CN103068256B - 担子菌来源的冰结晶化抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供冰结晶化抑制剂，其适于实用、具有优异的冰结晶化抑制活性，且可以通过用于食品制造的安全的工序高效稳定地制造。另外，本发明的目的还在于提供与该冰结晶化抑制剂进行特异性反应的抗体以及包含该冰结晶化抑制剂的组合物、食品、生物试样保护剂及化妆品。本发明的目的进一步在于提供来源于担子菌的多糖类用于抑制含水液体的冰结晶化的用途及用于抑制含水液体的冰结晶化的方法。本发明涉及的冰结晶化抑制剂为担子菌来源的多糖类。

Description

担子菌来源的冰结晶化抑制剂
技术领域
本发明涉及担子菌来源的冰结晶化抑制剂、与该冰结晶化抑制剂进行特异性反应的抗体以及包含冰结晶化抑制剂的组合物、食品、生物试样保护剂及化妆品。
背景技术
我们知道在低温下栖息的生物会产生抗冻蛋白(antifreeze protein，以下简称为“AFP”)等冰结晶化抑制物质，以作为防止细胞冻结的手段。AFP为一种具有热滞后、抑制水溶液冻结、控制冰结晶形状等作用的蛋白质，从例如鱼类、昆虫、植物、菌类、微生物等中有发现。
在至今所发现的来源于鱼类、昆虫类及微生物的AFP中，有的来自杜父鱼科鱼类，有的来自拟步甲虫的幼虫等昆虫类，有的来自黄杆菌属等微生物，以上物质具有较高的冰结晶化抑制活性(专利文献1～3)。另外，作为来自植物的AFP，例如，公知有来自冬黑麦或胡萝卜的AFP(非专利文献1～2)。
另外，作为来源于菌类的AFP，公知有例如来自雪腐病核瑚菌（Typhulaishikariensis）及南极产金针菇(Flammulina velutipes KUAF-1)等担子菌类的AFP(专利文献4～5)。
近年来，尝试着将上述性质用于工业中，将AFP用于维持冰淇淋等冷冻点心制品及冷冻食品的品质(专利文献6～7)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-83546号公报
专利文献2：日本特表2002-507889号公报
专利文献3：日本特开2004-161761号公报
专利文献4：日本特开2004-24237号公报
专利文献5：日本特开2004-275008号公报
专利文献6：国际公开第92/22581号小册子
专利文献7：国际公开第94/03617号小册子
非专利文献
非专利文献1：Plant Physiology(植物生理学)，第119卷，第1361～1369页(1999年)
非专利文献2：Biochem.J.(生物化学杂志)，第340卷，第385～391页(1999年)
发明内容
发明要解决的课题
但是，难以完全除去来源于鱼类的AFP的异味。另外，昆虫及微生物难以作为食品原料，所以来自昆虫及微生物的AFP不适宜用于食品。
另一方面，由于植物一直以来被用作食品原料，因此期待将来自植物的AFP用于食品。但是，由于其与冰的结合能力比其它AFP弱且热稳定性不充分等理由，基本未能实现工业化。
因此，本发明要解决的课题在于提供冰结晶化抑制剂，其适于实用、具有优异的冰结晶化抑制活性，且可以通过用于食品制造的安全的工序高效稳定地制造。另外，本发明的目的还在于提供与该冰结晶化抑制剂进行特异性反应的抗体以及包含该冰结晶化抑制剂的组合物、食品、生物试样保护剂及化妆品。本发明的目的进一步在于提供来源于担子菌的多糖类用于抑制含水液体的冰结晶化的用途及用于抑制含水液体的冰结晶化的方法。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决所述课题进行潜心研究。其结果是，从担子菌中新发现了具有高的冰结晶化抑制活性且能够稳定地供给并实现工业化应用的非蛋白质型冰结晶化抑制物质，从而完成了本发明。
