CN102771473A

CN102771473A - 一种用于保存胚胎的冷冻液、其制备方法及应用

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Publication number: CN102771473A
Application number: CN2012102797847A
Authority: CN
Inventors: 余文莉; 李树静
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2012-11-14

Abstract

本发明公开了一种用于保存胚胎的冷冻液，特别是用于保存取样胚胎的冷冻液。本发明冷冻液含乙二醇和蔗糖，其特征为还含有聚蔗糖、含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS，其配比为：聚蔗糖9～65g:乙二醇75～85ml:蔗糖30～40g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS910～930ml，所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的含量为0.0021g/ml；配制时，将乙二醇、蔗糖和聚蔗糖溶解于含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS中。本发明充分利用乙二醇、蔗糖、聚蔗糖和牛血清白蛋白之间的相互配合、相互支持、协同作用以及充分发挥各组分的特点，本发明冷冻液对取样胚胎解冻后的发育率高于常规乙二醇冷冻液。

Description

一种用于保存胚胎的冷冻液、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种用于保存胚胎的冷冻液，特别涉及一种用于保存取样胚胎的冷冻液。本发明还涉及所述冷冻液的制备方法及应用。

背景技术

胚胎的冷冻是胚胎的保存方法，将胚胎置于冷冻液中保护并采取特殊的降温程序，使胚胎在超低温（液氮-196℃，液氦-269℃）下停止代谢。需要使用胚胎时，再通过特定的解冻程序使其恢复生存能力，从而达到长期保存胚胎的目的。

为了性别鉴定和其它基因检测与分析，常常需要利用显微操作技术将胚胎组织切割下一小部分用于分析，将剩余部分冷冻保存备用。

但胚胎被切割取样后会对胚胎造成损伤，如透明带破损、胚胎细胞数量减少、破坏细胞连接等，使胚胎对冷冻的耐受性降低。冻后的胚胎无论在形态正常率、冻后回收率，还是在胚胎发育率等方面都不够理想。

冷冻液主要包括两种：慢速程序化冷冻液和玻璃化冷冻液。常规冷冻就是慢速程序化冷冻，慢速程序化冷冻液的组成和配比不是固定不变的，目前最常用的是乙二醇+蔗糖或者再添加些其他成分的，一般在牛胚胎的冷冻上研究较多。由于胚胎的质量、种属、发育阶段和培养条件的不同，使得冷冻效果存在差异，冷冻液的组成也会随之变化，但用于保存取样胚胎的效果较好的冷冻液鲜有报道。

1983年Lehn-Jensen发现透明带在冷冻解冻过程中起一种物理屏障作用，可抵抗病毒和微生物。目前，针对取样胚胎冷冻的报道较少，且有关的报道，冷冻效率都很一般。而常规的由乙二醇和蔗糖组成的乙二醇冷冻液，由于冷冻保护剂选择不当，大都存在冷冻取样胚胎效率低以及取样胚胎冻后的发育率和移植成功率较低的问题。因此，急需一种可保存取样胚胎的冷冻液。

聚蔗糖（商品名Ficoll）以蔗糖和环氧氯丙烷为原料，目前对于将聚蔗糖加入常规乙二醇冷冻液的报道非常少，且在常规冷冻保护液中添加高分子量非渗透性抗冻保护剂，此前从未有过报道。

发明内容

为解决上述领域的需求和不足，本发明提供一种用于保存胚胎的冷冻液，其制备方法及应用。本发明冷冻液通过在常规胚胎冷冻液中添加特定浓度的高分子量非渗透性抗冻保护剂聚蔗糖，解决了常规乙二醇冷冻液用于冷冻取样胚胎发育率低的问题。

一种用于保存胚胎的冷冻液，含乙二醇和蔗糖，其特征为还含有聚蔗糖、含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS，其配比为：

聚蔗糖9～65g:乙二醇75～85ml:蔗糖30～40g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 910～930ml；

所述含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS中，所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的含量为0.0021g/ml；

配制时，将乙二醇、蔗糖和聚蔗糖溶解于含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS中。

当所述冷冻液各组分的配比为:聚蔗糖9.2～64.4g:乙二醇80ml:蔗糖30～32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 920ml时，本发明冷冻液胚胎发育率数值大于对照组的胚胎发育率，根据本领域常识，本发明冷冻液总体效果优于对照组。

