JP4268209B2 - 子宮内膜細胞を用いた造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法 - Google Patents

Description

本発明は造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法に係り、詳しくは、造血幹細胞または前駆細胞をヒト子宮内膜由来の間質細胞または上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）と共培養（ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ）することにより、造血幹細胞由来のＣＤ３４^＋細胞の増幅または前駆細胞の成長を促すことを特徴とする造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法に関する。

造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）または前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）は臍帯血から由来し、赤血球、白血球、血小板など血球細胞に分化できる細胞である。また、この種の細胞は、幹細胞の特徴とも言える自己複製能力（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）、高い細胞分裂能（ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、多分化能（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）などを有している（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｏｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：１４３９，２０００）。

現在、臍帯血を用いた造血幹細胞または前駆細胞の移植は臨床的に活性化しており、特に、高用量の化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）後のガン患者が悪性造血状態であり、自己組織の細胞が適合ではなく、さらには、成人の供与者（ｄｏｎｏｒ）がいないとき、造血幹細胞または前駆細胞は移植の重要な供給源として認められている。さらに、このような造血幹細胞または前駆細胞の移植を通じて各種の疾病が治療されている。例えば、急性及び慢性白血病、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫など、主として血液ガン関係の疾患の治療に造血幹細胞または前駆細胞の移植が試みられてきており、最近には、乳ガン、卵巣ガン、腎臓ガン、小細胞性肺ガンなどの固形ガン；不応性全身性紅斑性狼瘡、不応性リウマチ性関節炎などの悪性自己免疫疾患；及びクラベ病（Ｋｒａｂｂｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）のような難治病にも良好な治療効果を示している（Ｌｅｎｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＪ，３２１：４３３，２０００，Ｉｋｅｈａｒａ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２９：６６１，２００１）。

しかしながら、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）の臍帯からは少量の血液しか得られないため、結果的に得られる造血幹細胞または前駆細胞の量は必然的に制限される。非増幅状態で、造血幹細胞または前駆細胞の移植はほとんど児童患者に限られて行われる。このため、過去十年間、骨髄だけではなく、臍帯血由来のヒト造血幹細胞または前駆細胞の試験管内の増幅（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）への関心が高まる一方である（Ｃａｉｒｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９０：４６６５，１９９７、Ｍａｙａｎｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１６：１５３，１９９８）。

この理由から、造血幹細胞または前駆細胞の移植のためには、所望の造血幹細胞または前駆細胞を大量に得る技術の開発が極めて切望されている。この種の造血幹細胞または前駆細胞を大量に増幅するために、各種の方法及び最適な培養条件への開発が試みられてきている。

今まで知られている代表的な培養方法として、体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）において各種の組換え刺激性サイトカイン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を培地に加えて培養する方法（Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，５５：７５，２００１，Ｉａｎ ＭｃＮｉｅｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２９：３，２００１）、造血阻害因子（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に対する抗体を用いる方法及び他の間質細胞株（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を用いる方法（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９：１７４，２００１）が挙げられる。

造血幹細胞または前駆細胞の臨床移植に当たり、これらの培養に用いられるサイトカインは、各種の問題を引き起こす恐れがある。例えば、その副作用によって、感染の危険性や腫瘍発生の可能性がある。例えば、ＩＬ−２の使用は激しい低血圧の症状の誘発と急性毛細血管漏出症候群（ａｃｕｔｅ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｌｅａｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの深刻な副作用の原因になるため、その使用が制限されている。急性毛細血管漏出症候群は、毛細血管から漏れ出た組織液が組織に蓄積される現象である（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３７：１７３５，１９８６）。今まで発表されているほとんどの研究においては、ＣＤ３４^＋細胞を分離するために、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いたが、この蛍光活性化細胞選別装置を用いてＣＤ３４^＋細胞を分離する作業には、多額の費用と多くの手間がかかる。

