CN118272305A - 一种免疫细胞的培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种免疫细胞的培养基及其应用。所述培养基包括：200～1000U/mL IL‑2、10～100ng/mL IL‑4、10～100ng/mL IL‑15、2～20ng/mL抗CD3单克隆抗体、2～20ng/mL抗CD28单克隆抗体、0.5～20μM GSK‑3β抑制剂、0.1～10μM Wnt/β‑catenin信号通路激动剂、1～10μg/mL转铁蛋白、1～10μg/mL乙醇胺、1～10μg/mL水溶性胆固醇、1～10μg/mL胰岛素、1～10mM丙氨酸‑谷氨酰胺、1～10μg/mL L‑抗败血酸、1～10μg/mL牛磺酸、0.1～1μg/mL腐胺及RPMI 1640培养基。本发明的培养基，能够有效保持细胞的存活率，且能实现高效诱导记忆T细胞的增殖、扩增记忆T细胞的数量，培养基具有培养细胞成本低且细胞质量好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种免疫细胞的培养基、培养方法及其应用。
背景技术
免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，其在免疫细胞疗法中扮演着至关重要的角色。T细胞属于免疫细胞一种，T细胞被特异性的抗原物质激活后，进行增殖和分化，形成在功能上各异的两类细胞，即T免疫效应细胞和T记忆细胞。
记忆T细胞的形成分是由T细胞在抗原刺激下被活化，不断增殖形成大量效应T细胞，在抗原清除后，大部分效应T细胞死亡，而留存下来的T细胞则在机体内维持一定的数量，成为记忆T细胞。其中，记忆T细胞有以下几种表型：干细胞样记忆T细胞(Tscm)细胞、中枢记忆T细胞(Tcm)、效应记忆T细胞(Tem)。
记忆T细胞有自我更新及复制能力，会在下一次抗原入侵时再次将记忆中的杀毒方法再次调动出来，再次杀灭抗原。记忆细胞可在人体内存在数月，甚至几十年，能够在血液系统中长期存在，且具使人体避免受到相应病原体的二次侵入。
现有对记忆T细胞的体外培养，主要以AIM-V培养基为基础培养基，AIM-V培养基虽具有较全面的营养，但其价格相对高些，且现有培养基仍无法实现记忆T细胞在培养后细胞里具有较高占比。
因此，需要一种能有效培养免疫细胞且成本低廉的培养基。
发明内容
本发明提供一种免疫细胞的培养基及其应用，用以解决现有培养基成本高的问题，实现免疫细胞的低成本高效培养。
作为本发明的第一方面，本发明提供一种免疫细胞的培养基，所述培养基包括：200～1000U/mL IL-2、10～100ng/mL IL-4、10～100ng/mL IL-15、2～20ng/mL抗CD3单克隆抗体、2～20ng/mL抗CD28单克隆抗体、0.5～20μM GSK-3β抑制剂、0.1～10μM Wnt/β-catenin信号通路激动剂、1～10μg/mL转铁蛋白、1～10μg/mL乙醇胺、1～10μg/mL水溶性胆固醇、1～10μg/mL胰岛素、1～10mM丙氨酸-谷氨酰胺、1～10μg/mL L-抗败血酸、1～10μg/mL牛磺酸、0.1～1μg/mL腐胺及RPMI 1640培养基。
优选的，所述培养基包括：200U/mL IL-2、10ng/mL IL-4、20ng/mL IL-15、2ng/mLIL-21、20ng/mLα-GalCer、50ng/mL GM-CSF、0.2μM GSK-3β抑制剂、2μg/mL转铁蛋白、4μg/mL乙醇胺、2μg/mLβ-环糊精、1μg/mL胰岛素、1mM丙氨酸-谷氨酰胺、1μg/mL L-抗败血酸。
优选的，所述GSK-3β抑制剂包括IM-12、TWS119 TFA、KY19382、AZD2858、AR-A014418中一种或几种。
优先的，所述Wnt/β-catenin信号通路激动剂包括Wnt/β-catenin agonist 1、Wnt/β-catenin agonist 2、Wnt/β-catenin agonist 3、Wnt/β-catenin agonist 4、SKL2001中一支或几种。
优选的，所述培养基还包括1～10％自体血浆。
作为所述本发明的第二方面，本发明还请求保护上述免疫细胞的培养基的应用，具体为在记忆T细胞培养上的应用。
具体的，本发明还请求保护一种记忆T细胞的培养方法，所述方法包括：
获取待处理细胞；
基于上述任意一项所述培养基，培养所述待处理细胞，基于培养进度更换或补充所述培养基及1～10％自体血浆，直至到达预定的培养时间；
收集培养后的所述待处理细胞。
所述记忆T细胞的培养方法的优选方案为：所述待处理细胞浓度为3×106～8×106个/mL。
所述记忆T细胞的培养方法的优选方案为：所述待处理细胞为PBMC，所述培养时长为14天。
