KR20010046513A

KR20010046513A - 3차원적 혼합배양방법을 이용한 미분화 조혈모세포의 분화유도

Info

Publication number: KR20010046513A
Application number: KR1019990050308A
Authority: KR
Inventors: 이시우; 김한수; 김현옥; 정유진; 김영탁
Original assignee: 이시우
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2001-06-15

Abstract

본 발명은 인체의 장기에서 추출한 조혈모세포의 3차원 배양법에 의한 체외 증폭에 대한 것이다. 조혈 모세포란 미분화한 조혈세포와 계통 분화 하여 혈액세포로 발달할 수 있는 제 세포군을 통칭한다. 본 발명은 골수에서 유래한 기질세포 (stromal cell) 또는 기질세포의 조건배지(conditioned medium, BM-CM)와 조혈 모세포를 구형 콜라젠과 함께 액상 배양하는 방식 및 제반 성장인자의 존재하에서 조혈모세포의 체외 증폭과 분화의 방식을 제공한다.

Description

3차원적 혼합배양방법을 이용한 미분화 조혈모세포의 분화 유도{Three-dimensional expansion system for hematopoietic stem cells}

본 발명은 인체의 장기에서 추출한 조혈모세포의 3차원 배양법에 의한 체외 증폭에 대한 것이다.