このような従来の技術における不具合を解決するために、本発明者らは、既存の蛍光活性化細胞選別装置を用いることなく、ＣＤ３４^＋造血幹細胞または前駆細胞を高純度にて分離した後、分離された造血幹細胞または前駆細胞をサイトカインや血清など人為的なホルモンを用いることなく、ヒト子宮内膜の間質細胞または上皮細胞と共培養することにより、短期間に効率よく増幅できるということを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の主たる目的は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞または前駆細胞をサイトカインや血清などの人為的なホルモンを用いることなく、ヒト子宮内膜の間質細胞または上皮細胞と共培養することを特徴とする造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）臍帯血、骨髄、末梢血液または胚性幹細胞由来の造血幹細胞または前駆細胞を培養する段階と、（ｂ）子宮組織由来の子宮内膜の間質細胞または上皮細胞を培養する段階と、（ｃ）前記（ａ）段階において培養された造血幹細胞または前駆細胞と前記（ｂ）段階において培養された子宮内膜の間質細胞または上皮細胞を共培養する段階と、を含む造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法を提供する。

本発明において、前記造血幹細胞または前駆細胞は、好ましくは（ａ）臍帯血、骨髄、末梢血液または胚性幹細胞から得られた単核球（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）または前駆細胞を単層培養、浮遊培養、または共培養する段階と、（ｂ）前記単層培養、浮遊培養または共培養された細胞を造血幹細胞または前駆細胞の特異抗原に対する抗体と反応させる段階と、（ｃ）前記抗体と結合された細胞を細胞選別装置またはカラムを用いて分離する段階と、を経て得られる。

本発明において、前記子宮内膜の間質細胞または上皮細胞は、好ましくは（ａ）コラゲナーゼが含まれた細胞培養培地に細切りした子宮組織を入れて培養する段階と、（ｂ）前記培養された細胞を３０〜５０μｍの細網目を有する布篩（ｃｌｏｔｈ ｓｉｅｖｅ）に通させ、布篩の上部に残った上皮細胞を得る段階と、（ｃ）前記（ｂ）段階において布篩を通った細胞を細胞培養皿において培養した後、細胞培養皿を培養液により洗浄して細胞培養皿に付着している間質細胞を分離する段階と、を経て得られる。

本発明に係る造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法において、前記造血幹細胞の特異抗原に対する抗体は、ＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻、Ｔｈｙ１．１^＋、ｌｉｎ⁻、ＣＤ４５^＋、またはＫＤＲ^＋に対する抗体であり、前記前駆細胞の特異抗原に対する抗体は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｗｎｔ、Ｓｔａｔ３、アルカリ性ホスファターゼ、またはＳＳＥＡ−１に対する抗体であることが好ましい。前記抗体に蛍光物質または磁性マイクロビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）が付着したもの、例えば、磁性マイクロビーズが付着したＣＤ３４^＋抗体を用いることが可能である。

本発明において、前記細胞選別装置は、蛍光活性化細胞選別装置のかわりに、磁性細胞選別装置であることが好ましく、前記カラムは、磁性カラムであることが好ましい。前記過程を経て得られる細胞は、臍帯血由来のＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻細胞である。

また、本発明に係る造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法において、共培養は１〜１２０時間、好ましくは、１２〜９６時間行われ、無血清または血清培地、好ましくは、無血清培地において行われることが好ましい。

さらに、別の観点として、本発明は、前記方法により培養及び増殖され、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ１１７、ＣＤ４５及びＫＤＲに対する抗体に対して１以上の陽性反応を示し、ＣＤ３８とｌｉｎに対する抗体に対して陰性反応を示すことを特徴とする造血幹細胞を提供する。

さらに、別の観点として、本発明は、前記方法により培養及び増殖され、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｗｎｔ、Ｓｔａｔ３、アルカリ性ホスファターゼ及びＳＳＥＡ−１に対する抗体に対して１以上の陽性反応を示す前駆細胞を提供する。