当所述冷冻液各组分的配比为:聚蔗糖9.2～55.2g:乙二醇80ml:蔗糖30～32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 920ml时，根据对比数据，本发明冷冻液总体效果较佳,这个区间内的冷冻液效果差异不显著，且冷冻效果比较稳定，没有忽高忽低的变化。

当所述冷冻液各组分的配比为:聚蔗糖46～55.2g:乙二醇80ml:蔗糖30～32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 920ml时，冷冻效果达到较好，冷冻效果优于这个范围外的冷冻液，将聚蔗糖的浓度提高或者降低，则都不能达到如此好的效果，所以从本发明数据来看，常规冷冻液中，添加聚蔗糖的相对最适量范围为46～55.2。

所述冷冻液各组分的最佳配比为:聚蔗糖0.552g，乙二醇0.8ml，蔗糖0.315008g，含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 9.2ml，在这个比值下，本发明冷冻液效果最好。

上述冷冻液中，所述胚胎是经切割取样的取样胚胎。

上述冷冻液的制备方法，包括如下步骤：

（1）将聚蔗糖加入容器中，加入缓冲溶液PBS，4℃静置溶解；

（2）再加入蔗糖，4℃静置溶解；

（3）再加入牛血清白蛋白BSA，勿摇动，4℃静置溶解；

（4）再加入缓冲溶液PBS，得到的混合液；

（5）取步骤（4）所得混合液同乙二醇相混合，密封，4℃冰箱静置；

上述各成分的配比为：聚蔗糖9～65g:乙二醇75～85ml:蔗糖30～40g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS 910～930ml，所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的含量为0.0021g/ml。

上述冷冻液在保存取样胚胎中的应用。

技术效果：

本发明是在常规冷冻液中添加非渗透性的高分子抗冻保护剂聚蔗糖、BSA(牛血清白蛋白)等，这些物质不能透过细胞膜，在冷冻时通过渗透压改变引起细胞脱水，减少细胞内大冰晶的形成；解冻时防止水分快速渗入，同时脱出细胞内的抗冻保护剂，降低对细胞的损伤，所以对胚胎起到保护作用。

本发明中使用的聚蔗糖为Ficoll 70，即分子量为70 000的聚蔗糖，属于高分子量非渗透性抗冻保护剂。聚蔗糖的浓度较高，一般为30％，高浓度的聚蔗糖能够显著提高细胞外液的渗透压，使细胞在冷冻降温前充分脱水，减少冰晶的形成；同时胚胎在解冻时比冷冻时更易形成致死冰晶，因此克服解冻时形成致死冰晶至关重要，而聚蔗糖具有阻止解冻时形成冰晶和稳定细胞膜的作用。乙二醇为低分子量渗透性冷冻保护剂，在几种常用的低分子量冷冻保护剂中，乙二醇毒性最低，渗透性最好，添加蔗糖能够降低溶液的毒性，而血清含有许多成分，包括能量基质、氨基酸、维生素、激素、生长因子和细胞因子，作为胚胎的营养和能量底物，是其它物质不能取代的最佳选择。但由于犊牛血清易造成动物病原菌污染，本发明使用牛血清白蛋白（BSA）替代犊牛血清，排除掉病原菌污染的问题，而且其中成分无很大变化。本发明冷冻液以常规冷冻液（乙二醇+蔗糖）为基础，添加特定浓度的作为高分子量非渗透性抗冻保护剂的聚蔗糖，本发明充分利用乙二醇、蔗糖、聚蔗糖和牛血清白蛋白BSA之间的相互配合、相互支持、协同作用。本发明冷冻液用于取样胚胎的冷冻，取样胚胎冷冻后发育率高。

本领域常识，一种冷冻液的胚胎发育率高于对照组的胚胎发育率，那么这种冷冻液效果就优于对照组。

透明带受损胚胎常规冷冻液添加聚蔗糖，对冷冻效果的影响

本发明冷冻液中聚蔗糖的浓度或含量高于对照组，能够更有效地使胚胎在冷冻降温前充分脱水，减少冰晶的形成，解冻时，更有效地防止细胞的过度膨胀，而不至于在细管中就破碎。总体来说，本发明添加聚蔗糖的冷冻液的效果优于常规冷冻液。

实验数据证明，两种效果较好的冷冻液配方为：聚蔗糖g:乙二醇ml:蔗糖g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS ml为46：80：31.5008：920和聚蔗糖g:乙二醇ml:蔗糖g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS ml为55.2：80：31.5008：920。由本发明实验数据来看，将聚蔗糖相对量增加至64.4和降低至9.2都不能达到如此好的效果，所以相对本发明数据来说，常规冷冻液中，添加聚蔗糖的相对最适量为46和55.2。