作为本发明的第三方面，本发明请求保护所述免疫细胞的培养基的具体应用，具体的，对应请求保护一种试剂盒，所述试剂盒包括如上述方案中任意一项的免疫细胞的培养基，所述试剂盒用于免疫细胞的培养或/和外泌体制备。
进一步的，所述试剂盒用于记忆T细胞的培养或/和外泌体制备。
本发明提供一种免疫细胞的培养基，该培养基包括限定范围内的IL-2、IL-4、IL-15、抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体GSK-3β抑制剂、Wnt/β-catenin信号通路激动剂、转铁蛋白、乙醇胺、水溶性胆固醇、胰岛素、氨酸-谷氨酰胺、L-抗败血酸、牛磺酸、腐胺及RPMI 1640培养基。该培养基以RPMI 1640培养基为基础培养基，配合转铁蛋白、氨基酸类、胰岛素及腐胺等，具有成本低、扩增速度快、能较好的保持细胞培养存活率的优点。
利用该培养基培养记忆T细胞，可实现体外大量扩增，且可有效提高记忆T细胞占比，实现记忆T细胞的高效培养，可满足临床需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1记忆T细胞培养形态图；
图2为对比例1记忆T细胞培养形态图；
图3为对比例2记忆T细胞培养形态图；
图4为实施例1中记忆T细胞占比流式检测图；
图5为对比例1中记忆T细胞占比流式检测图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
经研究，本发明提供一种免疫细胞的培养基，包括：所述培养基包括：200～1000U/mL IL-2、10～100ng/mL IL-4、10～100ng/mL IL-15、2～20ng/mL抗CD3单克隆抗体、2～20ng/mL抗CD28单克隆抗体、0.5～20μM GSK-3β抑制剂、0.1～10μM Wnt/β-catenin信号通路激动剂、1～10μg/mL转铁蛋白、1～10μg/mL乙醇胺、1～10μg/mL水溶性胆固醇、1～10μg/mL胰岛素、1～10mM丙氨酸-谷氨酰胺、1～10μg/mL L-抗败血酸、1～10μg/mL牛磺酸、0.1～1μg/mL腐胺及RPMI 1640培养基。
其中，在各组分中，RPMI 1640为基础培养基，含有多种细胞培养中必需营养成分，包括糖类、氨基酸、维生素、矿物质等。相比采用AIM-V(Gibco)基础培养基，采用RPMI 1640基础培养基价格更加低廉，可降低对应培养成本。同时，记忆T细胞作为悬浮细胞，更适合采用RPMI 1640进行培养。
IL-2、IL-4、IL-15的结合是能增加记忆T细胞增殖速度及促进其增殖。抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体用于扩增T细胞。GSK-3β抑制剂及Wnt/β-catenin信号通路激动剂相互协同，用于维持细胞的稳态，防止记忆T细胞的进一步分化。转铁蛋白可以和铁离子结合，为参加细胞繁殖的生命活动。胰岛素可刺激细胞生长，丙氨酸-谷氨酰胺作为细胞能源来源，为培养细胞提供重要能量来源。牛磺酸能增强T细胞的增殖。腐胺用于维持细胞渗透压平衡的作用。转铁蛋白、乙醇胺、胰岛素、丙氨酸-谷氨酰胺及L-抗败血酸、水溶性胆固醇对应用于为免疫细胞增殖提供营养及便于其转化，提供必要的免疫细胞生长和繁殖的生存环境。
本发明的无血清培养基，以RPMI 1640为基础培养基结合其余组分，各组分协同配合，可有效促进免疫细胞增殖，保证细胞的活率，尤其是可有效培养记忆T细胞，以其培养记忆T细胞，所得细胞存活率高且记忆T细胞占比高，同时培养基成本有效降低。
本发明还请求保护本方案的培养基的应用，具体应用可以为是在免疫细胞培养上的应用，如可以为对应的试剂盒，对应的试剂盒用于免疫细胞的培养和/或外泌体的制备，对应的试剂盒优选为应用在记忆T细胞的培养等。
作为本发明的细胞培养基的应用，本发明还请求保护了基于该培养的记忆T细胞培养方法，采用该培养基所培养出的记忆T细胞增殖速度快且增殖明显，且对应培养细胞存活率高。
为了更好的说明本发明技术方案的技术效果，本发明构造了如下实施例和对比例进行实验。
实施例1
本实施例1免疫细胞的培养基包括以下组分：基础培养基为RPMI-1640培养基，其余包含：700U/mL IL-2、10ng/mL IL-4、5ng/mL IL-15、20ng/mL抗CD3单克隆抗体、15ng/mL抗CD28单克隆抗体、5μM GSK-3β抑制剂、3μM Wnt/β-catenin信号通路激动剂、2μg/mL转铁蛋白、4μg/mL乙醇胺、5μg/mL水溶性胆固醇、1μg/mL胰岛素、1mM丙氨酸-谷氨酰胺、1μg/mLL-抗败血酸、4μg/mL牛磺酸、0.8μg/mL腐胺。
其中，本方案中所选择的GSK-3β抑制剂为TWS119 TFA，Wnt/β-catenin信号通路激动剂为SKL2001。对于本发明方案的培养基，采用PBMC细胞进行培养记忆T细胞进行测试。采用该培养基培养记忆T细胞的培养步骤如下：
