CN117736985A - 适用于干细胞样记忆t细胞培养的血液保存液及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液及其应用。每100mL所述血液保存液包括：肝素钠5～50mg、枸橼酸0.1～1g、腺嘌呤0.01～0.1g、磷酸氢二钠0.1～1g、葡萄糖1～10g、转铁蛋白0.1～10mg、羟丙基‑β‑环糊精0.1～10mg、乙醇胺0.1～10mg、硒酸钠0.1～10mg、α‑硫酸锌0.01～1mg、L‑抗坏血酸0.1～10mg、维生素E 0.1～10mg、胆固醇0.01～1mg、L‑谷氨酰胺0.1～10mmol、L‑蛋氨酸0.1～10mg/100mL、L‑盐酸赖氨酸0.1～10mg/100mL、L‑缬氨酸0.1～10mg/100mL、L‑异亮氨酸0.1～10mg/100mL、L‑苯丙氨酸0.1～10mg/100mL、L‑亮氨酸0.1～10mg/100mL、L‑色氨酸0.1～10mg/100mL、L‑苏氨酸0.1～10mg/100mL，溶剂为电解质溶液。本发明提供的血液保存液，为PBMC提供必要的营养及环境，可较长时间保存PBMC，且后续分离的PBMC中仍然具有扩增和培养TSCM的活力，培养得到的Tscm在CD3+T细胞中占比＞30％，为临床使用TSCM提供了保障。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保存技术领域，尤其涉及一种适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液及其应用。
背景技术
T细胞是淋巴细胞的主要组分之一，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助其它淋巴细胞发挥功能，对特异性抗原或促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子，是身体抵御病原体感染、防治肿瘤的主要免疫细胞。
T细胞根据其分化程度可分为初始T细胞，记忆T细胞，效应T细胞。记忆T细胞是维持人体免疫监视的基础，这对于肿瘤的预防和肿瘤手术后的预防复发至关重要。干细胞样记忆性T细胞(TSCM)属于T细胞的一个亚群。TSCM其既具有初始T细胞的特征，又具有记忆T细胞的特征，被认为具有自我更新并分化为其它效应和记忆T细胞亚群的能力。TSCM既具有产生细胞因子、快速增殖的记忆性T细胞的特征，又具有较强的存活、自我更新和多潜能分化能力的干细胞特征，其强大的生存能力克服了移植细胞体内存活时间不长的问题，且其自身可产生具有抗肿瘤作用的细胞因子，将有望成为过继性免疫治疗肿瘤的重要细胞来源。
血液保存液是保持血液中细胞活性的关键因素，目前广泛使用的是ACD保存液，它主要由酸性枸橼酸盐和葡萄糖等成分组成。然而，使用ACD保存液在4℃条件下保存的血液，24-28小时后分离PBMC，对分离的PBMC进行培养Tscm细胞，发现培养的Tscm已经难以培养出满足临床需求，其细胞数量和记忆表型达不到临床应用标准。因此，寻找一种能够有效保护TSCM活性特征的血液保存液，是TSCM研究和应用的迫切需求。
发明内容
本发明提供一种适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液及其制备方法和应用，用于满足在2～10℃下较长时间保存的PBMC可以培养出临床需求的TSCM。
本发明提供一种适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，每100mL血液保存液中包括：肝素钠5～50mg、枸橼酸0.1～1g、腺嘌呤0.01～0.1g、磷酸氢二钠0.1～1g、葡萄糖1～10g、转铁蛋白0.1～10mg、羟丙基-β-环糊精0.1～10mg、乙醇胺0.1～10mg、硒酸钠0.1～10mg、α-硫酸锌0.01～1mg、L-抗坏血酸0.1～10mg、维生素E 0.1～10mg、胆固醇0.01～1mg、L-谷氨酰胺0.1～10mmol、L-蛋氨酸0.1～10mg/100mL、L-盐酸赖氨酸0.1～10mg/100mL、L-缬氨酸0.1～10mg/100mL、L-异亮氨酸0.1～10mg/100mL、L-苯丙氨酸0.1～10mg/100mL、L-亮氨酸0.1～10mg/100mL、L-色氨酸0.1～10mg/100mL、L-苏氨酸0.1～10mg/100mL，溶剂为电解质溶液。
