加成分为乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白、维生素C和细胞膜稳定剂。本发明的冻存液无血清、无人源、无动物源成分，且化学成分明确，冻存液中DMSO含量低，克服了现有技术中高DMSO含量的缺陷，避免了对细胞的毒性风险，同时不对冻存液可能的临床应用造成影响，并且对T细胞的冻存性能优异，T细胞冻存后复苏的活率在90%以上，不影响后续的激活和扩增，具有更高的临床应用和科研价值。

Description

一种T细胞无血清冻存液及其使用方法
技术领域
本发明属于细胞冻存领域，具体涉及一种化学成分明确的无血清、无人源、无动物源成分的T细胞冻存液及其使用方法。
背景技术
T细胞是淋巴细胞的主要组分之一，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助其它淋巴细胞发挥功能，对特异性抗原或促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子，是身体抵御疾病感染、防止肿瘤形成的主要免疫细胞之一。在体外富集、活化、扩增这类免疫细胞，可用于回输治疗多种疾病，包括恶性肿瘤、感染、自身免疫病等。在这个过程中，需要对扩增前、扩增中和扩增后的T细胞进行冷冻保存和复苏操作，以便保证随时进行研发、实验、测试、使用等目的。
细胞冻存及复苏是细胞培养技术中的重要技术，一般是指将细胞或组织置于-196℃液氮中进行低温保存，使其暂时脱离生长状态，并长久保存其生物性能。常用的细胞冻存方法包括慢速冻存和玻璃化冻存。慢速冻存是指采用"慢冻快融"的方法进行的冻存和复苏操作。标准冷冻速度开始为-1到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。
细胞冻存液是指在进行细胞冻存时必需用到的一种溶液，其作用是将需要冻存的细胞悬浮于冻存液，供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。传统的T细胞冻存液包含一定比例的血清，细胞培养液，二甲基亚砜DMSO（通常为10%）。这种冻存液的问题在于：1）血清批次间差异导致冻存效果不稳定；2） 含异种动物（一般为牛）来源的血清成分，存在引入异种动物病原体感染的风险，不能直接用于临床；3）血清成分复杂，其中含有多种蛋白、生长因子等，对一些种类的细胞不但达不到最佳冻存效果，还可能影响细胞后续的生长状态；4） 不适合与无血清培养体系同时使用。
现有的商业化T细胞无血清冻存液存在以下问题：1）配方成分复杂，需要添加一种或几种除DMSO以外的冻存保护剂；2）大部分需添加人血清来源的人源白蛋白，增加了成分的复杂程度、原料来源的不稳定性及生产制造的难度，不能做到真正的化学成分明确，临床使用具有很大的不确定性。
发明内容
本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种改进的T细胞无血清冻存液。
本发明的另一目的是提供上述T细胞无血清冻存液的使用方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种T细胞无血清冻存液，包括基础培养基、冻存保护剂及添加成分，所述添加成分为乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白、维生素C和细胞膜稳定剂。
根据本发明的一些实施方面，按所述基础培养基和添加成分的总量计，所述添加成分为乙醇胺0.1~1mmol/L、胰岛素2.5~50mg/L、转铁蛋白5~100 mg/L、人血清白蛋白0.2~5g/L、维生素C 1~100mg/L、细胞膜稳定剂0.5~5g/L。
根据本发明的一些优选实施方面，按所述基础培养基和添加成分的总量计，所述添加成分为乙醇胺0.1~1mmol/L、胰岛素2.5~10mg/L、转铁蛋白5~50 mg/L、人血清白蛋白0.2~5g/L、维生素C 5~50mg/L、细胞膜稳定剂0.5~5g/L。
优选地，所述细胞膜稳定剂为Pluronic F-68、Kolliphor P 188中的一种或二者组合。在配方中加入可用于临床注射制剂的特定细胞膜稳定剂，使得DMSO的含量可以低至2%，克服了现有技术高DMSO含量的缺陷，避免了对细胞的毒性风险，同时不对冻存液可能的临床应用造成影响。