1974년 제대혈(cord blood)에 조혈모세포(cell cells)가 존재한다는 것이 밝혀졌고, 치사량의 방사선 조사를 받은 백서(mouse)에 제대혈을 주입하여 골수의 기능의 회복이 가능하다는 실험(Wang, J. C. Y., M. Doedens, and J. E. Dick., Blood 89:3919(1997); Hogan, C. J., E. J. Shpall, O. McNulty, I. McNiece, J. E. Dick, L. D. Shultz, and G. Keller., Blood 90:85(1997); Szilvassy, S. J., M. J. Bass, G. van Zant, and B. Grimes., Blood 93:1557(1999); Gan, O. I., B. Murdoch, A. Larochelle, and J. E. Dick., Blood 90:641(1997); Piacibello, W., F. Sanavio, A. Severino, A. Dane, L. Gammaitoni, F. Fagioli, E. Perissinotto, G. Cavalloni, O. Kollet, T. Lapidot, and M. Aglietta., Blood 93:3736(1999), Rameshwar, 1999#2112)과, 1988년 제대혈 이식술이 증명된 이후, 골수 이식에 제대혈의 골수 이식을 위해 조혈 모세포를 이용하려는 다양한 시도가 진행되고 있다. 특히, 백서에 골수세포(bone marrow cells), 구동화된 말초 혈액세포(mobilized peripheral blood cells) 및 제대혈 세포들의 골수 기능 회복(bone marrow repopulation)을 비교한 결과 단위 세포수당 백서의 골수 조혈 기능의 재구성 능력에 있어 제대혈 세포가 다른 세포들에 비해 3-6배 가량 높은 빈도로 존재하는 것으로 밝혀져 있다(Wang, J. C. Y., M. Doedens, and J. E. Dick., Blood 89:3919 (1997), Engel, H., E. Kaya, R. Bald, H. Kolhagen, O. Grecu, T. Schondorf, U. Brenne, C. M. Kurbacher, U. J. Gohring, M. Kleine, and P. Mallmann., J. Hematother ., 8:141(1999)). 이에 따라, 제대혈에 존재하는 조혈모세포의 자기갱신 능력을 바탕으로 이들을 체외 증폭한 후 이식에 이용하여, 제대혈의 양적인 제한을 극복하려는 시도가 활발하게 진행 중이다(Piacibello, W., F. Sanavio, L. Garetto, A. Severino, D. Begandi, J. Ferrario, F. Fagioli, M. Berger, and M. Aglietta., Blood 89:2644(1997); Bhatia, M., D. Bonnet, U. Kapp, J. C. Y. Wang, B. Murdoch, and J. E. Dick., J. Exp.Med. , 186:619(1997); Kogler, G., J. Callejas, R. V. Sorg, J. Fischer, A. R. Migliaccio, and P. Wernet., Bone Marrow Transplant .21:233(1998)). 그러나, 조혈모세포의 체외 배양에서 해결하지 못하는 문제점들은 (1) 세포 배양에 따라서 충분한 수의 조혈세포를 획득할 수 있는지, (2) 배양조건에서 증폭된 세포들 중 조혈 모세포의 절대 수치가 증폭되었는지, (3) 증폭된 세포들의 질적인(생리학적인) 측면이 생체내의 그것과 일치하여, 향후 장기이식에 따른 부작용은 없는지 하는 것이다(Denning- Kendall, P. A., A. Nicol, H. Horsley, C. Donaldson, B. Bradley, and J. M. Hows., Bone Marrow Transplant. 21:225(1998)). 비록 많은 연구가 진행되고 있으나, 세포 증폭을 위한 최적 배양 조건도 완전하게는 알려져 있지 않다. 다만, 다양한 성장인자들의 조합을 이용하면, 제대혈 세포를 수십 내지 수백 배 증식이 가능한 것으로 밝혀져 있다(Piacibello, W., F. Sanavio, L. Garetto, A. Severino, D. Begandi, J. Ferrario, F. Fagioli, M. Berger, and M. Aglietta., Blood 89:2644 (1997); Kogler, G., J. Callejas, R. V. Sorg, J. Fischer, A. R. Migliaccio, and P. Wernet., Bone Marrow Transplant . 21:233(1998); Kogler, G., J. Callejas, R. V. Sorg, and P. Wernet., Bone Marrow Transplant . 21:S48(1998)). 그러나, 사람의 제대혈을 실험동물(NOD/SCID 백서)에 이식한 경우(DiGiusto, D. L., R. Lee, J. Moon, K. Moss, T. O'Toole, A. Voytovich, D. Webster, and J. J. Mule., Blood 84:1261(1996); Guenechea, G., J. C. Segovia, B. Albella, M. Lamana, M. Ramirez, C. Regidor, M. N. Fernandez, and J. A. Bueren., Blood 93:1097(1999)) 혹은 장기 배양 후 자기 갱신 능력을 조사한 경우(Gan, O. I., B. Murdoch, A. Larochelle, and J. E. Dick., Blood 90:641.10(1997); Denning- Kendall, P. A., A. Nicol, H. Horsley, C. Donaldson, B. Bradley, and J. M. Hows., Bone Marrow Transplant . 21:225(1998)) 모두 증폭된 세포들의 능력에는 한계를 드러냈다. 특히 9일간 체외 증폭된 제대혈 조혈 세포를 NOD/SCID 백서의 골수에 이식한 경우 신선한 제대혈 세포들과는 달리 골수의 재생에 실패한 사례는 현재의 장기간 세포배양/증폭을 통해 조직이식에 필요한 조혈세포를 조달하는 방식에 문제점을 보여주는 것이라 할 수 있다(Bhatia, M., D. Bonnet, U. Kapp, J. C. Y. Wang, B. Murdoch, and J. E. Dick., J. Exp.Med. 186:619(1997)). 현재의 체외 배양조건, 즉 2차원 배양조건으로는 양적인 문제(세포의 수적 증폭)는 해결하였으나 질적인 문제를 해결하지 못해, 증폭된 제대혈 세포의 임상 적용을 진행하기에는 아직 기대치를 밑돌고 있는 실정이다. 정상 세포의 생체내 성장과 증식 및 분화를 체외 배양에서 증명하기 위해서는 생체내의 환경에 대한 이해가 필수적이다. 생체 내에서의 조혈 기능(hematopoiesis)은 골수(bone marrow)내 세포들간의 그리고 세포외 기질 (extracellular matrix)과 다양한 세포들간의 상호작용이 빈번하게 일어날 수 있는 세포의 밀도가 높은 골수 시누스(sinus)에서 진행된다(Ogawa, M., Blood 81:2844 (1993); Mayani, H., Leukemia 10:1041(1996)). 이곳의 기질세포 (stromal cell)들과 세포외 기질(extracellular matrix) 성분들이 조혈 모세포가 갖는 막대한 자기갱신 (self-renewal), 증식 및 분화 등을 촉진하고 조절하는 미세환경(micro- environment)을 제공해 주고 있다(Breems, D. A., E. A. W. Blokland, K. E. Siebel, A. E. M. Mayen, L. J. A. Engels, and R. E. Ploemacher., Blood 91:111.16(1998)). 기질 세포들이 조혈 기능에 기여하는 바는 이미 조직배양 플라스크(tissue culture flask)를 이용하는 Dexter LTBMC system에서 증명된 바 있으며, 다양한 싸이토카인의 조합이 제대혈 조혈 세포의 증폭에 필수적임이 밝혀져 있다(Bhatia, M., D. Bonnet, U. Kapp, J. C. Y. Wang, B. Murdoch, and J. E. Dick., J. Exp.Med. 186:619(1997); Kogler, G., J. Callejas, R. V. Sorg, J. Fischer, A. R. Migliaccio, and P. Wernet., Bone Marrow Transplant .21:233(1998); Petzer, A. L., P. W. Zandstra, J. M. Piret, and C. J. Eaves., J. Exp. Med .183:2551(1996); Piacibello, W., F. Sanavio, L. Garetto, A. Severino, A. Dane, L. Gammaitoni, and M. Aglietta., Leukemia 12:718(1998); Kohler, T., R. Plettig, B. Schaffer, R. Ordemann, H.-O. Nagels, G. Ehninger, and M. Bornhasuer., Stem Cells 17:19(1999); Querol, S., G. Capmany, J. A. Cancelas, and J. Garcia., Bone Marrow Transplant .21:S77(1998)). 그러나, 종래의 인공적인 배양 조건들이 조혈모세포에 제공하는 골수 환경의 필수적인 성분들을 결핍하고 있으므로 이들이 갖는 선천적인 생장능력을 제한하며, 배양에 의한 증식 및 분화의 결과인 세포들 또한 생체내의 세포들과 생리적으로 동일하다는 결론을 내리기 어렵다. 이러한 점들 때문에 시험관에서 배양한 세포들을 임상에 직접 적용하기에는 위험성을 내포하고 있다.

