CN103548814B

CN103548814B - 造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂

Info

Publication number: CN103548814B
Application number: CN201310549445.0A
Authority: CN
Inventors: 陈洁平; 黄其林
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2033-11-07
Also published as: CN103548814A

Abstract

本发明涉及造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂，所述保护剂由5体积份试剂A和2体积份试剂B组成，试剂A为二甲基亚砜、羟乙基淀粉溶液，其中二甲基亚砜、羟乙基淀粉的质量百分比分别为10～20%、5.4～6%，试剂B为白蛋白溶液，白蛋白的质量百分比为20～40%。本发明所述保护剂的配方简单，原料便宜；该保存方法能较简便的在-80℃非程控降温的条件下保存造血干细胞，保存的细胞存活率高于90%，利于临床推广及应用，用于临床造血干细胞-80℃的低温短期保存。

Description

造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂

技术领域

本发明属于干细胞冷藏存储领域，特别涉及一种造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂。

背景技术

造血干细胞在临床上应用广泛，造血干细胞冻存是保证造血干细胞移植成功的关键技术之一，故其冻存方式尤为重要。目前临床造血干细胞冻存有－196℃液氮程控降温保存和－80℃非程控降温保存，前者能长期保存且细胞损伤少，一般可保存23～25年，但操作复杂、设备昂贵，解冻后有细胞凝集现象，后者可保存干细胞1～2年，其操作相对简便、费用低，但保存细胞时间及细胞活性受限。探索一种安全、简便、快速、价廉及有效的干细胞冻存方法，对于临床造血干细胞的储存、应用及造血干细胞移植成功具有重要意义。

在造血干细胞的冻存中，使用的冻存剂及方法均非常重要。目前应用于－80℃低温保存干细胞的保护剂有二甲基亚砜（下称DMSO）、CP-1、羟乙基淀粉、RPMI1640培养基、人血白蛋白等，不同的保护剂的配方及使用方法差异较大，对干细胞的保存效果与保存时间也存在差异，多数保存细胞的存活率为80%左右，干细胞安全难以保证，一些冻存方法还存在操作复杂缺点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法及保护剂，所述保护剂的配方简单，原料便宜；该保存方法能较简便的在-80℃非程控降温的条件下保存造血干细胞，保存的细胞存活率高于90%，为临床外周血造血干细胞的储存应用及造血干细胞移植提供可靠保证。

本发明的技术方案是：造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂，所述保护剂由5体积份试剂A和2体积份试剂B组成，所述试剂A为二甲基亚砜和羟乙基淀粉溶液，其中二甲基亚砜、羟乙基淀粉的质量百分比分别为10～20%、5.4～6%，所述试剂B为白蛋白溶液，白蛋白的质量百分比为20～40%。

所述试剂A中二甲基亚砜质量百分比为10%、羟乙基淀粉的质量百分比为5.4%，试剂B中白蛋白的质量百分比为20%。

二甲基亚砜和羟乙基淀粉溶液的溶剂为生理盐水或血浆。

二甲基亚砜为细胞冻存通透性保护剂，可降低冰点并延缓细胞冷冻过程，10％的二甲基亚砜保护剂在－80℃低温中能有效保存细胞。

造血干细胞-80℃非程控降温的冻存方法，具体步骤为取上述试剂B与干细胞混匀，取干细胞+试剂B等体积的刚配好的上述的试剂A，混匀，置于-80℃冻存。

试剂B与干细胞的体积比为2:3。

试剂A的体积与试剂B和干细胞的总体积相同。

羟乙基淀粉是大分子非通透性细胞保护剂，可使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成，对细胞膜具有保护作用。

白蛋白作保护剂在－80℃条件下可以保护直接冻存的造血干细胞。

采用上述技术方案，二甲基亚砜、羟乙基淀粉及白蛋白联合应用，可以有效地使干细胞冻存实现通透性保护作用，不仅降低冰点并延缓细胞冷冻过程，还增加干细胞的非通透性细胞保护作用，少细胞内冰晶形成，有效保护细胞膜，同时实现对干细胞的直接保护作用。

本发明中使用的DMSO为市售，羟乙基淀粉为医疗纯级市售，氯化钠溶液为市售，白蛋白溶液为市售，造血干细胞为临床采集，可用于造血干细胞移植的外周血造血干细胞、骨髓造血干细胞和脐带血造血干细胞。