在一个优选实施例中，每100mL血液保存液中，所述肝素钠为30mg、所述枸橼酸为0.5g、腺嘌呤为0.05g、磷酸氢二钠为0.2g、葡萄糖为3g、转铁蛋白为2mg、羟丙基-β-环糊精为1mg、乙醇胺为0.5mg、硒酸钠为1mg、α-硫酸锌为0.1mg、L-抗坏血酸为2mg、维生素E为2mg、胆固醇为0.2mg、L-谷氨酰胺为2mmol、L-蛋氨酸为2mg/100mL、L-盐酸赖氨酸为2mg/100mL、L-缬氨酸为2mg/100mL、L-异亮氨酸为2mg/100mL、L-苯丙氨酸为2mg/100mL、L-亮氨酸为2mg/100mL、L-色氨酸为1mg/100mL、L-苏氨酸为2mg/100mL。
在一个优选实施例中，所述电解质溶液包括0.526％氯化钠、0.502％葡萄糖酸钠、0.368％醋酸钠、0.037％氯化钾、0.03％氯化镁。
在一个优选实施例中，所述干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液的pH值为7.0～7.5。
在一个优选实施例中，所述干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液的pH值为7.35～7.45。
在一个优选实施例中，所述血液保存液保存血液样本的温度为2～10℃。
在一个优选实施例中，所述血液保存液保存血液样本时，血液样本与所述血液保存液的体积比为100：14。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述方案中任意一项所述适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，所述试剂盒用于血液保存、PBMC细胞提取、TSCM扩增、TSCM培养和外泌体制备中的任意一项或多项。
本发明提供的一种适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，为PBMC提供必要的营养及环境，可较长时间保存PBMC，且后续分离的PBMC中仍然具有扩增和培养TSCM的活力，培养得到的Tscm在CD3+T细胞中占比＞30％，为TSCM的临床使用提供了保障。
同时，本发明还提供适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液的应用，其能够应用于血液保存、PBMC细胞提取、TSCM扩增、TSCM培养、外泌体等试剂盒中，通过维持TSCM的活性，提高上述试剂盒的效能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例的血液经保存5天后分离得到的PBMC扩增培养的Tscm细胞生长形态图；
图2是本发明实施例1及对比例2经保存5天后分离得到的PBMC扩增培养的Tscm细胞在CD3+T细胞中的流式分析结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在健康人群中TSCM约为2％～3％，而TSCM是过继性免疫治疗肿瘤的重要细胞来源之一。在血液保存过程中，存在运输、样品处理等可能需要在较长时间保存血液样品的因素，而现有ACD保存液保存的血液分离所得的PBMC，培养的TSCM无法满足临床需求。
经研究，本发明的第一方面提供了一种适用于TSCM培养的干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，每100mL该适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液包括：
肝素钠5～50mg、枸橼酸0.1～1g、腺嘌呤0.01～0.1g、磷酸氢二钠0.1～1g、葡萄糖1～10g、转铁蛋白0.1～10mg、羟丙基-β-环糊精0.1～10mg、乙醇胺0.1～10mg、硒酸钠0.1～10mg、α-硫酸锌0.01～1mg、L-抗坏血酸0.1～10mg、维生素E 0.1～10mg、胆固醇0.01～1mg、L-谷氨酰胺0.1～10mmol、L-蛋氨酸0.1～10mg/100mL、L-盐酸赖氨酸0.1～10mg/100mL、L-缬氨酸0.1～10mg/100mL、L-异亮氨酸0.1～10mg/100mL、L-苯丙氨酸0.1～10mg/100mL、L-亮氨酸0.1～10mg/100mL、L-色氨酸0.1～10mg/100mL、L-苏氨酸0.1～10mg/100mL，溶剂为电解质溶液。