생체 내에서와 동일하거나 유사한 환경을 제공하는 방식(system)을 이용 할 수 있다면 상기와 같은 한계를 극복할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 단기 및 장기배양에 의해 제대혈(cord blood)을 생체외 증폭(expansion)할 수 있는 방식을 개발하였다. 이를 위해서, 다공성 구형 콜라젠(porous collagen beads)를 이용하는 배양 조건을 종래의 배양 조건과, 배양된 세포의 형질 및 조혈 능력을 생체내의 조혈세포와 비교 분석하였다. 비록, 유사한 방식이 이미 백서의 골수 조혈작용에 성공적으로 이용될 수 있다는 보고가 있으나(Wang, T.-Y., J. K. Brennan, and J. H. D. Wu., Exp. Hematol . 23:26.21(1995)), 본 발명의 기술적 구성인 조혈모세포의 증폭과는 전혀 다른, 골수 조혈 모세포의 다계통(multilineage) 분화에 초점을 맞추고 있다. 따라서, 구형 콜라젠를 이용한 제대혈 조혈모세포의 순수 증폭방식은 세계 최초의 시도라 할 수 있다. 따라서 본 발명자들이 개발한 배양기법은, 기존의 2차원 배양방식이 제공하지 못하는, 생체내의 3차원 미세환경과 유사한 환경을 제공할 것이므로, 생장과 생리 등 여러 측면(질적인 측면)에서 보다 생체 내에서 제공하는 세포와 유사한 세포를 생산할 수 있으며, 이를 통해 골수 이식에 필요한 제대혈의 조혈 세포의 탁월한 자기갱신 능력을 갖춘 세포로 증폭할 수 있다.

본 발명은 다음의 세 측면에서 기존의 배양 방식과 차별성을 갖는다.

첫째, 체내 환경과 유사한 3차원적인 미세 환경에서 조혈세포의 배양이 이루어진다. 둘째, 이러한 환경적인 영향에 따라 기존 방식과 동일한 배양조건하에서 더 많은 세포의 증폭이 가능하다. 끝으로, 배양에 의해 증폭된 조혈 세포의 생리적인 특성이 방금 추출한 세포들과 유사한 특성을 지니기 때문에 골수 이식에 직접 이용할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 조혈모세포의 시험관에서의 증폭에 구형 콜라젠을 이용하는 3차원 액상 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 증폭된 조혈모세포를 백혈병, 림프종, 다발성골수종, 유방암, 소세포성폐암, 난소암, 신경모 세포암 등의 질환을 가지는 환자에 조직이식하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시험관내 퍼징(in vitro purging)과 유전자 변형 (gene modulation) 적용 등과 같은 유전자 치료 등에 벡터로 사용할 증폭된 조혈모 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 증폭된 조혈모세포의 장기 냉동 보관 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다.

도 1은 제대혈에서 분리한 조혈모세포(CD34)의 형질을 분석한 것이다.

도 2는 조혈모세포(2 x 10exp4 cells/well)를 Flt3-리간드(FL)와 조혈세포인자 (stem cell factor;SCF)를 포함하는 배지에서 기질세포, 기질세포/콜라젠 또는 콜라젠 존재하에서 배양한 후 세포의 증폭을 측정한 대표적인 결과이다.

도 3은 조혈모세포(2 x 10exp4 cells/well)를 Flt3-리간드(FL)와 조혈세포인자 (stem cell factor; SCF)를 포함하는 배지에서 기질세포, 기질세포/콜라젠 또는 콜라젠 존재하에서 배양한 후 세포의 표현형질 변화를 분석한 대표적인 결과이다.

도 4는 조혈모세포 증폭에 미치는 IL-6의 효과를 나타내는 결과이고,

도 5는 배양배지, 콜라젠 또는 SCM 존재하에서의 세포증폭을 나타내는 결과이다.

