CN110384716A - 一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法及应用，其中，制备方法具体包括如下步骤：从人子宫内膜组织中分离得到人子宫内膜干细胞；人子宫内膜干细胞经体外消化分离与扩大培养，获得高质量的人子宫内膜干细胞；再将高质量的人子宫内膜干细胞进行工厂化放大培养，收集P3‑P6代的干细胞培养上清液；干细胞培养上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到人子宫内膜干细胞浓缩因子；将人子宫内膜干细胞浓缩因子与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到人子宫内膜干细胞冻干粉；将人子宫内膜干细胞冻干粉与溶媒混合，即获得人子宫内膜干细胞复合修复因子。本发明具有显著的治疗效果，无痛苦，不手术，不开刀，无副作用，安全高效。

Description

一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法及应用。
背景技术
子宫对于女性的一生至关重要，人类子宫内膜是人体新陈代谢和自我更新最为活跃的组织之一。但是，一旦子宫内膜损伤，则会造成一系列后果。由于人流或妇科炎症导致子宫内膜受损，子宫内膜损伤严重会直接造成内膜生理性修复障碍。最终引起习惯性流产、宫腔粘连、闭经甚至不孕不育等并发症。子宫内膜损伤还会导致宫颈炎、子宫内膜炎、子宫内膜息肉、子宫内膜损伤、子宫肌瘤及癌前病变等。
宫内膜干细胞 (Endometrial Derived Stem Cells , EDSCs)是具有自我更新、多向分化及增殖能力的未分化子宫内膜细胞。子宫内膜干细胞是子宫内膜再生和修复的种子细胞，其数量、分布、分化、增殖以及调控机制发生异常都可能成为子宫内膜疾病的根源。由于子宫内膜取材方便且不受道德及法律问题的限制，使子宫内膜干细胞在妇科疾病的治疗方面有着广泛的应用前景。
现有的私密治疗技术对子宫内膜修复难度大，治疗时间长，经常采用病变组织或器官切除治疗方法，给很多女性带来了极大的困扰。采取有效的方法治疗子宫内膜损伤，促进内膜修复，并阻止其并发症的发生，对妇科疾病的治疗显得尤为重要。
鉴于此，本发明提供了一种宫内膜干细胞修复因子冻干粉和溶媒的制备技术，该宫内膜干细胞修复因子保存时间长，安全高效，对于妇科炎症、子宫肌瘤、子宫内膜损伤、卵巢功能下降有显著的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、从人子宫内膜组织中分离得到人子宫内膜干细胞；
S2、人子宫内膜干细胞经体外消化分离与扩大培养，获得高质量的人子宫内膜干细胞；
S3、再将高质量的人子宫内膜干细胞进行工厂化放大培养，收集P3-P6代的干细胞培养上清液；
S4、干细胞培养上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到人子宫内膜干细胞浓缩因子；
S5、将人子宫内膜干细胞浓缩因子与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到人子宫内膜干细胞冻干粉；
S6、将人子宫内膜干细胞冻干粉与溶媒混合，即获得人子宫内膜干细胞复合修复因子。
优选的，所述步骤S2中人子宫内膜干细胞体外消化分离与扩大培养方法的具体步骤为：
步骤一：在超净台内，对获取的人子宫内膜干细胞的组织材料剪碎成3-5mm的细条，用无菌D-hanks溶液（含有青链霉素）洗剂3次；
步骤二：将清洗过的组织置入300mg/ml的Ⅲ胶原酶和40mg/ml的Ⅰ型脱氧核糖核酸酶溶液中，在此消化过程中，始终保持组织浸泡于消化酶中；
步骤三：接着，用恒温水浴锅震荡消化40-60min，得到消化液，消化过程中持续搅动消化组织，避免组织沉到消化液底部；
步骤四：吸取步骤三中的消化液，保留未消化完的组织碎块，对未消化完的组织碎块继续加入300mg/ml的Ⅲ胶原酶和40mg/ml的Ⅰ型脱氧核糖核酸酶溶液中，重复步骤二和步骤三，重复消化一次，吸取消化液，消化液经200-300目的滤网过滤，再经过1200r/min离心，获得离心消化液，弃去上清，得到细胞组织；
步骤五：用0℃的D-hanks溶液洗剂细胞组织2次，加入DMEM-F12培养基(含10%胎牛血清)中；
步骤六：将DMEM-F12培养基放入细胞培养箱中培养，培养24～30h后，更换培养基，继续培养，待细胞密度为70％～80％时，即得到高质量的人子宫内膜干细胞。
优选的，所述的细胞培养箱中的温度为37℃，细胞培养箱内含有5%的CO2。
优选的，所述步骤S4中细胞培养上清液的浓缩方法具体步骤为：将收集的干细胞培养上清液采用0.22μm滤膜过滤，然后，再通过25-35KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过90-140D超滤膜，收集截留液，得到人子宫内膜干细胞因子浓缩液，即可。
优选的，所述步骤S4中细胞培养上清液与浓缩后的人子宫内膜干细胞因子浓缩液的体积比为4-2:1。
优选的，所述步骤S5中的冷冻干燥条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为20-30h，冷冻干燥得到人子宫内膜干细胞冻干粉。