S1:采用密度梯度离心法从人外周静脉血中分离PBMC；
其中，所选择的受试者为健康志愿者，无血液相关疾病。采用Ficoll法(密度梯度离心法)从健康志愿者抽取外周血，并从抽取的外周血中分离出PBMC。
在分离出PBMC后，检测并记录PBMC的存活率。
S2：将PBMC接种于T25培养瓶中，其中，接种细胞浓度为6×106个/mL，5mL/瓶。将接种后的培养瓶后置于二氧化碳培养箱内进行培养；
S3：在培养过程中，每2～3天补充一次新鲜配置的上述培养基并加入10％自体血浆，培养过程中根据细胞增殖情况将细胞转移到T75、T175、T225或1L细胞培养瓶或细胞培养袋中继续培养，合计培养14天；
S4：待培养结束后，收集培养后的所述待处理细胞；
在本方案中，基于培养的进度更换适宜的培养瓶或者培养袋，以保证足够的培养空间。同时，在培养过程中，由于细胞的增殖会导致原培养基营养成分被消耗，因此，在培养的过程中，每2-3天需对培养基进行补充，所补充的为新鲜配置的培养基，在补充培养基的同时，可加入一定量的自体血浆，以模拟一个体内环境，便于细胞的增殖生长。
在培养结束后，收集全部细胞。
对比例1
对比例1所采用的培养基，其包括以下组分：基础培养基为AIM-V培养基(Gibco，0870112DK)，其余包含700U/mL IL-2、10ng/mL IL-4、5ng/mL IL-15、20ng/mL抗CD3单克隆抗体、15ng/mL抗CD28单克隆抗体、5μM GSK-3β抑制剂、3μM Wnt/β-catenin信号通路激动剂。
其中，对比例1的培养方法及步骤与实施例1相同。
对比例2
对比例2与实施例1相比，其培养基组成只含以下组分：基础培养基为RPMI-1640培养基，其余包含700U/mL IL-2、10ng/mL IL-4、5ng/mL IL-15、20ng/mL抗CD3单克隆抗体、15ng/mL抗CD28单克隆抗体、5μM GSK-3β抑制剂、3μM Wnt/β-catenin信号通路激动剂。
其中，对比例2的培养方法及步骤与实施例1相同。
对上述实施例1、对比例1及对比例2进行以下实验进行测试。
实验1
使用Ficoll法(密度梯度离心法)从外周血中提取外周血单个核细胞(PBMC)，并检测PBMC存活率。
进行记忆T细胞的培养，培养14天后检测记忆T细胞形态及纯度以及总细胞的存活率。在培养过程中，分别对第0天、第5天、第10天及第14天的细胞形态进行拍照记录。
PBMC和培养14天后总细胞存活率检测方法如下：
将收集到的PBMC或总细胞进行AO/PI染色，采用细胞计数仪进行细胞计数，计算出细胞存活率，如下表表1。
表1、PBMC及培养14天后总细胞存活率表(％)
| 组别 | PBMC | 培养14天获得的总细胞 |
| 实施例1 | 99.12±0.42 | 90.02±1.90 |
| 对比例1 | 99.12±0.42 | 78.29±2.64 |
| 对比例2 | 99.12±0.42 | / |
结合附图1-3，其中，附图1为实施例1培养过程中的细胞形态，附图2为对比例1的细胞形态，附图3为对比例2的细胞形态。
对于对比例2，在其培养基体系中，培养至第5天后细胞出现空泡化死亡情况，故不再进行后续培养及检测。
如图1所示，从图1可得出，从第5天开始出现有少量悬浮细胞，在第10天出现有较明显的扩增效果，在第14天则出现大量增殖情况。
而在对比例1中，第5天则出现有小片团聚情形出现，增殖速度相比较实施例1更快，在第10天细胞之间出现有较明显的粘连现象，而到第14天出现明显团聚，细胞之间相互粘连，细胞的悬浮性下降，且对比例1培养基的细增殖后由于出现明显聚团，内部细胞缺氧导致细胞存活率下降。
综合表1及图1-3，可得出，相比对比例1及对比例2，本发明采用实施例1的培养基，其在培养14天后总细胞存活率能达90％，细胞存活率高，且其培养基成本仅是AIM-V培养体系的1/3。
而相比对比例2，其在不添加转铁蛋白等组分条件下，无法满足细胞生长需求。
记忆T细胞纯度检测方法如下：
PBMC经培养14天后，收集总细胞进行记忆表型检测。具体为采用流式细胞检测方法对收集到的细胞做检测。
采用流式细胞检测方法对收集的细胞中干细胞样记忆T细胞(Tscm)细胞、中枢记忆T细胞(Tcm)、效应记忆T细胞(Tem)、效应T细胞(Teff)的占比进行检测，所用抗体为：PerCP-Cy5.5anti-human CD3抗体、Brilliant Violet 510TManti-human CD95(Fas)抗体、Brilliant Violet 421anti-human CD45RO抗体、PE anti-human CD62L抗体。
其中，Tscm表型为CD3+CD95+CD62L+CD45RO-；
Tcm表型为CD3+CD95+CD62L+CD45RO+；
Tem表型为CD3+CD95+CD62L-CD45RO+；