본 발명자들은 다공성 구형 콜라젠을 이용하여 생체 내에서와 동일하거나 유사한 환경을 제공하는 방식을 통해 골수기질 세포를 이용한 장기 배양에 의한 조혈모세포의 생체 외 증폭(expansion)할 수 있는 방식을 개발하고, 다공성 구형 콜라젠(porous collagen beads)을 이용하는 3차원 배양 조건을 종래의 배양 조건과 여러가지 측면에서 비교 분석하였다.

조혈 모세포와 기질 세포들이 구형 콜라젠 내에 위치하면서 이들 3요소(조혈 모세포, 기질 세포 및 세포외 기질로서의 콜라젠) 및 배지에 첨가되는 조혈 모세포 생장 인자(사이토카인)들을 함유하는 3차원적인 배양 기법은 골수의 기질 세포들의 배양 혈청에 포함되는 다양한 세포외 기질와 함께 구형 콜라젠 내에서 콜라젠 분자들과 3차원의 공간적 배치가 되므로 조혈세포의 자기갱신, 증폭, 성장 및 분화를 지지하고 조절할 수 있는 다양한 니체(niche)를 제공한다. 따라서 본 발명의 배양기법은, 기존의 2차원 배양 방식이 제공하지 못하는, 생체내부와 유사한 3차원 미세환경을 제공할 것이므로, 생장과 생리 등 여러 측면(질적인 측면)에서 보다 생체 내에서 제공하는 세포와 유사한 세포를 생산할 수 있으며, 이를 통해 골수 이식에 필요한 제대혈의 조혈 세포의 탁월한 자기갱신 능력을 갖춘 세포로 증폭할 수 있다.

본 발명의 구성은 다음과 같다

1) 조혈모세포(Hematopoietic Stem Cells)의 수집

제대혈 수집 : 신생아가 분만된 뒤 제대를 이중으로 결찰하고 소독한 후에 제대를 절단하고 태반이 만출되기 전 제대 정맥에 수혈액의 바늘을 주입하여 중력과 자궁수축에 의해 흘러내리는 제대혈을 항응고제(CPD-A1) 45 ml이 포함된 수혈백(혈액 채혈 triple bag, 녹십자)에 채집한다.

2) 세포의 분리(Cell Isolation)

인체의 골수에서 유래하는 기질 세포주 (stromal cell line)을 구축하여, 제대혈 세포나 조혈 모세포 등을 배양하는데 기질(stroma)로 이용한다. 세포주 구축과정은 골수 5 ml을 20 ml의 행크스용액(Hank s balanced salt solution; HBSS, Life Technologies, Grand Island, NY)에 희석한 후 파이콜-하이페크(Ficoll-Hypaque, Pharamcia, Uppsala, Sweden) 원심 분리를 통해 유핵 세포를 분리한다. HBSS로 2 차례 세척 후 5x10exp6개의 유핵 세포를 10% 우혈청(Life Technologies), 1000 U/ml 페니실린(Life Technologies), 100 U/ml 스트렙토마이신(Life Technologies)과 2 mM L-글루타민(Life Technologies)을 함유하는 RPMI-1640 배양액(Life Technologies)에 부유 시키고, 이를 페트리 디시(Petri dish, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 1시간 배양하여 부착성 세포를 제거한다. 비 부착성 세포는 1회 세척 후 배양 플라스크에서 재배양한 후 매 3일 간격으로 배양액을 교체해 준다. 약 1-2 주 후에 균일한 형태의 부착성 세포들이 플라스크를 채우면 EDTA 5 mM을 함유하는 트립신(Life Technologies)으로 띄어낸 후 세척하고, 세포 수를 검사한 후 일부는 냉동보존재(freezing media; 90% 우혈청, 10% DMSO)로 처리한 후 냉동튜브(cryovial)에 넣어 세대수를 표시한 후 질소탱크에서 장기간 보관한다. 제대혈의 조혈 모세포의 분리를 위해서는 세포 부유액을 파이콜- 하이페크(Pharmacia)로 세포 밀도차이에 의한 유핵세포를 분리, 세척한 후 배양액에 부유시켜 세포 배양에 이용한다. 실험에 따라, 제조사의 권장방법에 따라 miniMACSTM (Miltenyi Biotec)을 사용하여 CD34-양성 조혈 모세포를 순수 분리하여 배양하거나 증폭의 효율이 더 높은 분리되지 않은 단핵구를 사용한다.