优选的，所述步骤S6中的溶媒由功效原料复配制备而成，功效原料按照体积份数计包括如下组分：超纯水60-65份、甲基丙二醇15-20份、玻尿酸3-5份、侧柏提取物1-5份、何首乌提取物1-5份、甘油5-15份。
优选的，所述步骤S6中人子宫内膜干细胞冻干粉与溶媒的混合比例为1:1。
一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的应用，将上述任一所述方法制备的人子宫内膜干细胞复合修复因子用于妇科炎症的改善、子宫内膜的修复、卵巢功能恢复、子宫肌瘤改善妇科方面的临床应用及产品开发。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：与传统的私密健康产品相比的优势如下：制备完成的人子宫内膜干细胞复合修复因子，透皮吸收能力强，能够高效改善炎症，高效清除HPV病毒，并且保存时间长，便于携带，使用方便。将人子宫内膜干细胞冻干粉与溶媒混合后，用于女性私密处炎症及组织病变修复，对于妇科炎症、子宫肌瘤、子宫内膜损伤、卵巢功能下降等症状都有显著的治疗效果。本发明对于解决女性私密健康具有显著的治疗效果，无痛苦，不手术，不开刀，无副作用，安全高效。
附图说明
图1为本发明中原代宫内膜干细胞培养照片；
图2为本发明中P3代宫内膜干细胞培养照片；
图3为本发明中人子宫内膜干细胞复合修复因子制备及应用流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1～3，本发明提供一种技术方案：一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、从人子宫内膜组织中分离得到人子宫内膜干细胞；
S2、人子宫内膜干细胞经体外消化分离与扩大培养，获得高质量的人子宫内膜干细胞；
其中，所述步骤S2中人子宫内膜干细胞体外消化分离与扩大培养方法的具体步骤为：
步骤一：在超净台内，对获取的人子宫内膜干细胞的组织材料剪碎成3-5mm的细条，用无菌D-hanks溶液（含有青链霉素）洗剂3次；
步骤二：将清洗过的组织置入300mg/ml的Ⅲ胶原酶和40mg/ml的Ⅰ型脱氧核糖核酸酶溶液中，在此消化过程中，始终保持组织浸泡于消化酶中；
步骤三：接着，用恒温水浴锅震荡消化40-60min，得到消化液，消化过程中持续搅动消化组织，避免组织沉到消化液底部；
步骤四：吸取步骤三中的消化液，保留未消化完的组织碎块，对未消化完的组织碎块继续加入300mg/ml的Ⅲ胶原酶和40mg/ml的Ⅰ型脱氧核糖核酸酶溶液中，重复步骤二和步骤三，重复消化一次，吸取消化液，消化液经200-300目的滤网过滤，再经过1200r/min离心，获得离心消化液，弃去上清，得到细胞组织；
步骤五：用0℃的D-hanks溶液洗剂细胞组织2次，加入DMEM-F12培养基(含10%胎牛血清)中；
步骤六：将DMEM-F12培养基放入细胞培养箱中培养，培养24～30h后，更换培养基，继续培养，待细胞密度为70％～80％时，即得到高质量的人子宫内膜干细胞（原代宫内膜干细胞）。
其中，所述的细胞培养箱中的温度为37℃，细胞培养箱内含有5%的CO2。
S3、再将高质量的人子宫内膜干细胞进行工厂化放大培养，收集P3-P6代的干细胞培养上清液；
S4、干细胞培养上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到人子宫内膜干细胞浓缩因子；
其中，所述步骤S4中细胞培养上清液的浓缩方法具体步骤为：将收集的干细胞培养上清液采用0.22μm滤膜过滤，然后，再通过25-35KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过90-140D超滤膜，收集截留液，得到人子宫内膜干细胞因子浓缩液，即可。
所述步骤S4中细胞培养上清液与浓缩后的人子宫内膜干细胞因子浓缩液的体积比为4-2:1。
S5、将人子宫内膜干细胞浓缩因子与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到人子宫内膜干细胞冻干粉；
其中，所述步骤S5中的冷冻干燥条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为20-30h，冷冻干燥得到人子宫内膜干细胞冻干粉。人子宫内膜干细胞冻干粉的具体质量检测报告见表一。
S6、将人子宫内膜干细胞冻干粉与溶媒混合，即获得人子宫内膜干细胞复合修复因子。
其中，所述步骤S6中的溶媒由功效原料复配制备而成，功效原料按照体积份数计包括如下组分：超纯水60-65份、甲基丙二醇15-20份、玻尿酸3-5份、侧柏提取物1-5份、何首乌提取物1-5份、甘油5-15份。
所述步骤S6中人子宫内膜干细胞冻干粉与溶媒的混合比例为1:1。人子宫内膜干细胞冻干粉用溶媒（溶解液）的具体质量检测报告见表二。
以上所述的人子宫内膜干细胞冻干粉与溶媒（溶解液）制备好之后，进行无菌消毒，按照1:1混合，即可用于女性私密处修复治疗。
一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的应用，将上述所述方法制备的人子宫内膜干细胞复合修复因子用于妇科炎症的改善、子宫内膜的修复、卵巢功能恢复、子宫肌瘤改善妇科方面的临床应用及产品开发。人子宫内膜干细胞复合修复因子与传统私密产品比较具体见表三。
具体操作实施步骤为：
1）用酒精棉球消毒双手。