Teff表型为CD3+CD95+CD62L-CD45RO-。
检测结果如图4-5及图2所示。
表2、各实验组记忆T细胞占比
从图4-5及上表表2可看出，本发明所培养的细胞中表达CD3+CD95+T的细胞占比远高于对比例1，而在所得的记忆T细胞中，实施例1所得的记忆T细胞中，其中，Tscm细胞占比相比对比例更低，而Tcm占比更多，而Tscm细胞能够自我更新并分化为Tcm、Tem细胞，也表明，本方案实施例1的培养基体系，更能促进记忆T细胞增殖分化。
通过本发明实施例1中的培养基，其所培养的记忆T细胞在总细胞占比可达90％以上，高于AIM-V培养体系。
本发明实施例1的培养基能够实现记忆T细胞的有效扩增，为后续记忆T细胞的研究及临床使用等提供保障。
综上，本发明的免疫细胞的培养基，能够有效保持细胞的存活率，且能实现高效诱导记忆T细胞的增殖、扩增记忆T细胞的数量，培养基具有培养细胞成本低且细胞质量好的优点。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括如上所述的免疫细胞的培养基，该试剂盒能够应用记忆T细胞培养、上清液外泌体制备等方面。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种免疫细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括：200～1000U/mL IL-2、10～100ng/mL IL-4、10～100ng/mL IL-15、2～20ng/mL抗CD3单克隆抗体、2～20ng/mL抗CD28单克隆抗体、0.5～20μM GSK-3β抑制剂、0.1～10μM Wnt/β-catenin信号通路激动剂、1～10μg/mL转铁蛋白、1～10μg/mL乙醇胺、1～10μg/mL水溶性胆固醇、1～10μg/mL胰岛素、1～10mM丙氨酸-谷氨酰胺、1～10μg/mL L-抗败血酸、1～10μg/mL牛磺酸、0.1～1μg/mL腐胺及RPMI1640培养基。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括：700U/mLIL-2、10ng/mL IL-4、5ng/mL IL-15、20ng/mL抗CD3单克隆抗体、15ng/mL抗CD28单克隆抗体、5μMGSK-3β抑制剂、3μM Wnt/β-catenin信号通路激动剂、2μg/mL转铁蛋白、4μg/mL乙醇胺、5μg/mL水溶性胆固醇、1μg/mL胰岛素、1mM丙氨酸-谷氨酰胺、1μg/mL L-抗败血酸、4μg/mL牛磺酸、0.8μg/mL腐胺。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞的培养基，其特征在于，所述GSK-3β抑制剂包括IM-12、TWS119 TFA、KY19382、AZD2858、AR-A014418中一种或几种。
4.根据根据权利要求1所述的免疫细胞的培养基，其特征在于，所述Wnt/β-catenin信号通路激动剂包括Wnt/β-catenin agonist 1、Wnt/β-catenin agonist 2、Wnt/β-cateninagonist 3、Wnt/β-catenin agonist4、SKL2001中一支或几种。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞的培养基，其特征在于，所述培养基还包括1～10％自体血浆。
6.一种记忆T细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：
获取待处理细胞；
基于所述权利要求1-4中任意一项所述培养基，培养所述待处理细胞，基于培养进度更换或补充所述培养基及1～10％自体血浆，直至到达预定的培养时间；
收集培养后的所述待处理细胞。
7.根据权利要求6所述的记忆T细胞的培养方法，其特征在于，所述待处理细胞浓度为3×106～8×106个/mL。
8.根据权利要求6所述的记忆T细胞的培养方法，其特征在于，所述待处理细胞为PBMC，所述培养时长为14天。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任意一项培养基，所述试剂盒用于免疫细胞的培养或/和外泌体制备。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于记忆T细胞的培养或/和外泌体制备。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118272305A true CN118272305A (zh) | 2024-07-02 |
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