CN106993606A - 一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法，包括聚乙烯醇、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸、二甲基亚砜；其余为双蒸水。本发明建立了一种化学成分明确的单组份细胞冻存液，取代传统的血清，避免了病毒、细菌和支原体等污染的可能性，减少因血清带来的批次差异性；建立一种直接冻存‑80度冰箱的方法，保证冻存时间大于3年及以上，避免程序性降温的步骤，不需要使用冻存盒，比传统方法，操作简单方便安全性高；保证冻存细胞的存活率和高活性，比传统血清效果更好，因取代了血清，价格更便宜。

Description

一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法
技术领域：
本发明属于细胞保存技术领域，具体涉及一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法。
背景技术：
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。冻存细胞经典方案往往是使用胎牛血清(FBS)与二甲基亚砜(DMSO)混合培养基后，应用于细胞的冻存。但是该方法有不少瑕疵。如，血清中的蛋白甚至潜在的病原体污染会对生物制品的安全性造成风险；此外胎牛血清会对动物造成一定潜在伤害，可能遇到无法通过欧美伦理审核的难题。
发明内容：
本发明公开了一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法，制备的即用型细胞冻存液，能有效地提高常规细胞、原代细胞与干细胞的复苏后存活率与活力；产品质量稳定可靠、使用方便，助力科研工作者摆脱程序繁琐、操作复杂、容易污染的传统冻存方法，专注于后续实验研究；本发明的细胞冻存液所含化学成分明确，无动物源性成分，可一步实现细胞冻存并长期在-80℃冰箱保存，保护细胞免受冰晶和溶质损伤。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种不含蛋白和血清的细胞冻存液，所述不含蛋白和血清的细胞冻存液包括以下质量分数或体积分数的组分：
质量分数为1％-3％的聚乙烯醇、质量分数为2.5-3.5％的葡萄糖、质量分数为0.15-0.20％的氯化钠、质量分数为0.005-0.008％的磷酸二氢钠、质量分数为0.03-0.06％的磷酸氢二钠、质量分数为0.04-0.06％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量分数0.002-0.005％的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、体积分数为5％-12％的二甲基亚砜；其余为双蒸水。
优选的，所述不含蛋白和血清的细胞冻存液包括以下质量分数或体积分数的组分：
质量分数为1.5％-2.5％的聚乙烯醇、质量分数为2.8-3.2％的葡萄糖、质量分数为0.18-0.20％的氯化钠、质量分数为0.006-0.008％的磷酸二氢钠、质量分数为0.035-0.055％的磷酸氢二钠、质量分数为0.04-0.06％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量分数0.002-0.005％的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、体积分数为7％-10％的二甲基亚砜；其余为双蒸水。
上述技术方案中，所述聚乙烯醇的分子量为40000-60000。聚乙烯醇外观为白色粉末，是一种水溶性高分子聚合物，具有极高的安全性的有机物，对细胞无毒，无副作用，在本发明中加入聚乙烯醇的高分子聚合物能够在细胞冻存温度降低时起到缓冲作用；加入了葡萄糖，为细胞冻存时提供能量，此外其他为缓冲液，为细胞冻存时提供合适的离子平衡和pH等环境。
本发明还公开了上述不含蛋白和血清的细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；
(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液。
优选的，所述过滤为将所述混合液依次用0.45um滤膜、0.22um滤膜过滤。先用0.45um滤膜经行澄清过滤，然后再进行0.22um过滤除菌，即获得无血清和蛋白来源的细胞冻存液，无杂质污染。
本发明进一步公开了上述不含蛋白和血清的细胞冻存液在保存细胞中的应用。
本发明还公开了一种冻存细胞的方法，包括以下步骤：
(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；
(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液；
(3)将细胞悬浮液置于离心管中，离心处理后弃上清、收集培养细胞沉淀；然后加入细胞冻存液，制成细胞混合液；然后将细胞混合液置入-80℃，完成细胞冻存。
上述技术方案中，所述过滤为将所述混合液依次用0.45um滤膜、0.22um滤膜过滤；所述离心处理为1000rmp处理5分钟；将细胞混合液分装于已标记的冻存管中，然后置入-80℃，完成细胞冻存。
优选的，所述细胞混合液中，细胞浓度为5×105-1×107/mL。
本发明进一步公开了一种细胞冻存复苏的方法，包括以下步骤：
(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；
(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液；
(3)将细胞悬浮液置于离心管中，离心处理后弃上清、收集培养细胞沉淀；然后加入细胞冻存液，制成细胞混合液；然后将细胞混合液置入-80℃，完成细胞冻存；