3) 조혈모세포의 3차원적 배양(In vitro 3-dimensional expansion of stem cells)

완충액에 부유된 구형 콜라젠(직경 500-600 m, 다공의 크기 100-200m, 다공성 85%; Cellex, Lebanon, NH) 1 ml과 배양액 (10% 우혈청, 1000 U/ml 페니실린, 100 U/ml 스트렙토마이신과 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640) 200 L를 96-웰 마이크로플레이트(becton Dickinson)에 넣고 200 x g에서 5분간 원침한 후 상층액을 제거하여 콜라젠을 패킹(packing)시킨다. 구형 콜라젠이 들어있는 플레이트 내에 기질세포(1 x 102)을 첨가한 웰과 첨가하지 않은 웰에 단핵세포를 1 ml 당 2 x 10exp4개의 농도로 분주한 후 5% CO₂배양기에서 6일, 9일, 12일, 15일간 배양한다. 조혈성장인자가 조합되어 포함된 배양액을 1 ml씩 매3일 마다 50% 교체한다. 성장인자의 조합 1 은 조혈성인자(Stem cell factor; steel factor; c-kit ligand), FL (Flt-3 리간드)와 인터루킨-3(IL-3)의 3종 사이토카인을 조합하고 조합 2는 SCF 와 FL을 조합한다. 3차원 배양에 대한 대조군으로서 구형 콜라젠을 제외하고 기질 세포주를 이용한 Dexter 배양법을 동시에 시행한다.

5) 배양된 조혈모세포의 조혈재건능력 평가세포

부유액을 반고형 배지와 섞어 최종 농도가 1% 메틸셀룰로스(methyl-cellulose), 30% 우혈청, 2 mM L-글루타민, 1% 우혈창알부민, 50nM β-머캅토에탄올, 인터루킨-3, GM-CSF)되도록 한다. 유핵세포의 측정과 반고형배지에서 집락 배양을 하여 호중구, 대식세포 집락형성단위(CFU-GM)이나 BFU-E와 같은 집락 형성 단위 수를 측정하는 클론형성 정량법(clonogenic assay) 및 유세포 분석기를 통해 면역표현형을 측정(CD34+, CD38-, c-kit+, HLA-DR-)하여 CD34 양성세포의 증폭을 측정한다.

6) 미분화 조혈 모세포의 분화와 특성

미분화 조혈모세포의 분화와 특성을 비교하기 위하여 채혈된 단핵구를 사용하여 3차원적 배양을 시행한 후 다음 기준을 측정한다.

(1) 유세포 분석기에 의한 면역 표현형질 분석(CD34, CD38, CD54, c-kit receptor, chemokine 수용체)

조혈 모세포의 운명(활동정지, 분열, 진화 및 사망)은 골수의 미세환경에 의해 제공된 외부 자극에 의해 결정된다. 그러나, 최근에 체외 증폭된 조혈 세포들의 생착 능력이 감소한다는 보고가 있다(Szilvassy, S. J., M. J. Bass, G. van Zant, and B. Grimes., Blood 93:1557(1999)). 또한, 골수 세포의 생착에 세포흡착 단백질(cell adhesion molecule)이나 chemokine 수용체가 중요한 역할을 함이 밝혀져 있다(Peled, A., et al., Science 283:845(1999)). 본 발명자들이 이용하는 증폭 방식이 생체내 환경과 유사하게 세포흡착단백질 혹은 chemokine 수용체의 발현을 변형시켜 적절한 조직으로의 이동과 생착을 유발한다는 것으로 본 발명에서는 생체외 증폭시 세포흡착단백질의 변화를 측정한다.

(2) c-kit 수용체 :

조혈인자(SCF)는 세포 표면의 c-kit 수용체와 결합하여 세포성장을 유도하며 이런 여러 가지 사이토카인 수용체의 수용성 형태(soluble form)은 이미 기술되어 있으며 이는 시험관내(in vivo)에서 사이토카인 활성의 조절자로서 중요한 역할을 담당한다. 따라서, 조혈모세포들이 배양액으로 수용성 c-kit 수용체를 방출하는지를 측정한다.

7) 냉동 및 해동 방법

제대혈, 제대혈에서 추출한 단핵구, 순수 분리한 조혈모세포 또는 증폭된 조혈 모세포는 침전한 다음 90% 우혈청과 10% DMSO 용액으로 부유 시킨다. 이들은 -70℃ 냉동고에서 24시간 냉동된 후 액화 질소 용기에 장기간 보존한다. 해동을 위해서는 동결된 세포를 사용직전에 37℃ 수조에서 급속히 해동한다음 우혈청10%를 함유하는 배지로 희석한 다음 다음단계로 진행한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐 본 발명은 이에 제한적인 것은 아니다. 또한, 본 발명의 기술적 요지 및 권리범위내에서 얼마든지 당업자간에 변형실시 또는 균등적 실시가 가능하다는 것은 당업자간에 명백히 이해될 것이고, 그 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