根据本发明的一些优选实施方面，所述胰岛素为重组人胰岛素。
根据本发明的一些优选实施方面，所述转铁蛋白为重组人转铁蛋白。
根据本发明的一些优选实施方面，所述人血清白蛋白为重组人血清白蛋白。优选地，所述重组人血清白蛋白为酵母表达的重组人血清白蛋白（rHSA），从而完全去除人源组分，做到真正的化学成分明确。
根据本发明的一些实施方面，所述冻存保护剂为DMSO，其添加体积量占所述冻存液总体积的2~10%。优选地，所述冻存保护剂的添加量为2%或5%。低DMSO含量的冻存液克服了现有技术高DMSO含量的缺陷，避免了对细胞的毒性风险。
根据本发明的一些实施方面，所述基础培养基为IMDM、DMEM、DMEM/F12、aMEM、RPMI1640、M199中的一种或几种的混合。
根据本发明的一些优选实施方面，所述基础培养基为IMDM、DMEM/F12、 RPMI1640中的二种或三种的混合物。
根据本发明的进一步优选方面，所述基础培养基为IMDM、DMEM/F12、RPMI1640三者的混合物。优选地，所述IMDM、DMEM/F12、RPMI1640三者的体积比为1：1：1。
根据本发明的进一步优选方面，所述基础培养基为DMEM/F12、RPMI1640二者的混合物。优选地，所述DMEM/F12、RPMI1640二者的体积比为1：1。
本发明采用的另一技术方案为：上述所述的T细胞无血清冻存液的使用方法，所述使用方法包括将新鲜分离提取或正在扩增培养中的T细胞在离心管离心沉淀，去除上清液，然后将所述冻存液加入所述离心管中，重悬，得到细胞重悬液，将所述细胞重悬液转移到冻存管中，然后置于-78℃~-82℃冻存12~24h，然后再转入液氮中保存。
本发明所述的T细胞冻存是专指针对T细胞的慢速冻存。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明的冻存液无血清、无人源、无动物源成分，且化学成分明确，冻存液中DMSO含量低，克服了现有技术中高DMSO含量的缺陷，避免了对细胞的毒性风险，同时不对冻存液可能的临床应用造成影响，并且对T细胞的冻存性能优异，T细胞冻存后复苏的活率在90%以上，不影响后续的激活和扩增，具有更高的临床应用和科研价值。
本发明的冻存液相比使用盐离子缓冲液或生理盐水作为基础配方的冻存液，本发明使用细胞基础培养基作为冻存液的基本配方，提供了细胞代谢活动所需的多种营养物质，同时具有适合细胞存活的pH缓冲能力，可以有力支持细胞冻存复苏的高活率。
附图说明
图1为传统的含血清冻存液和实施例1的冻存液冻存的PBMC中T细胞复苏后计数所得的存活率示意图。
图2为传统的含血清冻存液和实施例1的冻存液冻存的PBMC中T细胞复苏后激活培养第0天的细胞示意图。
图3为传统的含血清冻存液和实施例1的冻存液冻存的PBMC中T细胞复苏后激活培养第3天的细胞示意图。
图4为传统的含血清冻存液和实施例1的冻存液冻存的PBMC中T细胞复苏后激活培养第3天的细胞计数的数据对比示意图。
图5为传统的含血清冻存液和实施例2的冻存液冻存激活的T细胞复苏后计数所得的存活率示意图。
图6为传统的含血清冻存液和实施例2的冻存液冻存激活的T细胞复苏后激活培养6天的细胞示意图。
图7为传统的含血清冻存液和实施例2的冻存液冻存激活的T细胞复苏后激活培养6天的细胞计数的数据对比示意图。
具体实施方式
本发明针对现有的T细胞商品化冻存液和传统冻存液存在的问题，提供一种专门针对T细胞的化学成分明确的冻存液及其使用方法， 该冻存液不含有任何动物来源和人体来源的成分，避免了任何因为使用含动物来源的成分或人体来源的成分可能带入的传染性疾病，因此有更高的安全性，并且性能优异，T细胞冻存后复苏的活率在90%以上，不影响后续的激活和扩增。
为更清楚体现本发明的目的、技术方案及优势，下面结合说明书附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例仅用以阐释本发明，不用于限制本发明。
以下实施例中使用的部分原料的来源如下：
IMDM：购自Sigma，货号 I7633-10*1L。
DMEM/F12：购自Sigma，货号D2906-10*1L。
RPMI1640：购自Sigma，货号 R6504-10*1L。
重组人转铁蛋白：购自Sigma，型号为T3705-1G。
重组人血清白蛋白：购自Sigma，型号为A9731-10G。