通过比较几种冷冻液的培养24h发育率和培养48h发育率可以看出，聚蔗糖具有阻止解冻时形成冰晶和稳定细胞膜等作用，且本发明中由于其更好地降低了冷冻液的毒性，冷冻效果同不添加聚蔗糖相比，有了较明显的提高。

透明带受损胚胎二次冷冻和鲜胚冷冻，冷冻效果比较

胚胎经历一次冷冻-解冻的过程，会对后续的发育能力造成一定的影响。长期的研究表明，胚胎在冷冻及解冻过程中，都会受到一系列的伤害，如低温会引起细胞膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢；冷冻保护剂中主要是渗透性冷冻保护剂会对胚胎产生化学毒害作用，温度越高、作用时间越长、浓度越大，则毒性就会越大，这种毒性会造成细胞变脆崩裂、透明带硬化、微管微丝的聚合和解聚、染色体和DNA损伤等，以及胚胎冷冻和解冻时的冰晶损伤等。

经对比实验证实，本发明冷冻液具有如下优点：

1.取样胚胎解冻后培养发育率显著高于常规冷冻液；

2.当聚蔗糖的重量与总冷冻液的体积之比在0.046～0.0552g/ml之间时，冷冻效果较好，且冷冻效果较稳定，没有忽高忽低的变化，将聚蔗糖的浓度提高或者降低，则都不能达到如此好的效果；

3.本发明冷冻液尤其对取样胚胎冷冻效果较好。

附图说明

图1胚胎冷冻装管示意图

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

本发明试验中对照组使用的常规乙二醇冷冻液由乙二醇和蔗糖组成，本发明实施例中的乙二醇为纯的液态乙二醇。

本发明试验中所使用的冷冻仪为胚胎冷冻仪，型号：CL5500，厂家：澳大利亚。

本发明所用试剂来源：

聚蔗糖购于美国Sigma公司，规格型号：F-2878,100G；

PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L；

BSA-牛血清白蛋白购自美国Hyclone公司，实施例中乙二醇均购自美国Sigma公司（E-9129），规格型号：102466-500mL，其中乙二醇密度为1.110g/mL at 25°C；

对照组常规乙二醇冷冻液（EG FREEZE），为进口EG冷冻液，美国BIONICHE公司，规格型号：50mL，EVM034。

实施例1.0.6EFS冷冻液的配制：

将0.6g聚蔗糖置于10ml容量瓶中，加入PBS至近刻度线，4℃静置溶解；待完全溶解后，加入0.3424g蔗糖，4℃静置溶解；待完全溶解后，加入0.021gBSA（勿摇动，防起泡），4℃静置溶解；待完全溶解后，加入PBS定容至刻度线；容量瓶中液体混匀后，取容量瓶中溶液9.2ml同0.8ml纯乙二醇，密封，冰箱4℃静置，待用。

实施例2. 0.1EFS冷冻液的配制：

配制步骤同实施例1，添加0.1g的聚蔗糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清白蛋白的量同上。

实施例3.0.2EFS冷冻液的配制：

配制步骤同实施例1，添加0.2g的聚蔗糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清白蛋白的量同上。

实施例4.0.3EFS冷冻液的配制：

配制步骤同实施例1，添加0.3g的聚蔗糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清白蛋白的量同上。

实施例5.0.4EFS冷冻液的配制：

配制步骤同实施例1，添加0.4g的聚蔗糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清白蛋白的量同上。

实施例6.0.5EFS冷冻液的配制：

配制步骤同实施例1，添加0.5g的聚蔗糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清白蛋白的量同上。

实施例7.0.7EFS冷冻液的配制：

配制步骤同实施例1，添加0.7g的聚蔗糖，蔗糖、纯的乙二醇和牛血清白蛋白的量同上。

实施例8.本发明冷冻液的使用方法：

本发明采用慢速程序化冷冻，使用方法如下：

①将冷冻仪组装接入电源，倒入液氮，选择冷冻仪的0程序进行冷冻，此程序为：-6℃植冰，降温速度为0.5℃/min，-35℃投入液氮。

②装管，本发明采用六段法装管，先装入两段冷冻液，然后第三段装入胚胎，后面三段再装入冷冻液，最后塞入贴有标签的细管塞。(如图1)