本发明涉及的抗体，与所述冰结晶化抑制剂特异性地进行反应。
本发明涉及的组合物、食品、低温保护剂及化妆品含有所述本发明涉及的冰结晶化抑制剂。
本发明涉及的担子菌来源的多糖类用于抑制含水液体的冰结晶化。另外，本发明涉及的用于抑制含水液体冰结晶化的方法包括将来源于担子菌的多糖类添加至该液体中的工序。
作为所述多糖类，可以举出：含有甘露糖和木糖的多糖，或包含半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖或上述中的两种以上的多糖。更具体而言，可以举出木糖甘露聚糖。作为木糖甘露聚糖，具体的可以举出如下物质：对构成木糖甘露聚糖的甘露糖和木糖的构成比而言，相对于1摩尔木糖，甘露糖为1.5摩尔以上且2.5摩尔以下，分子量为280,000以上且340,000以下。
作为产生本发明涉及的冰结晶化抑制剂的担子菌，可以举出：金针菇(Flammulina velutipes种)、荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes种)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii种)、玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji种)、滑蘑(Pholiotanameko种)、及其近缘品种或者改良品种，可以特别优选举出金针菇(Flammulina velutipes属)及其近缘品种及改良品种。
发明效果
本发明涉及的冰结晶化抑制剂可以由用于食用的担子菌容易地获得且为多糖类，因此对生物体而言非常安全。另外，由于其为担子菌来源的，因此可以稳定地供给。而且，本发明涉及的冰结晶化抑制剂具有适于实用的优异的冰结晶化抑制活性。
具体实施方式
本发明涉及的冰结晶化抑制剂包含担子菌来源的多糖类。
本发明涉及的冰结晶化抑制剂为多糖类，该多糖类具有通过与冰结晶化的结晶面结合等来抑制冰结晶生长的功能，其意指由热滞后测定、冰结晶结构观察、冰结晶化抑制测定等公知的任意方法所定义的具有冰结晶化抑制活性的多糖类。
所谓热滞后，是指在含有冰结晶化抑制剂的水溶液中，即使在平衡熔点以下的温度时，也不会发生冰生长的温度范围，若将冰在水溶液中开始生长的温度定义为凝固点，则热滞后被作为平衡熔点和凝固点之差进行检测。
本发明涉及的冰结晶化抑制剂为多糖类。通常，多糖类是指10个以上单糖通过糖苷键聚合成直链状或支链状而得到的物质。
多糖类分为：由一种单糖构成的单纯多糖即同多糖类、和由两种以上单糖构成的复合多糖即杂多糖类。作为同多糖类，例如，可以举出，直链淀粉及支链淀粉等淀粉；糖原；纤维素；葡聚糖；木聚糖；甘露聚糖等。作为杂多糖类，例如，可以举出，透明质酸、肝素、木糖甘露聚糖、木糖葡聚糖、葡糖甘露聚糖等。
本发明涉及的担子菌来源的多糖类没有特别限定，例如，可以举出，含有甘露糖和木糖的多糖、或者包含半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖或上述中的两种以上的多糖。本发明涉及的担子菌来源的多糖类，优选为杂多糖类，更优选为木糖甘露聚糖。木糖甘露聚糖为木糖的每个分子作为侧链经由1,4-键连接在由α-1,3-甘露糖构成的甘露聚糖主链上而成的杂多糖类的总称。其中，本发明涉及的木糖甘露聚糖不限定于仅由甘露糖和木糖构成的物质，也可以具有除木糖之外的其它糖作为侧链。
在本发明中，构成木糖甘露聚糖的甘露糖和木糖的构成比没有特别限制，例如，相对于1摩尔木糖，优选甘露糖为1.5摩尔以上且2.5摩尔以下，更优选为1.7摩尔以上且2.3摩尔以下，进一步优选为1.9摩尔以上且2.1摩尔以下，特别优选为约2摩尔。