실시예 1: 제대혈 조혈 모세포의 순수 분리

제대혈의 조혈모세포의 분리를 위해서 세포 부유액을 파이콜-하이페크 (Pharmacia)으로 세포 밀도차이에 의한 유핵세포를 분리, 세척한 후 배양액(MACS 완충액; 1% 우혈청을 함유하는 PBS, pH 7.4)에 부유시켰다. 헤모사이토미터 (hemocytometer)로 트리판 블루(trypan blue, Life Technologies)로 염색한 직 후 생존 유핵 세포(viable nucleated cells)의 수를 결정하여 자기장(magnetic field)을 이용한 세포 분리단계로 진행하였다. 제조사의 권장방법에 따라 유핵세포 108 당 100 l의 블로킹 항체(blocking antibody)와 100 l의 초미세금속이 부착된 항 사람의 CD34에 대한 단일클론 항체로 30 분간 4C에서 염색하였다. 염색직 후 세포를 1회 원심분리-세척하고 다시 300-500 l의 MACS완충액에 부유시킨다음 이를 전 분리필터(Pre-separation filter, Miltenyi Biotec)에 통과 시켜 세포잔해를 제거 하였다. 통과된 세포들을 자기장의 적용을 받는 소형MACS 컬럼(MS 형, miniMACS, Miltenyi Biotec)에 주입하였다. 세포의 통과와 함께 적정량의 5 mM EDTA(Sigma)를 함유하는 MACS 세척용액 (PBS)를 컬럼에 주입하였다. 통과된 세포(CD34-음성)들은 제거하고 컬럼에 남은 세포를 자기장으로부터 컬럼을 제거한 후 피스톨로 회수한 다음 이를 다시 자기장의 적용을 받는 새로운 컬럼에 주입하여 자기장에 의해 고정된 세포(CD34-양성) 세포만을 순수하게 분리하였다. 분리된 세포는 백서에서 유래한 항사람 CD34 단일클론항체로 염색한 후 유세포 분석기를 통해 분석한 결과 전형적으로 70-95% CD34-양성 세포 순수도를 확인하였다(n=10). 도 1은 제대혈에서 분리한 조혈모세포(CD34)의 형질을 분석한 것이다. 파이콜-하이페크으로 분리한 단핵구(mononuclear cells)를 MACS로 순수 분리한 조혈모세포를 단일클론항체(anti-CD34-FITC와 anti-CD38-PE)로 염색한 후 순수도를 유세포 분석기로 측정한 대표적인 결과이다.

실시예 2: 조혈 모세포의 2차원 및 3차원 배양법에 의한 증폭 비교 분석

상기한 방식으로 순수 분리한 세포는 헤모사이토미터(hemocytometer)로 트리판 블루(trypan blue)로 염색한 직후 생존 유핵 세포(viable nucleated cells)의 수를 결정하여 10% 우혈청, 페니실린, 스트렙토마이신을 함유하는 IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium)에 1 x 10exp6의 농도로 부유하였다. 96웰 마이크로다이터 플레이트에 구형 콜라젠 원액 50 L와 150 L 배양액으로 중화하고 2 분간 침전 시킨 다음 주의깊게 용액 200 l를 제거하였다. 다시 여기에 배양액 100 l 또는 100 l의 마이토마이신-C 로 처리한 골수기질 세포 (2 x 10exp2개) 를 첨가 하였다. 대조군으로 골수 기질세포만을 첨가한 웰로 하였다. 여기에 Flt 3-리간드(10 ng/ml), SCF (10 ng/ml)를 조혈모세포(2 x 10exp4개)와 함께 투여하면서 배양을 시작하였다. 배양후 매 3일 마다 50%의 배지를 신선하게 준비한 성장인자를 함유하는 배지로 교체하고, 세포의 수를 헤모사이토미터로 결정하였다. 단, 콜라젠을 함유하는 경우 콜라젠 분해효소(Collagenase I, Sigma)로 전처리한 다음 세포를 회수 하였다