③胚胎放入冷冻液平衡5min，装管后将细管放入已降温至-6℃的冷冻仪中并再次平衡5min后植冰（植冰点见图1），植冰后按下RUN键（10min后仪器开始以0.5℃/min的速度开始降温）；5min后检查植冰；当冷冻仪温度降到-35℃时将细管投入液氮并装入CANE中放入液氮罐进行保存。

实施例9.EFS系列冷冻液（添加聚蔗糖冷冻液）和常规乙二醇冷冻液（EG FREEZE）进行透明带受损胚胎二次冷冻-解冻观察

用实施例1,2,5,6所得冷冻液，对透明带受损胚胎进行二次冷冻、解冻、CO₂培养箱培养试验，同时以常规乙二醇冷冻液（EG FREEZE）为对照组，比较本发明冷冻液和常规冷冻液（EGFREEZE）的冷冻效果。

表1透明带受损胚胎二次冷冻-解冻培养结果

注：同列肩标小写字母相同者差异不显著(P＞0.05),肩标小写字母不同者差异显著(P＜0.05)。

如表1所示，EFS系列冷冻液中，除0.2EFS外，其它冷冻液的胚胎回收率均低于对照组；培养24h发育率和培养48h发育率，所有EFS系列冷冻液均高于常规乙二醇冷冻液（EGFREEZE）(P>0.05)，且0.6EFS冷冻液效果最好。

结合EFS系列冷冻液的透明带受损胚胎二次冷冻-解冻观察试验的结果，挑选出实施例5和6的0.5EFS和0.6EFS冷冻液进行后续的鲜胚冷冻试验。

实施例10.透明带受损鲜胚冷冻-解冻培养

仍以常规乙二醇冷冻液（EG FREEZE）为对照，将0.5EFS冷冻液和0.6EFS冷冻液，对透明带受损鲜胚进行冷冻、解冻、CO₂培养箱培养试验，比较本发明冷冻液和常规乙二醇冷冻液（EG FREEZE）的冷冻效果，具体见表2。

表2

注：同列肩标小写字母相同者差异不显著(P＞0.05),肩标小写字母不同者差异显著(P＜0.05),肩标大写字母不同者差异极显著(P＜0.01)。

如表2所示，在胚胎回收率方面，挑选出的两种冷冻液同对照组相比，差异都不显著(P>0.05),培养24h发育率和培养48h发育率，两种冷冻液均极显著高于常规乙二醇冷冻液（EGFREEZE）(P<0.01)，两种冷冻液之间相比，差异不显著(P>0.05)。

因此，取样胚胎常规冷冻液中添加适量聚蔗糖，能够获得比较好的冷冻效果；添加聚蔗糖冷冻液，仅针对取样胚胎冷冻效果较好，对于完整胚，EG FREEZE冷冻效果较好。

Claims

1.一种用于保存胚胎的冷冻液，含乙二醇和蔗糖，其特征为还含有聚蔗糖、含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS，其配比为：

聚蔗糖9～65g:乙二醇75～85ml:蔗糖30～40g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS910～930ml；

2.根据权利要求1所述冷冻液，其各组分的配比为:聚蔗糖9.2～64.4g:乙二醇80ml:蔗糖30～32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS920ml。

3.根据权利要求2所述冷冻液，其各组分的配比为:聚蔗糖9.2～55.2g:乙二醇80ml:蔗糖30～32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS920ml。

4.根据权利要求3所述冷冻液，其各组分的配比为:聚蔗糖46～55.2g:乙二醇80ml:蔗糖30～32g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS920ml。

5.根据权利要求4所述冷冻液，其各组分的用量为:聚蔗糖0.552g，乙二醇0.8ml，蔗糖0.315008g，含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS9.2ml。

6.权利要求1～5任一所述的冷冻液，所述胚胎是经切割取样的取样胚胎。

7.权利要求1～5任一所述冷冻液的制备方法，包括如下步骤：

（2）再加入蔗糖，4℃静置溶解；

（3）再加入牛血清白蛋白BSA，勿摇动，4℃静置溶解；

（4）再加入缓冲溶液PBS，得到的混合液；

上述各成分的配比为：聚蔗糖9～65g:乙二醇75～85ml:蔗糖30～40g:含牛血清白蛋白的缓冲溶液PBS910～930ml，所述牛血清白蛋白在缓冲溶液中的含量为0.0021g/ml。

8.权利要求1～5任一所述冷冻液在保存取样胚胎中的应用。