本发明涉及的冰结晶化抑制物质的分子量没有特别限定，例如，以通过凝胶渗透色谱法测定的平均分子量计，优选为100,000以上且1,000,000以下。作为该平均分子量，更优选150,000以上，进一步优选200,000以上，更进一步优选240,000以上，特别优选280,000以上，另外，更优选500,000以下，进一步优选400,000以下，更进一步优选370,000以下，特别优选340,000以下。
由于本发明涉及的冰结晶化抑制剂为担子菌来源，因此，可以由担子菌来制造。下面，对本发明涉及的冰结晶化抑制剂的制造方法进行说明。
(1)培养工序
本发明涉及的冰结晶化抑制剂，可以由市售担子菌或采集的担子菌来制造。但是，特别是在工业化大量生产时，培养担子菌更为有效。即在获取本发明涉及的冰结晶化抑制剂时，可以任意地培养担子菌。
作为产生本发明涉及的冰结晶化抑制剂的担子菌，可以举出属于伞菌目的菌类。作为属于伞菌目的担子菌，例如，可以举出属于以下科的担子菌：蜡伞科、口蘑科、鹅膏菌科、蘑菇科、鬼伞科、球盖菇科、丝膜菌科、牛肝菌科、红菇科、多孔菌科、侧耳科。
作为属于蜡伞科的担子菌，可以举出，褐盖蜡伞等。作为属于口蘑科的担子菌，可以举出，黄蘑、紫丁香蘑、银白离褶伞、离褶伞(Lyophyllumsykosporum)、烟色离褶伞、晶盖粉褶菌、荷叶离褶伞菌、真姬菇、玉蕈离褶伞、大盖小皮伞、贝形圆孢侧耳、干小皮伞、红蜡蘑、蜜环菌、亚侧耳、松茸、棕灰口蘑、埃杜拉香菇、金针菇等；作为属于鹅膏菌科的担子菌，可以举出，花柄橙红鹅膏菌、黄毒伞等；作为属于蘑菇科的担子菌，可以举出，洋蘑、草原黑蘑等；作为属于鬼伞科的担子菌，可以举出，墨汁鬼伞等；作为属于球盖菇科的担子菌，可以举出，滑蘑等；作为属于丝膜菌科的担子菌，可以举出，皱盖丝膜菌等；作为属于牛肝菌科的担子菌，可以举出，牛肝菌等；作为属于红菇科的担子菌，可以举出，绿菇等；作为属于多孔菌科的担子菌，可以举出，舞茸等；作为属于侧耳科的担子菌，可以举出，杏鲍菇等。
本发明涉及的冰结晶化抑制剂没有特别限定，例如，优选由金针菇(Flammulina velutipes种)、荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes种)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii种)、玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji种)、滑蘑(Pholiotanameko种)获得，更优选由金针菇获得。
在上述金针菇中，优选人工栽培的白色豆芽状市售金针菇(Flammulinavelutipes种)。这样的市售金针菇通常可食用，可以容易获得，由单位重量担子菌类获得的萃取物所具有的冰结晶化抑制活性优异，在这方面考虑，更为优选。
需要说明的是，也可以适当使用上述担子菌的近缘品种及改良品种。
在本发明中，“近缘品种”是指：例如，科的近缘品种是指即使属于同一属的菌类在学术分类上仍然称为相近品种，具体菌株的近缘品种是指即使属于同一科的菌株在学术分类上仍然称为相近品种。另外，“改良品种”是指通过人工选择、杂交、突变、基因重组等改良后的菌类。
作为本发明中使用的培养担子菌的方法，没有特别限定，可以使用固体培养法或液体培养法等公知的方法来进行。例如在固体培养法中，在含有蔗渣、小麦麸、米糠等植物纤维质原料的固体培养基上接种菌丝体并对其进行培养，由此可以得到菌丝体或子实体。另外，液体培养法可以在含有菌株同化所需碳源、氮源、无机物及其他必须的营养素的培养基上接种菌丝体后，通过公知的振荡培养、通气搅拌培养或静止培养等来进行。