2）用给药器抽取溶媒溶液注入人子宫内膜干细胞冻干粉中摇匀，使用给药器抽取混合溶液，用抱枕垫高臀部，拔掉无菌封密护套，均速注入阴道，使溶液均匀分布在宫颈外口。抱枕垫高臀部15-20分钟，促进溶液在宫颈内充分发挥其功效。
3）对于妇科炎症患者使用4-12次，就会有显著的改善效果；对于子宫内膜损伤或病变人群，使用12-24次会有显著改善效果。
统计治疗效果发现，本发明获得的宫内膜干细胞冻干粉产品对妇科炎症的改善，子宫内膜的修复、卵巢功能恢复、子宫肌瘤改善方面都有显著效果。
表一：人子宫内膜干细胞冻干粉质量检测报告
表二：人子宫内膜干细胞冻干粉用溶解液质量检测报告
表三：人子宫内膜干细胞复合修复因子与传统私密产品比较
项目 宫内膜干细胞修复因子 传统私密产品
透皮吸收性能 易、均匀 难、不均匀
促细胞生长能力 强 弱
损伤修复功效 强 弱
炎症改善 明显 一般
HPV病毒清除能力 强 弱
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
S1、从人子宫内膜组织中分离得到人子宫内膜干细胞；
S2、人子宫内膜干细胞经体外消化分离与扩大培养，获得高质量的人子宫内膜干细胞；
S3、再将高质量的人子宫内膜干细胞进行工厂化放大培养，收集P3-P6代的干细胞培养上清液；
S4、干细胞培养上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到人子宫内膜干细胞浓缩因子；
S5、将人子宫内膜干细胞浓缩因子与冻干保护剂混合后，冷冻干燥得到人子宫内膜干细胞冻干粉；
S6、将人子宫内膜干细胞冻干粉与溶媒混合，即获得人子宫内膜干细胞复合修复因子。
2.根据权利要求1所述的一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中人子宫内膜干细胞体外消化分离与扩大培养方法的具体步骤为：
步骤一：在超净台内，对获取的人子宫内膜干细胞的组织材料剪碎成3-5mm的细条，用无菌D-hanks溶液洗剂3次；
步骤二：将清洗过的组织置入300mg/ml的Ⅲ胶原酶和40mg/ml的Ⅰ型脱氧核糖核酸酶溶液中，在此消化过程中，始终保持组织浸泡于消化酶中；
步骤三：接着，用恒温水浴锅震荡消化40-60min，得到消化液，消化过程中持续搅动消化组织，避免组织沉到消化液底部；
步骤四：吸取步骤三中的消化液，保留未消化完的组织碎块，对未消化完的组织碎块继续加入300mg/ml的Ⅲ胶原酶和40mg/ml的Ⅰ型脱氧核糖核酸酶溶液中，重复步骤二和步骤三，重复消化一次，吸取消化液，消化液经200-300目的滤网过滤，再经过1200r/min离心，获得离心消化液，弃去上清，得到细胞组织；
步骤五：用0℃的D-hanks溶液洗剂细胞组织2次，加入DMEM-F12培养基中；
步骤六：将DMEM-F12培养基放入细胞培养箱中培养，培养24～30h后，更换培养基，继续培养，待细胞密度为70％～80％时，即得到高质量的人子宫内膜干细胞。
3.根据权利要求2所述的一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，其特征在于：所述的细胞培养箱中的温度为37℃，细胞培养箱内含有5%的CO2。
4.根据权利要求1所述的一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中细胞培养上清液的浓缩方法具体步骤为：将收集的干细胞培养上清液采用0.22μm滤膜过滤，然后，再通过25-35KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过90-140D超滤膜，收集截留液，得到人子宫内膜干细胞因子浓缩液，即可。
5.根据权利要求4所述的一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中细胞培养上清液与浓缩后的人子宫内膜干细胞因子浓缩液的体积比为4-2:1。
6.根据权利要求1所述的一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，其特征在于：所述步骤S5中的冷冻干燥条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为20-30h，冷冻干燥得到人子宫内膜干细胞冻干粉。
7.根据权利要求1所述的一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中的溶媒由功效原料复配制备而成，功效原料按照体积份数计包括如下组分：超纯水60-65份、甲基丙二醇15-20份、玻尿酸3-5份、侧柏提取物1-5份、何首乌提取物1-5份、甘油5-15份。
8.根据权利要求7所述的一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的制备方法，其特征在于：所述步骤S6中人子宫内膜干细胞冻干粉与溶媒的混合比例为1:1。
9.一种人子宫内膜干细胞复合修复因子的应用，其特征在于：将权利要求1-8任一所述方法制备的人子宫内膜干细胞复合修复因子用于妇科炎症的改善、子宫内膜的修复、卵巢功能恢复、子宫肌瘤改善妇科方面的临床应用及产品开发。
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