(4)取出冻存的细胞，放入37℃水浴槽中解冻；待细胞混合液完全融化后，加入细胞培养基；然后于1000rmp离心处理5分钟，收集冻存细胞沉淀，移去上清液；再加入新鲜细胞培养基，完成细胞复苏。
本发明公开了一种化学成分明确的单组份细胞冻存液，取代传统的血清，避免了病毒、细菌和支原体等污染的可能性，减少因血清带来的批次差异性；该产品是单一组分的，包含了冻存细胞所需要的全部成分，无需现配、操作方便，可减少实验中因操作引起的污染；此外，血清成分比较复杂，批次差异性大，还有可能携带病菌、病毒等有害物质，本产品用成分确定的葡萄糖等营养物质替代了血清，避免因血清问题带来的弊端。
本发明公开的化学成分明确的单组份细胞冻存液可建立一种直接冻存-80度冰箱的方法，保证冻存时间大于3年及以上，避免程序性降温的步骤，不需要使用冻存盒，比传统方法，操作简单方便安全性高。常规冻存方法是采用″慢冻快融″的方法来保证细胞存活，标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。但是这个过程时间长，步骤繁琐，容易导致效率偏低，而用我们产品可以直接一步到位放置于-80度冰箱保存。此外采用液氮方法安全性不高，液氮容易造成人员伤害。
本发明公开的化学成分明确的单组份细胞冻存液保证冻存细胞的存活率和高活性，比传统血清效果更好，因取代了血清，价格更便宜。细胞的存活率和高活性是后续实验完成的重要保障，采用本产品可以保证细胞存活率在95％以上，细胞活力高，生长状态良好。此外，目前血清价格高昂，而且定期补充液氮同样是传统的方法成本较高，使用本产品性价比更高，接受度更高，完全可以替代传统冻存细胞的方法。
具体实施方式
实施例一
不含蛋白和血清的细胞冻存液的配制：
(1)在1000ml的烧杯中，加入600ml双蒸水，缓慢加入10g的聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解。
(2)逐步加入32g的葡萄糖，1.7的氯化钠，0.06磷酸二氢钠，0.5g磷酸氢二钠，0.5g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0.04g的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，搅拌使其充分溶解。
(3)加入100ml的二甲基亚砜(DMSO)，搅拌使其充分溶解，定容至1000ml。
(4)在无菌条件下将上述混合液先用0.45um滤膜经行澄清过滤，然后在无菌条件下再进行0.22um过滤除菌，即获得无血清和蛋白来源的细胞冻存液。
实施例二
不含蛋白和血清的细胞冻存液的配制：
(1)在1000ml的烧杯中，加入600ml双蒸水，缓慢加入30g的聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解。
(2)逐步加入30g的葡萄糖，1.7的氯化钠，0.06磷酸二氢钠，0.5g磷酸氢二钠，0.5g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0.04g的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，搅拌使其充分溶解。
(3)加入100ml的二甲基亚砜(DMSO)，搅拌使其充分溶解，定容至1000ml。
(4)在无菌条件下将上述混合液先用0.45um滤膜经行澄清过滤，然后在无菌条件下再进行0.22um过滤除菌，即获得无血清和蛋白来源的细胞冻存液。
实施例三
不含蛋白和血清的细胞冻存液的配制：
(1)在1000ml的烧杯中，加入600ml双蒸水，缓慢加入20g的聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解。
(2)逐步加入30g的葡萄糖，1.7的氯化钠，0.06磷酸二氢钠，0.5g磷酸氢二钠，0.5g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0.04g的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，搅拌使其充分溶解。
(3)加入100ml的二甲基亚砜(DMSO)，搅拌使其充分溶解，定容至1000ml。
(4)在无菌条件下将上述混合液先用0.45um滤膜经行澄清过滤，然后在无菌条件下再进行0.22um过滤除菌，即获得无血清和蛋白来源的细胞冻存液。
对比例一
对照细胞冻存液(含血清和蛋白)配制：
将胎牛血清、DMEM培养基和DMSO按体积比为2∶7∶1的比例配制成100ml的冻存液，进行0.22um滤膜过滤除菌。
实施例四
使用实施例和对比例中的细胞冻存液冻存HEK293细胞
(1).常规方法收集对数期的HEK293细胞于试管中。
(2).根据培养细胞的密度和冻存管的大小确定所需冻存细胞数。
(3).将所需数目的HEK293细胞悬浮液置于离心管中，1000rmp，5分钟离心收集培养细胞沉淀，彻底弃去离心管中的上清液。
(4).分别加入适量实施例和对比例的细胞冻存液于离心管中，使细胞浓度约为2×106/ml。轻柔地混匀细胞，制成细胞混合液。
(5).将离心管中的细胞混合液分装于已标记的冻存管中，每管1ml。
(6).直接将分装好的细胞冻存管放入-80℃超低温冰箱中。
HEK293细胞冻存1个月、3个月、6个月和12个月后，取细胞复苏，进行以下细胞活率分析步骤，从冰箱中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴槽中快速解冻。待冻存管中细胞混合液完全融化后，立即加入DMEM基础培养基于冷冻管中与细胞混合，去100ul细胞悬浮液和100ul的台盼蓝染液混合，染色分析细胞活率，每组重复3次，取平均值，表1为HEK293细胞存活率，本发明公开的化学成分明确的单组份细胞冻存液保证冻存细胞的存活率和高活性，比传统血清效果更好，而且对比例的现有冻存液在-198度液氮中保存1年后细胞存活率达不到90％。