本発明の他の特徴及び実施態様は、次の詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになる。

正の淘汰後、ＣＤ３４^＋細胞を免疫組織化学染色法により定量して顕微鏡を使って観察した写真であり、Ａ及びＢは１００倍拡大写真であり、Ｃ及びＤは２００倍拡大写真である。 ＣＤ３４^＋の濃縮された細胞を子宮内膜の間質細胞と共培養し、ここにサイトカインを処理して経過時間ごとの細胞数を観察したグラフである。図２ａ−２ｄは、それぞれ２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間後の結果を示している。各図の１〜５は造血幹細胞を単独培養した場合であり、６〜１０は共培養した場合である（１：陰性対照群、２：ＥＰＯ添加群、３：ＩＬ−３添加群、４：ＧＭ−ＣＳＦ添加群、５：ＥＰＯ＋ＩＬ−３＋ＧＭ−ＣＳＦ添加群、６：添加せず、７：ＥＰＯ添加、８：ＩＬ−３、９：ＧＭ−ＣＳＦ、１０：ＥＰＯ＋ＩＬ−３＋ＧＭ−ＣＳＦ） ＣＤ３４^＋濃縮された細胞を乳房繊維芽細胞（ｂｒｅａｓｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ）または子宮内膜の間質細胞と共培養し、ここにサイトカインを処理して経過時間ごとの細胞数を観察したグラフである。図３ａおよび３ｂは、それぞれ２４時間および４８時間後の結果を示している。各図の１〜４は造血幹細胞を単独培養した場合であり、５〜８は乳房繊維芽細胞と共培養した場合であり、そして９〜１２は子宮内膜の間質細胞と共培養した場合である（１：陰性対照群、２：ＩＬ−３添加群、３：ＬＩＦ、４：ＩＬ−３＋ＬＩＦ添加群、５：添加せず、６：ＩＬ−３添加群、７：ＬＩＦ添加群、８：ＩＬ−３＋ＬＩＦ添加群、９：添加せず、１０：ＩＬ−３添加群、１１：ＬＩＦ添加群、１２：ＩＬ−３＋ＬＩＦ添加群）。

発明の詳細な説明

本発明は、臍帯血からＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻細胞が濃縮された造血細胞群を免疫−磁気的な方法を用いて分離し、これを子宮内膜の間質細胞または上皮細胞と共培養して増幅することのできる造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法に関する。

本発明において、臍帯血とは、ヒトを含む哺乳動物において胎盤と胎児を連結する臍帯靜脈から採血された血液として定義され、本発明に係る造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法においては、ヒトの臍帯血を用いることが好ましい。

前記免疫−磁気的な方法を用いた細胞分離には、造血幹細胞または前駆細胞から発現される細胞表面抗原に対する抗体のうちから選ばれた１以上の抗体（造血幹細胞の特異抗原に対する抗体：ＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻、Ｔｈｙ１．１^＋、ｌｉｎ⁻、ＣＤ４５^＋またはＫＤＲ^＋に対する抗体、前駆細胞の特異抗原に対する抗体：Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｗｎｔ、Ｓｔａｔ３、アルカリ性ホスファターゼまたはＳＳＥＡ−１に対する抗体）が使用可能であるが、造血幹細胞の場合、ＣＤ３４^＋抗原に対する抗体を用いることが一層好ましい。

また、前記抗体は通常の細胞分離方法に従い、適宜な標識物質を付けて用いることができる。磁性細胞選別装置（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）または磁性カラムを用いるときには、磁性マイクロビーズが付着した抗体を用い、ＦＡＣ選別装置を用いる場合には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、フィコエリトリン（ＰＥ：ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＰｅｒＣＰなどの蛍光物質が付着した抗体を用いることが好ましい。細胞表面抗原に対する抗体と一定時間だけ反応させた後、選別装置またはカラムを通じて該当抗体と結合された細胞を分離する。前記分離された細胞は臍帯血由来のＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻細胞を表面に発現する造血幹細胞であって、本発明においては、これをＣＤ３４^＋細胞と称する。