培养温度及培养时间等培养条件作适当调整即可，优选在低温下进行培养。通过在较低温度培养担子菌，即低温驯化，可以衍生冰结晶化抑制剂。作为培养温度，例如，优选25℃以下，更优选20℃以下。另一方面，在低于零度的情况下，存在液体培养基冻结的担忧，因此，优选采用0℃以上。
培养时间没有特别限制，优选培养三天以上，更优选一周以上，进一步优选两周以上，特别优选一个月以上。另外，培养时间的上限也未作特别限制，培养至担子菌成为融合状态或培养基中的冰结晶化抑制剂浓度不再升高即可，例如，优选六个月以下，更优选五个月以下，进一步优选四个月以下，特别优选三个月以下。
(2)萃取工序
本发明涉及的冰结晶化抑制剂，可以通过萃取等由担子菌纯化而成。例如，可以举出在碱水溶液中对上述担子菌进行加热萃取处理的方法。
本发明中使用的担子菌部位没有特别限定，例如菌丝体和子实体的任何一种均可使用。需要说明的是，可以仅使用以上部位之一，也可以并用多个部位。
作为用于萃取本发明涉及的冰结晶化抑制剂的担子菌的形态，可以使用原生状态的担子菌、其粉碎物、其磨碎物、其干燥物及干燥粉碎物，另外，作为原生状态担子菌，除了从通过上述培养方法等得到的菌丝体培养物分离出来的菌丝体之外，也可以使用菌丝体培养物本身。
在经过任意上述处理后的担子菌中加入碱水溶液进行加热萃取处理，由此可以得到本发明涉及的冰结晶化抑制剂。
作为用于制备碱水溶液的碱性物质，可以使用例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、多聚磷酸钠、柠檬酸三钠、碳酸氢钠、醋酸钠、焦磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、煅烧钙等，在使用时，可以单独使用或者作为两种以上的混合物使用。
碱水溶液的浓度，根据多糖类的种类等加以适当调整即可，例如，优选0.1w/v%以上，更优选1.0w/v%以上，进一步优选2.0w/v%以上，进一步优选5.0w/v%以上，进一步优选10.0w/v%以上，进一步优选15.0w/v%以上，特别优选20.0w/v%以上，另外，优选50w/v%以下，更优选30w/v%以下，进一步优选25w/v%以下。浓度低于0.1w/v%时，目标冰结晶化抑制剂的萃取效率不充分，另外，浓度高于50w/v%时，在成本及安全方面存在问题，故不优选。
作为加热萃取处理温度，优选70℃以上，更优选80℃以上，进一步优选90℃以上，最优选约100℃。作为加热萃取处理方法，例如，可以在加入碱水溶液之后，一边将其加热至给定温度一边进行萃取，也可以加入预先加热至给定温度的碱水溶液并在对其进行保温的状态下进行萃取。
更具体而言，可以在担子菌干燥粉碎物中加入25w/v%氢氧化钾水溶液，在100℃萃取2～3小时并进行过滤或离心分离，由此得到萃取液，将该萃取液用作冰结晶化抑制剂。也可以进一步对萃取残渣重复进行同样的萃取处理，将得到的萃取液混合并将其用作冰结晶化抑制剂。
(3)纯化工序
上述得到的萃取液可以直接使用，但优选通过中和或透析等众所周知的方法除去碱性物质，将除去碱性物质后的萃取液、其浓缩液、其干燥物及干燥粉碎物用作冰结晶化抑制剂。
可以根据需要对如上述那样得到的冰结晶化抑制剂进行进一步纯化。例如，可以适当地组合倾析、过滤及离心分离等除去杂质成分。另外，也可以适当地组合以下方法进行纯化，例如，通过盐析或有机溶剂而进行的沉淀；或通过亲和色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤、使用低速冷却装置的与冰进行结合等进行的纯化；通过透析或超滤等进行的浓缩。
(4)制剂化
根据需要，可以进一步将本发明涉及的冰结晶化抑制剂固型化为粉末状或颗粒状等任意形态。固型化的方法没有特别限定，例如，可以举出，通过喷雾干燥或冷冻干燥等常用方法对上述萃取物进行粉末化的方法，将萃取物吸附或负载于赋形剂之上从而固型化为粉末或颗粒状的方法等。这些操作为本领域技术人员所公知，可以根据用途适当选择使用。