表1HEK293细胞存活率
实施例五
使用实施例和对比例中的细胞冻存液冻存Hela细胞
(1).常规方法收集对数期的Hela细胞于试管中。
(2).根据培养细胞的密度和冻存管的大小确定所需冻存细胞数。
(3).将所需数目的Hela细胞悬浮液置于离心管中，1000rmp，5分钟离心收集培养细胞沉淀，彻底弃去离心管中的上清液。
(4).分别加入适量实施案例1、2、3和4的细胞冻存液于离心管中，使细胞浓度约为2×106/ml。轻柔地混匀细胞，制成细胞混合液。
(5).将离心管中的细胞混合液分装于已标记的冻存管中，每管1ml。
(6).直接将分装好的细胞冻存管放入-80℃超低温冰箱中。
Hela细胞冻存1个月、3个月、6个月和12个月后，取细胞复苏，进行以下细胞活率分析步骤，从冰箱中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴槽中快速解冻。待冻存管中细胞混合液完全融化后，立即加入DMEM基础培养基于冷冻管中与细胞混合，去100ul细胞悬浮液和100ul的台盼蓝染液混合，染色分析细胞活率，每组重复3次，去平均值，表1为Hela细胞存活率，本发明公开的化学成分明确的单组份细胞冻存液保证冻存细胞的存活率和高活性，比传统血清效果更好。
表2Hela细胞存活率
本发明相比于目前常用的动物来源的血清、DMSO和基础培养基组成的冻存液相比，是一种单一的组分，即用型的，不需要使用前再配制，简化了操作流程。该冻存液化学成分明确的单组份细胞冻存液，取代传统的血清，避免了病毒、细菌和支原体等污染的可能性，减少因血清带来的批次差异性。是一种直接冻存-80度冰箱的方法，保证冻存时间大于3年及以上，避免程序性降温的步骤，不需要使用冻存盒，比传统方法，操作简单方便安全性高。

Claims (10)

1.一种不含蛋白和血清的细胞冻存液，其特征在于，所述不含蛋白和血清的细胞冻存液包括以下质量分数或体积分数的组分：
质量分数为1％-3％的聚乙烯醇、质量分数为2.5-3.5％的葡萄糖、质量分数为0.15-0.20％的氯化钠、质量分数为0.005-0.008％的磷酸二氢钠、质量分数为0.03-0.06％的磷酸氢二钠、质量分数为0.04-0.06％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量分数0.002-0.005％的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、体积分数为5％-12％的二甲基亚砜；其余为双蒸水。
2.根据权利要求1所述不含蛋白和血清的细胞冻存液，其特征在于，所述不含蛋白和血清的细胞冻存液包括以下质量分数或体积分数的组分：
质量分数为1.5％-2.5％的聚乙烯醇、质量分数为2.8-3.2％的葡萄糖、质量分数为0.18-0.20％的氯化钠、质量分数为0.006-0.008％的磷酸二氢钠、质量分数为0.035-0.055％的磷酸氢二钠、质量分数为0.04-0.06％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量分数0.002-0.005％的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、体积分数为7％-10％的二甲基亚砜；其余为双蒸水。
3.根据权利要求1或者2所述不含蛋白和血清的细胞冻存液，其特征在于，所述聚乙烯醇的分子量为40000-60000。
4.权利要求1所述不含蛋白和血清的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；
(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液。
5.根据权利要求4所述不含蛋白和血清的细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述过滤为将所述混合液依次用0.45um滤膜、0.22um滤膜过滤。
6.权利要求1所述不含蛋白和血清的细胞冻存液在保存细胞中的应用。
7.一种冻存细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；
(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液；
(3)将细胞悬浮液置于离心管中，离心处理后弃上清、收集培养细胞沉淀；然后加入细胞冻存液，制成细胞混合液；然后将细胞混合液置入-80℃，完成细胞冻存。
8.根据权利要求7所述冻存细胞的方法，其特征在于，所述过滤为将所述混合液依次用0.45um滤膜、0.22um滤膜过滤；所述离心处理为1000rmp处理5分钟；将细胞混合液分装于已标记的冻存管中，然后置入-80℃，完成细胞冻存。
9.根据权利要求7所述冻存细胞的方法，其特征在于，所述细胞混合液中，细胞浓度为5×105-1×107/mL。
10.一种细胞冻存复苏的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；
(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液；
(3)将细胞悬浮液置于离心管中，离心处理后弃上清、收集培养细胞沉淀；然后加入细胞冻存液，制成细胞混合液；然后将细胞混合液置入-80℃，完成细胞冻存；
(4)取出冻存的细胞，放入37℃水浴槽中解冻；待细胞混合液完全融化后，加入细胞培养基；然后于1000rmp离心处理5分钟，收集冻存细胞沉淀，移去上清液；再加入新鲜细胞培养基，完成细胞复苏。
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