本発明の好適な様態においては、蛍光活性化細胞選別装置ではなく、磁性マイクロビーズに基づく免疫磁性カラム（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｏｌｕｍｎｓ）によりＣＤ３４^＋細胞を分離し、細胞培養培地において安定化させる。本発明の細胞分離の全過程は、無菌環境下で行われることが好ましい。

前記過程を経て得られた細胞の活性は、蛍光活性化細胞選別装置により分離された細胞の活性に比べて遥かに高く、しかも、分離にコストと時間をあまり取らない。この理由から、このような過程は臨床的な移植のための造血幹細胞または前駆細胞を調整する過程として一層好適である。

本発明において、造血幹細胞または前駆細胞とは、血液をなす細胞であって、赤血球、白血球、血小板を作り出す先祖細胞を言う。この造血幹細胞または前駆細胞は血液疾患や免疫疾患、ガンなどを治療する上で重要な役割を果たし、このような造血幹細胞または前駆細胞は、骨髄、末梢血液、臍帯血、胚性幹細胞などから分離可能である。本発明において使われた“前駆細胞”という用語は骨髄、臍帯血、胚、脂肪などから由来した幹細胞を包括することと定義する。

本発明において使われる子宮内膜の間質細胞または上皮細胞は、ヒトを含む哺乳動物の子宮内膜組織を初代培養（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ）〜１０継代培養することにより得ることができる。子宮内膜組織は、好ましくは、ヒトから摘出された子宮から得ることができ、さらに好ましくは、３０日以内にいかなるホルモン治療も受けていない増殖期（５−１４日）と分泌期（１５−２６日）の女性から摘出された子宮から得ることができる。

前記子宮内膜組織から上皮細胞と間質細胞を分離する方法は、下記の通りである。（１）コラゲナーゼが含まれている細胞培養培地に細切りした子宮組織を入れて３７℃において２〜３時間培養する。（２）前記培養された細胞を１００〜２００μｍの細網目を有する布篩に通させる。（３）前記布篩を通った細胞をさらに３０〜５０μｍの細網目を有する布篩に通させる。このとき、上皮細胞は布篩の上に残り、間質細胞は布篩を通ることになる。（４）前記（３）段階において布篩を通った細胞を細胞培養皿において培養させ、培養１時間後に細胞培養皿を培養液により洗浄することにより、細胞培養皿に付着している子宮内膜の間質細胞を分離する。

本発明において分離された臍帯血由来のＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻細胞、子宮内膜の間質細胞または上皮細胞は、インシュリン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、セレニウム（ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）などを細胞培養培地、すなわち、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙｓ ５Ａ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ ｂａｓａｌ培地、ＣＭＲＬ培地、Ｇｌａｓｇｏｗ最小必須培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ’ Ｌ−１５培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｍ１９９／Ｆ１２など広く用いられている細胞培養用培地のうちから選ばれたいずれか一種に加えて保持しながら用い、臍帯血由来のＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻細胞培養液の場合にはＲＰＭＩ１６４０を、そして子宮内膜の間質細胞または上皮細胞培養液の場合にはＭ１９９／Ｆ１２を用いることが好ましい。

また、本発明において用いられる細胞培養培地は、前記成分の他にも、必要に応じて一種以上の補助成分をさらに含むことができる。例えば、馬、牛またはヒトなどの血清、微生物の汚染を防ぐためにペニシリンＧ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ）、ストレプトマイシンサルフェート（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、アンフォテリシンＢ（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、ナイスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）などの抗生剤及び抗真菌剤（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｇｅｎｔ）などを追加することができる。

本発明の好適な様態においては、子宮内膜の間質細胞の場合にＦＢＳ、インシュリン、トランスフェリン、セレニウム、牛血清アルブミン、リノレン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン及び アンフォテリシンＢが含まれたＭ１９９／Ｆ１２培地において培養する。また、上皮細胞の場合には以上と同じ培地を用いるが、ＦＢＳの代わりにＢＰＥが含まれている培地を用いて培養する。