重组人胰岛素：购自Sigma，型号为91077C-1G。
实施例1
1、本实施例采用的冻存液的具体配置方法如下：
使用IMDM、DMEM/F12和 RPMI1640 三种培养基按体积比1:1:1混合配制成冻存液的基础培养基，然后向基础培养基中添加终浓度分别为0.1mmol/L的乙醇胺、2.5g/L的重组人胰岛素、5mg/L的重组人转铁蛋白、0.2g/L的重组人血清白蛋白、1mg/L的维生素C以及1g/L的Pluronic F-68；最后加入体积百分比为10%的DMSO，制得无血清冻存液。
2、将本例中的冻存液用于冻存人外周血单核细胞（PBMC）中T细胞，具体的冻存方法如下：
使用密度离心法从人全血中新鲜分离PBMC用于冻存。
首先，对PBMC进行计数，然后取1x10^6细胞对应的PBMC细胞悬液于15mL离心管中，400g离心5分钟沉淀细胞，去上清液，然后将1mL 按上述方法配制的无血清冻存液加入离心管中，轻轻吹打7-8次重悬细胞，使细胞充分分散为单细胞悬液。
然后，将细胞悬液加入2mL的细胞冻存管中，旋紧管盖，放入程序冻存盒中，置于-80℃冰箱内冻存；冻存过夜后，将上述-80℃冻存的细胞转入到液氮中长期保存。
3、冻存效果验证
将上述细胞于液氮中冻存1周后，复苏细胞进行冻存效果的验证。
首先，将水浴调至37℃，待温度稳定后方可开始细胞复苏流程。具体为：
在生物安全柜内准备一支15 ml离心管，向离心管中加入9 ml预热的T细胞无血清培养基（购自Lonza，型号为X-Vivo-15 Cat. No. 04-418Q）备用。将细胞冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动冻存管并观察其中的冰块解冻情况。当冻存管中的冰块即将完全融化（约需要1分钟）时，将冻存管从水浴中移出并继续晃动使冰晶完全消失。
然后，将冻存管内的细胞悬液全部加入准备好的15 ml离心管内的9 ml预热培养基中，吸取离心管内1 ml液体将冻存管冲洗1次并加回离心管内（此步骤为避免细胞损失）。盖好离心管盖，轻轻颠倒4-5次混匀。400 g离心5 min 沉淀细胞，去除上清液，加入2mL体积的T细胞无血清培养基（购自Lonza，型号为 X-Vivo-15 Cat. No. 04-418Q）重悬并取出20uL对其中的细胞进行计数并计算存活率，结果参见图1。将剩余细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，添加终浓度10ug/mL的CD3抗体，终浓度5ug/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，并放入37℃、5%二氧化碳培养箱内继续培养。分别于培养的第0天和第3天拍摄细胞照片，参见图2和图3；并于培养第3天观察细胞增殖情况并对细胞进行计数，计数结果参见图4。
对比例1
本对比例选用的冻存液为传统的含血清冻存液，购自Gibco公司，型号为RecoveryTM细胞冻存液，Cat. No.12648010。其他参照实施例1的方式对人外周血单核细胞（PBMC）中T细胞进行冻存、复苏和培养，结果参见图1~4。
实施例2
1、本实施例采用的冻存液的具体配置方法如下：
使用IMDM和RPMI1640 两种培养基按体积比1:1混合配制成冻存液的基础培养基，然后向其中添加终浓度为1mmol/L的乙醇胺，5g/L的重组人胰岛素，20mg/L的重组人转铁蛋白，1g/L的重组人血清白蛋白，5mg/L的维生素C以及1g/L的Pluronic F-68 和 1g/L的Kolliphor P 188；最后向其中加入体积百分比为5%的DMSO，制得无血清冻存液。
2、将本例中的冻存液用于冻存激活后的T细胞，具体的冻存方法如下：
使用初次激活后培养到第9天的T细胞用于冻存。
首先，对激活第9天的T细胞进行计数，然后取1x10^6细胞对应的T细胞悬液于15mL离心管中，400g离心5分钟沉淀细胞，去上清液，将1mL 按上述方法配制的无血清冻存液加入离心管中，轻轻吹打7-8次重悬细胞，使细胞充分分散为单细胞悬液。
然后，将上述细胞悬液加入2mL的细胞冻存管中，旋紧管盖，放入程序冻存盒中，置于-80℃冰箱内冻存；冻存过夜后，将上述-80℃冻存的细胞转入到液氮中长期保存。
3、冻存效果验证
将上述细胞于液氮中冻存1周后，复苏细胞进行冻存效果的验证。
首先，将水浴调至37℃，待温度稳定后方可开始细胞复苏流程。具体为：
