JP4268209B2 - 子宮内膜細胞を用いた造血幹細胞または前駆細胞の培養及び増殖方法 - Google Patents
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Description
臍帯血は、ソウル大学病院臨床試験倫理委員会のガイドライン(Institutional Review Board(IRB) guidelines)に基づき、ソウル大学病院と三星第一病院における満期産(full−term)と早期産(preterm)において集めた。
免疫−磁気システム(immuno−magnetic system)を用いたポジティブセレクション(positive selection)により得られた単核球から濃縮されたCD34+細胞を製造会社の使用説明書(Miltenyi Biotec,Inc,Bergischm Gladbach,Germany)に従い用意した。
ポジティブセレクションの後、CD34+細胞は直ちに免疫細胞化学法(immunocytochemistry)により同定されて定量化された。このために、商用化キット(Miltenyi Biotec,Inc,Bergischm Gladbach,Germany)とCD34+抗原に対する特異な単一クロン抗体(specific monoclonal antibody)を用い、製造社の指示に従って全過程を行った。
子宮組織は正常的な生理周期を経ており、且つ、子宮摘出術を受けた女性から供与された。30日以内にいかなるホルモン治療も受けていない増殖期(5−14日)と分泌期(15−26日)の女性から2〜3gの子宮組織を得た。また、これら組織は三星第一病院の臨床試験倫理委員会(IRB)の承認を得て研究用として用いた。
実験室まで移された子宮組織をハンクスBSS(Hanks BSS)中で洗浄し、血球細胞と各種の組織の残骸を除去した。上皮細胞と間質細胞の分離はサチャスワループら(Satyaswaroop et al.,J.Clin.Endocrinol.Metabol.,48:639,1979)とジュリアら(Julia,T.et al.,Human Reprod,16:836,2001)の方法を僅かに修正してから行った。
間質細胞はジュリアら(Julia,T.et al.,Human Reprod,16:836,2001)の方法に基づき、10%のFBS(Gibco Life Technologies)、0.62μg/mLのインシュリン、0.62μg/mLのトランスフェリン及び0.62ng/mLのセレニウム、125μg/mLの牛血清アルブミン、52.6μg/mLのリノレン酸、100単位のペニシリン、0.1mg/mLのストレプトマイシン及び0.25μg/mLのアンフォテリシンBが含まれているM199/F12培地において培養した。これに対し、上皮細胞の場合には、上記と同じ培地を用いたが、10%のFBSに代えて2mL/LのBPEが含まれている培地を用いて培養した。培地は2日おきに1回ずつ交換した。
24−ウェル培養フラスコ(Nunc,Rochester,NY)に2×105個の間質細胞を平板培養し、間質細胞が90%のコンフルエンス(confluence)を遥かに上回った時点で、CD34+細胞を接種(seeding)した。共培養する時点で、間質細胞は臍帯血由来のCD34+細胞を加える前に5回に亘ってPBSにより洗浄した。予め無血清RPMI−1640培地(Gibco−BRL,Rockville,MD)において37℃の温度条件下及び5%のCO2雰囲気下で培養した初代間質細胞の単層培養(monolayer of primary stromal cell)に1.5×105個の臍帯血由来のCD34+細胞を接種した。増殖率(proliferation rate)を比較するために、初代培養によって得られたヒト乳房繊維芽細胞(human breast fibroblast cells)を同じ方法により共培養した。
Claims (7)
- 次の段階を含む造血幹細胞の培養及び増殖方法:
(a)臍帯血、骨髄、末梢血液または胚性幹細胞由来の造血幹細胞を培養する段階;
(b)子宮組織由来の子宮内膜の間質細胞を培養する段階;及び
(c)前記(a)段階において培養された造血幹細胞と前記(b)段階において培養された子宮内膜の間質細胞とを共培養する段階。 - 前記造血幹細胞が次の段階を経て得られることを特徴とする請求項1に記載の方法:
(a)臍帯血、骨髄、末梢血液または胚性幹細胞から得られた単核球(mononuclear cell)を単層培養、浮遊培養、または共培養する段階;
(b)前記単層培養、浮遊培養または共培養された細胞を造血幹細胞の特異抗原に対する抗体と反応させる段階;及び
(c)前記抗体と結合された細胞を細胞選別装置またはカラムを用いて分離する段階。 - 前記造血幹細胞の特異抗原に対する抗体は、CD34+、CD38−、Thy1.1+、lin−、CD45+、またはKDR+に対する抗体であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記細胞選別装置は、磁性細胞選別装置であって、前記カラムは、磁性カラムであることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 子宮内膜の間質細胞が、次の段階を経て得られることを特徴とする請求項1に記載の方法:
(a)コラゲナーゼが含まれた細胞培養培地に細切りした子宮組織を入れて培養する段階;
(b)前記培養された細胞を30〜50μmの細網目を有する布篩(cloth sieve)に通させる段階;及び
(c)前記(b)段階において布篩を通った細胞を細胞培養皿において培養した後、細胞培養皿を培養液により洗浄して細胞培養皿に付着している間質細胞を分離する段階。 - 前記(c)段階は無血清または血清培地で培養することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記共培養の時間は1〜120時間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
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