また、本発明に係る造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法において、臍帯血由来のＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻細胞群と子宮内膜の間質細胞または上皮細胞との共培養は、前記の方法により得られた１次子宮内膜の間質細胞または上皮細胞を無血清または血清培地において培養し、用意された子宮内膜の間質細胞または上皮細胞に臍帯血由来のＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻細胞を接種して行われることが好ましい。子宮内膜の間質細胞とＣＤ３４^＋細胞の割合は、１〜５：１であることが好ましい。

前記共培養は、細胞の移植のためのサイトカインや血清を添加しない状態で１〜１２０時間、好ましくは、２４〜９６時間行う。この場合、子宮内膜の間質細胞または上皮細胞から分泌される刺激物質（ｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）に影響されて、臍帯血由来のＣＤ３４^＋及びＣＤ３８⁻細胞が増殖される。

本発明の実施の形態において、共培養を行っていない陰性対照群及びヒト乳房繊維芽細胞と共培養した陽性対照群と比較して、ヒト子宮内膜の間質細胞または上皮細胞と共培養した場合に最も優れた造血幹細胞または前駆細胞の増殖効果が得られた。また、ヒトの子宮間質細胞のように造血幹細胞または前駆細胞を共培養する場合、既存の成長因子を添加する場合と比較して成長が一層促進されたり、それとも、ほとんど同様な成長速度を示した。

このため、本発明に係る造血幹細胞または前駆細胞の細胞培養及び増殖方法は、臨床的な移植に用いるための安全な造血幹細胞または前駆細胞の生産に用いることができ、これを発展させて、現在臍帯血の保管銀行に冷凍保管されている臍帯血の再生及び増殖に用いることもできる。

以下、実施例を挙げて本発明を一層詳述する。しかし、これらの実施例は単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されると解釈されてはならない。

特に、下記の実施例においては、臍帯血由来の造血幹細胞または前駆細胞のみを例示しているが、骨髄、末梢血液、胚性幹細胞などから由来したものを用いても同様の結果または類似した結果が得られるということは当業者にとって自明である。

また、下記の実施例においては臍帯血由来のＣＤ３４^＋に対する抗体に陽性反応を示す造血幹細胞のみを例示しているが、ＣＤ１３３、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ１１７、ＣＤ４５またはＫＤＲに対する抗体に陽性反応を示すか、あるいは、ＣＤ３８とｌｉｎに対する抗体に陰性反応を示す造血幹細胞を用いることができる（Ｋａｚｕｔａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２１：１４３，２００３，Ｙｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３：４４４９，２００４，Ｋａｔｈａｒｉｎａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，３４３：８５，２００４，Ｃｅｒｄａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３：２５０４，２００４，Ｎａｏｙｕｋｉ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０８：１０７１，２００１，Ｋａｒｅｎ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：２６８，２００４）。

併せて、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｗｎｔ、Ｓｔａｔ３、アルカリ性ホスファターゼまたはＳＳＥＡ−１に対する抗体に陽性反応を示す前駆細胞を用いることも可能である（Ａｎｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８５：６３５，２００５，Ａｂｅｙｔａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１３：６０１，２００４）。

《実施例１：細胞の収集（Ｃｅｌｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）》
臍帯血は、ソウル大学病院臨床試験倫理委員会のガイドライン（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ） ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に基づき、ソウル大学病院と三星第一病院における満期産（ｆｕｌｌ−ｔｅｒｍ）と早期産（ｐｒｅｔｅｒｍ）において集めた。

血液はクエン酸塩−リン酸−デキストロース抗凝血剤（ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ；ＣＰＤＡ）が含まれている２５０ＭＬの標準血液収集袋（ｓｔａｎｄａｒｄ ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｂａｇ；緑十字、韓国）に集められた。