실시예 3: 조혈 모세포의 2차원 및 3차원 배양법에 의한 형질 비교 분석

상기한 방식으로 배양한 조혈모세포를 3, 6, 9, 12일에 수집하였다. 콜라젠을 함유하는 경우 콜라젠 분해효소로 전처리한 다음 세포를 회수 하였다. 회수한 세포들은 각각 대조군 항체(control sntibody)와 항사람 CD34-FITC와 CD38-PE로 이중 염색한 다음 1%(w/v) 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 함유하는 PBS로 고정한 다음 유세포 분석하였다. 도 2 은 조혈모세포(2 x 10exp4 cells/well)를 Flt3-리간드(FL)와 조혈인자(SCF)를 포함하는 배지에서 기질세포, 기질세포/콜라젠 또는 콜라젠 존재하에서 배양한 후 세포의 증폭을 측정한 결과이다. 배지는 매3일 단위로 FL(10 ng/ml)과 SCF (10 ng/ml)를 포함하는 배지로 50% 교체하였고 세포의 수는 6, 9, 12, 15일에 측정하였다. 콜라젠의 제거에는 Collagenase type I(1 u/ml)을 사용하였고 기질세포는 마이토마이신-C(30g/ml)로 처리하여 주입하였다. 삼각형(△)은 기질세포의 존재하에서의 조혈모세포의 증식을, 원형(○)은 기질세포와 콜라젠의 존재하에서의 증식을 그리고 검은 사각형(■)은 콜라젠하에서의 증식을 나타낸다. 도 3는 조혈모세포(2 x 10exp4 cells/well)를 Flt3-리간드(FL)와 조혈인자(SCF)를 포함하는 배지에서 기질세포, 기질세포/콜라젠 또는 콜라젠 존재하에서 배양한 후 세포의 표현형질 변화를 분석한 결과로, 배지는 매3일 단위로 FL (10 ng/ml)과 SCF(10 ng/ml)를 포함하는 배지로 50% 교체하였고 세포의 형질 분석은 6, 9, 12, 15일에 분석하였다. 콜라젠의 제거에는 Collagenase type I(1 u/ml)을 사용하였고 기질세포는 마이토마이신-C (30g/ml)로 처리하여 주입하였다. 배양된 세포는 단일클론항체 anti-CD34-FITC와 anti-CD38-PE로 염색하고 1% 파라포름알데하이드로 고정한 후 유세포 분석기로 분석하였다.

실시예 4: 인터류킨 6에 의한 조혈모세포의 증폭 및 형질 변경

유의한 정도의 조혈모세포 증폭이 인터루킨-6(IL-6)의 첨가에 의해 증가된다는 보고된 바 있어(Kollet, O., R. Aviram, J. Chebath, H. ben-Hur, A. Nagler, L. Shultz, M. Revel, and T. Lapidot., Blood 94:923(1999)), 이를 3차원 배양법으로 재현하여 보았다. 상기한 방식과 동일한 조건으로 순수 분리한 세포는 헤모사이토미터(hemocytometer)로 트리판 블루(trypan blue)로 염색한 직 후 생존 유핵 세포(viable nucleated cells)의 수를 결정하여 10% 우혈청, 페니실린, 스트렙토마이신을 함유하는IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium)에 1 x 10exp6의 농도로 부유하였다. 96웰 마이크로다이터 플레이트에 구형 콜라젠 원액 50 l와 150 l 배양액으로 중화하고 2 분간 침전 시킨 다음 주의깊게 용액 200 l를 제거하였다. 다시 여기에 배양액 100 l 또는 100 l의 마이토마이신-C 로 처리한 골수기질 세포(2 x 10exp2개)를 첨가 하였다. 여기에 Flt 3-리간드(10 ng/ml), SCF(10 ng/ml)를 조혈모세포(2 x 10exp4 개)와 함께 투여하면서 배양을 시작하였다. 여기에 IL-6(10 ng/ml)을 첨가한 군과 첨가하지 않은 군을 세포 증폭과 형질 분석의 2가지를 비교하였다. 배양후 매 3일 마다 50%의 배지를 신선하게 준비한 성장인자를 함유하는 배지로 교체하고, 세포의 수를 헤모사이토미터로 결정하였다. 단, 콜라젠을 함유하는 경우 콜라젠 분해효소(Collagenase I, Sigma)로 전처리한 다음 세포를 회수 하였다. 도4는 조혈모세포(2X10exp4 cells/well)를 Flt-리간드(FL), 조혈인자(SCF) 및 IL-6를 포함하는 배지에서 기질세포, 기질세포/콜라젠 또는 콜라젠 하에서 배양한 후 세포의 형질변화를 분석한 결과이다.