在生物安全柜内准备一支15 ml离心管，向离心管中加入9 ml预热的T细胞无血清培养基（购自Lonza，型号为X-Vivo-15 Cat. 04-418Q）备用。将细胞冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动冻存管并观察其中的冰块解冻情况。当冻存管中的冰块即将完全融化（约需要1分钟）时，将冻存管从水浴中移出并继续晃动使冰晶完全消失。
然后，将冻存管内的细胞悬液全部加入准备好的15 ml离心管内的9 ml预热培养基中，吸取管内1 ml液体将冻存管冲洗1次并加回管内（此步骤为避免细胞损失）。盖好离心管盖，轻轻颠倒4-5次混匀。400 g离心5 min 沉淀细胞，去除上清液，加入2mL体积的T细胞无血清培养基（购自Lonza，型号为X-Vivo-15 Cat. No. 04-418Q）重悬并取出20 uL对其中的细胞进行计数并计算存活率，结果参见图5。将剩余细胞悬液转移至准备好的6孔板培养皿中，添加终浓度10ug/mL的CD3抗体，终浓度5ug/mL的CD28抗体，及终浓度 100IU/mL的IL2，并放入37℃，5% 二氧化碳培养箱内继续培养。于培养的第6天拍摄细胞照片，结果参见图6所示；并于培养第6天观察细胞增殖情况并对细胞进行计数，计数结果参见图7。
对比例2
本对比例选用的冻存液为传统的含血清冻存液，购自Gibco公司，型号为RecoveryTM细胞冻存液，Cat. No.12648010。其他参照实施例2的方式对激活后的T细胞进行冻存、复苏和培养，结果参见图5~7。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种T细胞无血清冻存液，包括基础培养基、冻存保护剂及添加成分，其特征在于：所述添加成分为乙醇胺、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白、维生素C和细胞膜稳定剂。
2.根据权利要求1所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：按所述基础培养基和添加成分的总量计，所述添加成分为乙醇胺0.1~1mmol/L、胰岛素2.5~50mg/L、转铁蛋白5~100mg/L、人血清白蛋白0.2~5g/L、维生素C 1~100mg/L、细胞膜稳定剂0.5~5g/L。
3.根据权利要求1或2所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述胰岛素为重组人胰岛素。
4.根据权利要求1或2所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述转铁蛋白为重组人转铁蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述人血清白蛋白为重组人血清白蛋白。
6.根据权利要求1或2所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述细胞膜稳定剂为Pluronic F-68、Kolliphor P 188中的一种或二者组合。
7.根据权利要求1所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述冻存保护剂为DMSO，其添加体积量占所述冻存液总体积的2~10%。
8.根据权利要求1所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述基础培养基为IMDM、DMEM、DMEM/F12、aMEM、RPMI1640、M199中的一种或几种的混合。
9.根据权利要求8所述的T细胞无血清冻存液，其特征在于：所述基础培养基为IMDM、DMEM/F12、 RPMI1640中的二种或三种的混合物。
10.权利要求1~9中任一项权利要求所述的T细胞无血清冻存液的使用方法，其特征在于：将新鲜分离提取或正在扩增培养中的T细胞在离心管离心沉淀，去除上清液，然后将所述冻存液加入所述离心管中，重悬，得到细胞重悬液，将所述细胞重悬液转移到冻存管中，然后置于-78℃~-82℃冻存12~24h，然后再转入液氮中保存。
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