《実施例２：ＣＤ３４ ^＋ 細胞濃縮（ＣＤ３４ ^＋ ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）》
免疫−磁気システム（ｉｍｍｕｎｏ−ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）を用いたポジティブセレクション（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により得られた単核球から濃縮されたＣＤ３４^＋細胞を製造会社の使用説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈｍ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従い用意した。

すなわち、単核球（５０×１０^６個／ｍＬ）にブロッキング試薬（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）と抗ＣＤ３４^＋マイクロビーズを加えた後、反応（３０分間、４℃）させた。細胞は磁石の存在下でプラスチックカラムを通し、ラベルされた所望とする細胞はカラムに静置させ、ラベルされていない細胞はＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）が入っているプラスチックチューブに集めた。全過程は無菌作業フード（ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ）において行われた。次いで、細胞を遠心分離して培養培地に再浮遊させ、計数した。

《実施例３：ＣＤ３４ ^＋ 細胞の定量》
ポジティブセレクションの後、ＣＤ３４^＋細胞は直ちに免疫細胞化学法（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により同定されて定量化された。このために、商用化キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈｍ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＣＤ３４^＋抗原に対する特異な単一クロン抗体（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用い、製造社の指示に従って全過程を行った。

《実施例４：子宮内膜組織（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ ｔｉｓｓｕｅ）の用意》
子宮組織は正常的な生理周期を経ており、且つ、子宮摘出術を受けた女性から供与された。３０日以内にいかなるホルモン治療も受けていない増殖期（５−１４日）と分泌期（１５−２６日）の女性から２〜３ｇの子宮組織を得た。また、これら組織は三星第一病院の臨床試験倫理委員会（ＩＲＢ）の承認を得て研究用として用いた。

子宮内膜組織は１０％のＦＢＳ、２００単位のペニシリン、０．２ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び０．５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢが含まれているＭ１９９／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）培地に入れてから実験室まで移った。

《実施例５：子宮内膜の間質細胞及び表皮細胞の分離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ）》
実験室まで移された子宮組織をハンクスＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ ＢＳＳ）中で洗浄し、血球細胞と各種の組織の残骸を除去した。上皮細胞と間質細胞の分離はサチャスワループら（Ｓａｔｙａｓｗａｒｏｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，４８：６３９，１９７９）とジュリアら（Ｊｕｌｉａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ，１６：８３６，２００１）の方法を僅かに修正してから行った。

組織６００ｇを軽く遠心分離して上澄み液を除去し、組織を１００ｍｍのディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）に載置し、滅菌済みメスを用いて１−２ｍｍの大きさに細切りした。その後、２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）が含まれているＭ１９９／Ｆ１２培地に入れ、３７℃の攪拌培養器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において２時間３０分間反応させた後、１００ワイヤ布篩（１４０μｍのサイズ、Ｎｅｗａｒｋ ＷｉｒｅＣｏ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用い、コラゲナーゼが処理された組織を篩分けした。このとき、コラゲナーゼ処理（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）がまだ終わっていない組織団塊は布篩の上に残り、１００ワイヤ布篩を通った細胞はさらに４００ワイヤ布篩（３７μｍ）に通させた。このとき、上皮細胞は布篩の上に残り、間質細胞は布篩を通ることになる。

このようにして分離された間質細胞と上皮細胞は１００ｍｍのディッシュに３７℃、５％のＣ０_２の条件下で培養した。間質細胞は上皮細胞に比べてディッシュの表面に素早く付着し、１時間後には全て付着するのに対し、上皮細胞は１時間が経ってもディッシュの表面に付着しなかった。このような性質を用い、培養１時間後に洗い流す（ｗａｓｈｉｎｇ）ことにより、上皮細胞と間質細胞を分離した。