采用简便的方法对冻存细胞进行有效处理，在非程控降温的前提下，使造血干细胞的冻存及复苏过程有利于最大限度保存细胞活性，是－80℃低温保存干细胞成功的关键。本发明所述保护剂的配方简单，原料便宜；所述保存方法操作简单，在-80℃非程控降温的条件下保存造血干细胞，其保存的细胞存活率高于90%，可用于临床造血干细胞-80℃的低温短期保存。

本发明所述体积份为毫升或升。

具体实施方式

一.本发明所述造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂各试剂的用量，如表1所示：

表1

二.造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂的制备方法

1.制备试剂A:

按照实施例1-5的配比分别取100%DMSO与羟乙基淀粉氯化钠溶液，混合，装入袋中。

2.制备试剂B：

按照实施例1-5的配比配置白蛋白40ml，备用。

三.造血干细胞-80℃非程控降温冻存方法

取500ml空袋，抽取干细胞袋内的干细胞60ml，注入空袋中，保留针头，将40ml试剂B注入袋中混匀，取刚配好的试剂A（试剂A的体积与干细胞+试剂B等体积）注入袋中混匀，此时袋内溶液总体积为200ml，分装为4袋，每袋50ml，注入冻存袋，排气，热合密封，贴标签。放入塑料篮获纸盒中，用硬纸板隔开，-80℃冰箱保存待用。

四.造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂的临床研究实验：

1.采集中国人民解放军第三军医大学西南医院血液科283例住院患者的体外周血干细胞，其中男186例，女97例。自体外周血干细胞的动员采集使用联合化疗加重组人集落刺激因子，经CS3000plus细胞分选机分离采集外周血造血干细胞，分别用实施例1-5的保护剂保存造血干细胞586例次，经临床试验验证，采集的造血干细胞-80℃冻存时间为2-12月，平均4.6月。

2.观察在冻融前、后MNC、CD34+细胞、回收率及台盼蓝拒染率无统计学意义(P>0.05)：

单个核细胞计数及活细胞检测：分别计算冻存前、解冻后单个核细胞数，单个核细胞回收率＝解冻后单个核细胞数／冻存前单个核细胞数×100％；台盼蓝拒染试验检测活细胞数，细胞活率＝解冻后活细胞数／冻存前活细胞数×100％；CD34＋细胞检测：在冻存前、解冻后分别计算CD34＋细胞数，计算CD34＋细胞回收率＝解冻后CD34＋＋细胞数／冻存前CD34＋细胞数×100％。细胞复苏后采用台盼兰检测细胞成活率、CD34+细胞流失细胞仪分析，计算造血干细胞回收率平均为95.5%，用于自体造血干细胞移植均取得成功，观察在冻融前、后MNC、CD34+细胞、回收率及台盼蓝拒染率无统计学意义(P>0.05)，能够良好的保持干细胞数量及生理活性，见表2。

表2.-80℃低温冻存前后细胞数量、回收率及生理活性（x±s,n=586)

结论：本发明所述的造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂保存造血干细胞，是一种短期内简便、高效并安全的造血干细胞保存方法，该保护剂具有价格低廉,容易购买,低毒安全等特点,该保存方法操作简便，同时还保证了冻存造血干细胞的活性，可用于临床造血干细胞-80℃的低温短期保存。

Claims

1. 一种造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂，其特征在于：所述保护剂由5体积份试剂A和2体积份试剂B组成，所述试剂A为二甲基亚砜和羟乙基淀粉溶液，其中二甲基亚砜、羟乙基淀粉的质量百分比分别为10～20%、5.4～6%，所述试剂B为白蛋白溶液，白蛋白的质量百分比为20 ～ 40%。

2. 根据权利要求1所述的造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂，其特征在于：所述试剂A中二甲基亚砜质量百分比为10%、羟乙基淀粉的质量百分比为5.4%，试剂B中白蛋白的质量百分比为20%。

3. 根据权利要求1所述的造血干细胞-80℃非程控降温冻存保护剂，其特征在于：二甲基亚砜和羟乙基淀粉溶液的溶剂为生理盐水或血浆。

4. 一种造血干细胞-80℃非程控降温的冻存方法，其特征在于：取权利要求1或2所述的试剂B与干细胞混匀，试剂B与干细胞的体积比为2:3，取刚配好的权利要求1或2所述的试剂A，混匀，置于-80℃冻存。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：试剂A的体积与试剂B和干细胞的总体积相同。