其中，电解质溶液的组成为：包括0.526％氯化钠、0.502％葡萄糖酸钠、0.368％醋酸钠、0.037％氯化钾、0.03％氯化镁。
在血液培养液中，肝素钠为抗凝剂，能干扰血凝过程的许多环节，减少采集的血液发生血凝。枸橼酸可避免保存液中的葡萄糖在消毒中焦化。葡萄糖、羟丙基-β-环糊精、乙醇、硒酸钠、α-硫酸锌、L-谷氨酰胺、维生素E、胆固醇、蛋氨酸、盐酸赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸和苏氨酸是营养剂，为血液中各个细胞的正常代谢提供营养。采用电解质溶液，可维持例子渗透压及系统的平衡，形成有利于细胞存活的环境条件，有利于TSCM的保存。转铁蛋白可以和铁离子结合，将铁供给细胞，参与呼吸、DNA合成、氧化还原酶代谢等等生命活动。腺嘌呤可以维持细胞能量代谢和细胞信号传导等细胞功能，还可促进红细胞ATP合成，延长红细胞的保存期并增强红细胞放氧功能。磷酸二氢钠的加入便于后续用氢氧化钠溶液调整保存液的pH。
各个组分的含量可根据血液样品的类型、血液样品来源个体种类的差异、血液样品中细胞成分等因素调整。
血液保存液的pH值对血液活性具有较大影响，本实施例中的血液保存液采用弱碱性环境，pH值为7.0～7.5，优选pH值为7.35～7.45。此pH值范围相当于人体血液pH值。
在一个优选的方案中，100mL血液保存液中，所述肝素钠为30mg、所述枸橼酸为0.5g、腺嘌呤为0.05g、磷酸氢二钠为0.2g、葡萄糖为3g、转铁蛋白为2mg、羟丙基-β-环糊精为1mg、乙醇胺为0.5mg、硒酸钠为1mg、α-硫酸锌为0.1mg、L-抗坏血酸为2mg、维生素E为2mg、胆固醇为0.2mg、L-谷氨酰胺为2mmol、L-蛋氨酸为2mg/100mL、L-盐酸赖氨酸为2mg/100mL、L-缬氨酸为2mg/100mL、L-异亮氨酸为2mg/100mL、L-苯丙氨酸为2mg/100mL、L-亮氨酸为2mg/100mL、L-色氨酸为1mg/100mL、L-苏氨酸为2mg/100mL。
为了更好的说明本发明技术方案的技术效果，本发明构造了如下实施例和对比例进行测试。
实施例1
实施例1的适用于Tscm培养的血液保存液，配制100mL血液保存液所需各试剂如下：肝素钠30mg、枸橼酸0.5g、腺嘌呤0.05g、磷酸氢二钠0.2g、葡萄糖3g、转铁蛋白2mg、羟丙基-β-环糊精1mg、乙醇胺0.5mg、硒酸钠1mg、α-硫酸锌0.1mg、L-抗坏血酸2mg、维生素E 2mg、胆固醇0.2mg、L-谷氨酰胺2mmol、L-蛋氨酸2mg、L-盐酸赖氨酸2mg、L-缬氨酸2mg、L-异亮氨酸2mg、L-苯丙氨酸2mg、L-亮氨酸2mg、L-色氨酸1mg、L-苏氨酸2mg，溶剂为电解质溶液。
其中，血液保存液的pH 7.4。
血液保存液与血液样本体积比为14：100，血液样本保存温度为4℃。
其中电解质溶液的配置为：0.526％氯化钠、0.502％葡萄糖酸钠、0.368％醋酸钠、0.037％氯化钾、0.03％氯化镁。
实施例2
实施例2的适用于Tscm培养的血液保存液，配制100mL血液保存液所需各试剂如下：肝素钠30mg、枸橼酸0.5g、腺嘌呤0.05g、磷酸氢二钠0.2g、葡萄糖3g、转铁蛋白2mg、羟丙基-β-环糊精1mg、乙醇胺0.5mg、硒酸钠1mg、α-硫酸锌0.1mg、L-抗坏血酸2mg、维生素E 2mg、胆固醇0.2mg、L-谷氨酰胺2mmol、L-蛋氨酸2mg、L-盐酸赖氨酸2mg、L-缬氨酸2mg、L-异亮氨酸2mg、L-苯丙氨酸2mg、L-亮氨酸2mg、L-色氨酸1mg、L-苏氨酸2mg，溶剂为与实施例1相同的电解质溶液。
其中，血液保存液的pH 7.0。
血液保存液与血液样本体积比为14：100，血液样本保存温度为4℃。
对比例1
对比例1的血液保存液，配制100mL血液保存液所需各试剂如下：肝素钠30mg、枸橼酸0.5g、磷酸氢二钠0.2g、葡萄糖3g、L-抗坏血酸2mg、维生素E 2mg、L-蛋氨酸2mg、L-盐酸赖氨酸2mg、L-缬氨酸2mg、L-异亮氨酸2mg、L-苯丙氨酸2mg、L-亮氨酸2mg、L-色氨酸1mg、L-苏氨酸2mg，溶剂为与实施例1相同的电解质溶液。