《実施例６：子宮内膜の間質細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）》
間質細胞はジュリアら（Ｊｕｌｉａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ，１６：８３６，２００１）の方法に基づき、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．６２μｇ／ｍＬのインシュリン、０．６２μｇ／ｍＬのトランスフェリン及び０．６２ｎｇ／ｍＬのセレニウム、１２５μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン、５２．６μｇ／ｍＬのリノレン酸、１００単位のペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢが含まれているＭ１９９／Ｆ１２培地において培養した。これに対し、上皮細胞の場合には、上記と同じ培地を用いたが、１０％のＦＢＳに代えて２ｍＬ／ＬのＢＰＥが含まれている培地を用いて培養した。培地は２日おきに１回ずつ交換した。

《実施例７：ＣＤ３４ ^＋ 濃縮された細胞と子宮内膜の間質細胞の共培養（Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ＣＤ３４ ^＋ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）》
２４−ウェル培養フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に２×１０^５個の間質細胞を平板培養し、間質細胞が９０％のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）を遥かに上回った時点で、ＣＤ３４^＋細胞を接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。共培養する時点で、間質細胞は臍帯血由来のＣＤ３４^＋細胞を加える前に５回に亘ってＰＢＳにより洗浄した。予め無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）において３７℃の温度条件下及び５％のＣＯ_２雰囲気下で培養した初代間質細胞の単層培養（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）に１．５×１０^５個の臍帯血由来のＣＤ３４^＋細胞を接種した。増殖率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を比較するために、初代培養によって得られたヒト乳房繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ）を同じ方法により共培養した。

共培養時に付着した間質細胞と繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）から分泌される因子（ｆａｃｔｏｒｓ）とサイトカインの増殖率を相対的に比較するために、培地には組換え造血性サイトカイン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）として、インターロイキン−３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３，ＩＬ−３，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ，１０ｎｇ／ｍＬの濃度にて添加）、ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ，１０ｎｇ／ｍＬの濃度にて添加）及びエリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＥＰＯ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ，３Ｕ／ｍＬの濃度にて添加）を互いに別々に組み合わせて加えた。

共培養時に非付着性／付着性の造血細胞（ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ／ａｄｈｅｒｅｎｔ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）を注意深く分注（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）して毎日回収した。浮遊されている敷石形成造血性細胞（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）の下に位置する間質細胞は培養フラスコに残され、回収されたＣＤ３４^＋細胞のうち生命力のある細胞の総数はトリパンブルー染色法（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎ）を用いて血球計算板（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）により計数した。

本発明においては、生産される細胞の種類とは無関係に、特定の細胞群（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）から新たに生産されることを細胞増殖と定義している。このため、細胞群の試験管内増殖（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）は、単に培養時に生産される総細胞数を意味する。

陽性免疫−磁気マイクロビーズ選択法（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏ−ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｂｅａｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によってＣＤ３４^＋濃縮された細胞群を得た（図１）。

前記ＣＤ３４^＋濃縮された細胞を子宮内膜の間質細胞と共培養し、ここにサイトカインを処理して時間別に細胞数を計数し、造血幹細胞を単独培養した場合と比較してみた（図２ａ〜図２ｄ参照）。その結果、図２ａ〜図２ｄに示すように、ＣＤ３４^＋濃縮された細胞とヒト子宮内膜の間質細胞を共培養した場合、そうでない場合と比較して、ＣＤ３４^＋濃縮された細胞の数は優位に増える傾向を示した。また、ＦＢＳが添加されなかったため、３日後からＣＤ３４^＋濃縮された細胞群は次第に減った。しかしながら、ＣＤ３４^＋濃縮された細胞の増殖パターンはずっと保持された。３つのサイトカイン（ＩＬ−３，ＥＰＯ及びＧＭ−ＣＳＦ）がいずれも加えられた場合、他の夫々のサイトカインの添加時と比較して、細胞数が増えている傾向を示した。３つのサイトカインのうちＩＬ−３により処理したときに、他のサイトカインの単独処置時と比較して細胞数が最も大いに増える傾向を示した。しかしながら、共培養した場合と比較したとき、サイトカインの処理は有意な細胞数の増加を示さなかった。