실시예 5: 골수 기질세포 배양액에 의한 조혈모세포의 증폭

골수 기질세포와 조혈모세포의 직접적인 세포 접촉이 조혈모세포의 증폭에 부정적인 영향을 줄수 있다는 보고(Kohler, T., R. Plettig, B. Schaffer, R. Ordemann, H.-O. Nagels, G. Ehninger, and M. Bornhasuer., Stem Cells 17:19 (1999))에 따라 골수 기질세포를 제외하고 이를 골수기질세포배양액으로 대체하여 조혈모세포 증폭의 효과를 분석하였다. 상기한 방식으로 순수 분리한 세포는 헤모사이토미터(hemocytometer)로 트리판 블루(trypan blue)로 염색한 직 후 생존 유핵 세포(viable nucleated cells)의 수를 결정하여 10% 우혈청, 페니실린, 스트렙토마이신을 함유하는IMDM (Iscove s modified Dulbecco s medium)에 1 x 10exp6의 농도로 부유하였다. 96웰 마이크로다이터 플레이트에 구형 콜라젠 원액 50 l와 150 l 배양액으로 중화하고 2 분간 침전 시킨 다음 주의깊게 용액 200 l를 제거하였다. 다시 여기에 골수기질세포 배양액 40 l(전체 배지의 20%)를 첨가 하였다. 대조군으로 골수 기질세포배양액을 첨가하지 않은 웰로 하였다. 여기에 Flt 3-리간드(10 ng/ml), SCF(10 ng/ml)를 조혈모세포(2 x 10exp4 개)와 함께 투여하면서 배양을 시작하였다. 배양후 매 3일 마다 50%의 배지를 신선하게 준비한 성장인자를 함유하는 배지로 교체하고, 세포의 수를 헤모사이토미터로 결정하였다. 단, 콜라젠을 함유하는 경우 콜라젠 분해효소(Collagenase I, Sigma)로 전처리한 다음 세포를 회수 하였다. 도 5는 조혈모세포(2X10exp4 cells/well)를 Flt3-리간드(FL)와 조혈인자(SCF)를 포함하는 배지에서 세포증폭에 있어 기질세포 배양액의 효과를 분석한 결과이다. 배지는 매 3일 단위로 FL(10ng/ml)과 SCF(10ng/ml)를 포함하는 배지로 50% 교체하였고 세포의 형질분석은 6, 9, 12, 15일마다 분석하였다.

실시예 6 : 냉동 및 해동 방법

제대혈, 제대혈에서 추출한 단핵구, 순수 분리한 조혈모세포 또는 증폭된 조혈 모세포는 침전한 다음 90% 우혈청과 10% DMSO 용액으로 부유시켰다. 이들을 -70℃ 냉동고에서 24시간 냉동된 후 액화 질소 용기에 장기간 보존하였다. 해동을 위해서는 동결된 세포를 사용직전에 37℃ 수조에서 급속히 해동한다음 우혈청10%를 함유하는 배지로 희석한 다음 다음단계로 진행하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 생체와 유사한 시스템의 조혈모세의 증폭방법에 따라 제조된 증폭된 제대혈은 백혈병을 앓는 소아 뿐만 아니라 성인에게도 이용될수 있는 양으로 증폭이 가능하고, 임상적 적용시 간편하고 안전할 뿐만 아니라 저렴하게 증폭효율을 극대화할 수 있으며, 또한 본 발명 배양 시스템은 단순히 조혈 모세포의 증폭뿐만 아니라, 유전자 표식이나 유전자 치료 및 특정 계열의 세포만으로 선택적으로 증폭하는 세포주 계통-특이적 증폭이 가능하므로 다른 임상 분야로의 접근 또한 용이하기 때문에, 본 발명은 의약 및 생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

조혈모세포의 증식 배양법에 있어서, 구형의 다공성 콜라젠을 이용함을 특징으로 하는 조혈모세포의 3차원적 액상 증폭 배양법.
제1항에 있어서, 조혈모세포는 인체에서 유래한 골수, 제대혈 및 말초혈액의 미분화 CD34-양성세포로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 조혈모세포의 액상 증폭 배양법.
제1항에 있어서, 조혈모세포의 증폭에 기질세포(stroma cell) 또는 기질세포 배양액(stroma cell conditioned medium)을 첨가하는 것을 특징으로 조혈모세포의 액상 증폭 배양법.
제1항에 있어서, 조혈모세포의 증식에 Flt3 리간드, 조혈인자(stem cell factor, SCF), 인터루킨-3(interleukin-3), GM-CSF, 트롬보포이에틴(TPO) 및 인터루킨-6 또는 이들의 혼합물로부터 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인을 첨가함을 특징으로 하는 조혈모세포의 액상 증폭 배양법.
제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 의해 증폭된 조혈모세포를 백혈병, 림프종, 다발성골수종, 유방암, 소세포성폐암, 난소암 또는 신경모 세포암 질환을 가지고 HLA 항원이 일치하는 환자에 조직이식함을 특징으로 하는 환자의 치료 방법.
제5항에 있어서, 증폭된 조혈모세포를 시험관내 퍼징(in vitro purging) 또는 유전자 변형(gene modulation)을 통해 유전자 치료용 벡터로 이용함을 특징으로 하는 환자의 치료 방법.
제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 의해 증폭된 조혈모세포를 침전시킨 다음 90% 우혈청과 10% DMSO 용액으로 부유시키고 -70℃ 냉동고에서 24시간 냉동시킨 후 액화 질소 용기에 장기 냉동 보관하는 방법.