其中，血液保存液的pH 7.4。
其中，血液保存液与血液样本体积比为14：100，血液样本保存温度为4℃。
对比例2
对比例2所采用的血液保存液为血库使用的血液保存液(ACD)。ACD与血液样本体积比为14：100，血液样本保存温度为4℃。
其中，实施例和对比例采用来源相同的血液进行处理，血液保存液和血液样品的体积比都为14：100，血液保存液和血液样品混合后的待处理液放于相同的环境，并进行以下实验进行检测。
实验1
使用Ficoll法(密度梯度离心法)对实施例1、2及对比例1、2的血液保存液保存0天和5天的外周血中提取外周血单个核细胞(PBMC)，并检测PBMC存活率，结果如表1所示。
表1.PBMC存活率对比表(％)
| 组别 | 保存0天 | 保存5天 |
| 实施例1 | 98.59±0.59 | 95.31±1.12 |
| 实施例2 | 98.72±0.78 | 93.38±1.03 |
| 对比例1 | 98.34±1.25 | 82.88±2.57 |
| 对比例2 | 98.52±0.57 | 56.51±1.52 |
其中，从上表数据可明显看出，采用本发明的实施例1、实施例2对应的血液保存液，保存至第5天时，PBMC存活率仍在90％以上，明显高于对比例1-2。故本发明提供的血液保存液，能够在不同pH条件下，实现对血液样本的长时间高效保存，提高PBMC存活率。
实验2
在实验1基础下，对所提取的PBMC进行Tscm细胞培养，并对其培养细胞形态、纯度进行记录，培养14天后检测总细胞存活率，结果如下表表2所示。
表2.培养14天后总细胞存活率对比表(％)
| 组别 | 保存0天 | 保存5天 |
| 实施例1 | 91.59±1.104 | 86.88±1.40 |
| 实施例2 | 91.82±2.17 | 84.79±0.99 |
| 对比例1 | 90.65±1.67 | 61.80±1.56 |
| 对比例2 | 91.65±2.04 | 22.77±1.95 |
其中，从上表表2数据可明显看出，采用ACD保存5天后的血液样本分离的PBMC扩增培养得到的总细胞存活率仅22.77％，即对比例2，其达不到临床使用需求；而采用本发明的实施例1、实施例2对应的血液保存液，经保存至第5天后的提取的PBMC，培养后14天后的总细胞存活率仍能达到80％以上，远远高于对比例2采用ACD保存液保存的结果。而采用对比例1仅能达到60％左右，也远低于本方案中实施例1及实施例2的血液保存液的效果。故本发明提供的血液保存液，能够在不同pH条件下，实现对血液样本的长时间高效保存，提高PBMC存活率。
其中，实验1及实验2的测试方法为：将收集到的PBMC或培养得到的总细胞进行AO/PI染色，采用细胞计数仪进行细胞计数，计算出细胞存活率。
如图1所示，从图像中可明显看出，采用本发明实施例1及实施例2的血液培养液进行培养，细胞培养出现明显的聚集，相比对比例1及对比例2有明显的扩增效果。
实验3
Tscm细胞占比检测
在PBMC培养14天后，收集实施例1和对比例2总细胞，采用流式细胞检测方法进行Tscm细胞(CD3+CD45RO-CD62L+)占比检测。对Tscm细胞(CD3+CD45RO-CD62L+)占比进行检测方法为：所用抗体为：APC-CD3抗体、Brilliant Violet 421-CD45RO抗体、Alexa700-CD62L抗体，采用多次分选。结果如图2所示。
从图2可得出，通过提取PBMC进行Tscm细胞扩增培养，培养14天后Tscm细胞(CD3+CD45RO-CD62L+)在CD3+T细胞中占比为33.1％，远高于对比例2的14.5％。故本发明实施例提供的适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液在pH 7.0～7.5之间，温度2～10℃的环境下仍能都能够取得较好的血液保存效果。且经本发明血液保存液保存5天后的血液提取的PBMC细胞仍然具有扩增培养TSCM的能力。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括如上所述的干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，该试剂盒能够应用于血液保存、PBMC细胞提取、TSCM扩增、TSCM培养、通过TSCM上清液制备外泌体等方面，通过其对血液中TSCM质量和数量的有效保存，提高PBMC细胞提取、TSCM扩增和培养、TSCM的外泌体提取等目的的高效实现。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，其特征在于，每100mL血液保存液包括：