共培養時における子宮内膜の間質細胞の効果を他の繊維芽細胞と比較するために、ヒト乳房繊維芽細胞を子宮内膜の間質細胞の代わりに用いた実験群を含めて実験を再構成した。ＣＤ３４^＋濃縮された細胞を乳房繊維芽細胞と共培養し、ここにサイトカイン（ＩＬ−３，ＬＩＦ：白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ））を処理して時間別に細胞数を計数し、ＣＤ３４^＋濃縮された細胞を子宮内膜の間質細胞と共培養した場合及び造血幹細胞を単独培養した場合において比較した（図３ａ及び図３ｂ）。その結果、図３ａ及び図３ｂに示すように、ＣＤ３４^＋濃縮された細胞を乳房繊維芽細胞と共培養した場合、造血幹細胞単独での培養の場合よりは相対的に細胞数が増えていたが、ヒト子宮内膜の間質細胞と共培養した場合よりは細胞数の増加が多くなかった。また、サイトカイン（ＩＬ−３）処理によっては、共培養した場合と比較して有意な細胞数の増加を示さなかった（図２ａ〜図２ｄ及び図３ａ及び図３ｂ参照）。

以上、本発明の内容の特定の部分について詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施の態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されないという点は理解できるであろう。よって、本発明の実質的な権利範囲は請求の範囲とそれらの等価物によって定まると言える。

前記の詳細な説明から、本発明は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞または前駆細胞をヒト子宮内膜の間質細胞または上皮細胞と無血清または血清培地において共培養することを特徴とする造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法を提供する。本発明によれば、移植に安全な造血幹細胞または前駆細胞を短時間に多量に増殖することが可能であるため、臨床的に造血幹細胞または前駆細胞の移植を必要とする血液ガンをはじめとする難治性及び不治性疾患に苦しむ患者の治療に有効である。

Claims (7)

1. 次の段階を含む造血幹細胞の培養及び増殖方法：
   （ａ）臍帯血、骨髄、末梢血液または胚性幹細胞由来の造血幹細胞を培養する段階；
   （ｂ）子宮組織由来の子宮内膜の間質細胞を培養する段階；及び
   （ｃ）前記（ａ）段階において培養された造血幹細胞と前記（ｂ）段階において培養された子宮内膜の間質細胞とを共培養する段階。
2. 前記造血幹細胞が次の段階を経て得られることを特徴とする請求項１に記載の方法：
   （ａ）臍帯血、骨髄、末梢血液または胚性幹細胞から得られた単核球（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を単層培養、浮遊培養、または共培養する段階；
   （ｂ）前記単層培養、浮遊培養または共培養された細胞を造血幹細胞の特異抗原に対する抗体と反応させる段階；及び
   （ｃ）前記抗体と結合された細胞を細胞選別装置またはカラムを用いて分離する段階。
3. 前記造血幹細胞の特異抗原に対する抗体は、ＣＤ３４^＋、ＣＤ３８⁻、Ｔｈｙ１．１^＋、ｌｉｎ⁻、ＣＤ４５^＋、またはＫＤＲ^＋に対する抗体であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記細胞選別装置は、磁性細胞選別装置であって、前記カラムは、磁性カラムであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
5. 子宮内膜の間質細胞が、次の段階を経て得られることを特徴とする請求項１に記載の方法：
   （ａ）コラゲナーゼが含まれた細胞培養培地に細切りした子宮組織を入れて培養する段階；
   （ｂ）前記培養された細胞を３０〜５０μｍの細網目を有する布篩（ｃｌｏｔｈ ｓｉｅｖｅ）に通させる段階；及び
   （ｃ）前記（ｂ）段階において布篩を通った細胞を細胞培養皿において培養した後、細胞培養皿を培養液により洗浄して細胞培養皿に付着している間質細胞を分離する段階。
6. 前記（ｃ）段階は無血清または血清培地で培養することを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記共培養の時間は１〜１２０時間であることを特徴とする請求項１に記載の方法。

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