肝素钠5～50mg、枸橼酸0.1～1g、腺嘌呤0.01～0.1g、磷酸氢二钠0.1～1g、葡萄糖1～10g、转铁蛋白0.1～10mg、羟丙基-β-环糊精0.1～10mg、乙醇胺0.1～10mg、硒酸钠0.1～10mg、α-硫酸锌0.01～1mg、L-抗坏血酸0.1～10mg、维生素E 0.1～10mg、胆固醇0.01～1mg、L-谷氨酰胺0.1～10mmol、L-蛋氨酸0.1～10mg/100mL、L-盐酸赖氨酸0.1～10mg/100mL、L-缬氨酸0.1～10mg/100mL、L-异亮氨酸0.1～10mg/100mL、L-苯丙氨酸0.1～10mg/100mL、L-亮氨酸0.1～10mg/100mL、L-色氨酸0.1～10mg/100mL、L-苏氨酸0.1～10mg/100mL，溶剂为电解质溶液。
2.根据权利要求1所述的适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，其特征在于，每100mL血液保存液中，所述肝素钠为30mg、所述枸橼酸为0.5g、腺嘌呤为0.05g、磷酸氢二钠为0.2g、葡萄糖为3g、转铁蛋白为2mg、羟丙基-β-环糊精为1mg、乙醇胺为0.5mg、硒酸钠为1mg、α-硫酸锌为0.1mg、L-抗坏血酸为2mg、维生素E为2mg、胆固醇为0.2mg、L-谷氨酰胺为2mmol、L-蛋氨酸为2mg/100mL、L-盐酸赖氨酸为2mg/100mL、L-缬氨酸为2mg/100mL、L-异亮氨酸为2mg/100mL、L-苯丙氨酸为2mg/100mL、L-亮氨酸为2mg/100mL、L-色氨酸为1mg/100mL、L-苏氨酸为2mg/100mL。
3.根据权利要求1或2所述的适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，其特征在于，所述电解质溶液包括0.526％氯化钠、0.502％葡萄糖酸钠、0.368％醋酸钠、0.037％氯化钾、0.03％氯化镁。
4.根据权利要求1所述的适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，其特征在于，所述干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液的pH值为7.0～7.5。
5.根据权利要求4所述的适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，其特征在于，所述干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液的pH值为7.35～7.45。
6.根据权利要求5所述的适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，其特征在于，所述血液保存液保存血液样本的温度为2～10℃。
7.根据权利要求6所述的适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，其特征在于，所述血液保存液保存血液样本时，血液样本与所述血液保存液的体积比为100：14。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～7中任意一项所述适用于干细胞样记忆T细胞培养的血液保存液，所述试剂盒用于血液保存、PBMC细胞提取、TSCM扩增、TSCM培养和外泌体制备中的任意一项或多项。
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2023
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