本发明涉及的冰结晶化抑制剂结合在冰结晶的结晶面上抑制冰结晶生长。另外，其结合阻止了自由水进一步结合至冰结晶上，由此抑制冰的再结晶化。
本发明涉及的冰结晶化抑制剂的冰结晶化抑制活性的测定方法，可以根据其种类及所使用担子菌的种类等，使用合适的方法。例如，可以通过热滞后测定、冰结晶结构的观察、冰结晶化抑制测定等公知的方法来进行，在通过任意方法确认冰结晶化抑制活性提高的情况下，则包含在本发明范围内。
例如，可以如下测定冰结晶化抑制活性：将含有30w/v%蔗糖的冰结晶化抑制剂水溶液冷却至-40℃之后，升温至-6℃，测定利用显微镜观察的冰结晶的平均面积。冰结晶化抑制活性越强，该冰结晶的平均面积越小，因此，用平均值除以按照同样的方法对用作对照的、蔗糖的30w/v%水溶液测得的冰结晶平均面积，将得到的数值作为指标，由此可以对冰结晶化抑制剂的冰结晶化抑制活性进行定量评价。需要说明的是，该值被称为RI值。例如，与对照相比，添加冰结晶化抑制剂时即使仅稍稍地抑制冰结晶生长，也可以判断其具有冰结晶化抑制活性。
在由于水的冰结晶化而产生障碍的各种领域中，本发明涉及的冰结晶化抑制剂可以基于抑制该障碍的目的加以利用。例如，可以在食品领域、机械领域、土木领域、化妆品领域、使用生物材料的医疗领域等中使用。
在食品领域中，通过抑制食品中所包含的水的冰结晶化，可以防止该食品口味的劣化等。例如，通过防止淀粉老化，此外抑制由于食品中的水冰结晶化而物理性压迫蛋白质及油脂成分等，从而导致其结构变化所带来的口味及品质等劣化，由此可以改善冷冻食品等的品质。
在机械领域和土木领域中，可以用作机械可动部、道路、地基等的防冻剂。
在化妆品领域中，可以用作防止化妆品品质劣化等的添加剂。例如，含有油脂成分的化妆品冻结时，该化妆品中所含有的水产生冰结晶化，有时会物理性压迫该油脂成分，从而破坏其结构，由此品质及使用感变差。使用本发明涉及的冰结晶化抑制剂时，通过防止水的冰结晶化来保持油脂成分的结构，因此，可以抑制品质劣化等。
在医疗领域中，可以将其用作冷冻保存生物样品时的保护剂。例如，将细胞、血液、器官等组织等的生物样品放入现有已知的保存液中冷冻保存时，保存液中的水分冻结产生冰结晶，有时该冰结晶会对生物样品产生损伤。然而，如果添加本发明涉及的冰结晶化抑制剂，则可以抑制冰结晶的产生、生长，因此可以保护生物样品不受冰结晶所产生的损伤。
根据其用途的不同，本发明涉及的冰结晶化抑制剂具有多种形态，可以为原本形态、溶液、浓缩液、悬浮液、冷冻干燥物、粉末、颗粒及片剂等。另外，也可以与赋形剂等混合制成组合物。
另外，本发明涉及的抗体为与上述冰结晶化抑制剂进行特异性反应并结合的物质，可以用于测试担子菌或其培养液中有无该冰结晶化抑制剂或用于鉴定源于担子菌培养液等的具有冰结晶化抑制活性的多糖类。
本发明涉及的抗体根据常用方法来制备即可。例如，使用上述冰结晶化抑制剂对小鼠或大鼠等进行免疫，使其产生抗体细胞或脾细胞与骨髓瘤细胞相融合，得到杂交瘤细胞。克隆该杂交瘤细胞，筛选产生与上述冰结晶化抑制剂进行特异性反应的克隆体。对该克隆体进行培养并纯化所分泌的单克隆抗体即可。
如上所述，本发明涉及的担子菌来源的多糖类可以用于抑制含有水的液体的冰结晶化。另外，本发明涉及的抑制含水液体的冰结晶化的方法包括将来源于担子菌的多糖类添加至该液体中的工序。
在本发明中，对需要抑制其产生冰结晶化的液体而言，只要含有水作为溶剂即可而没有特别限制，例如，可以举出，水本身、溶解有溶质的水溶液、分散有不溶成分的悬浮液。另外，对需要抑制冰结晶化的液体而言，只要存在冰结晶化问题即可，也可以含有水混和性有机溶剂。作为这样的水混和性有机溶剂，例如，可以举出，乙醇等醇类或乙二醇等二醇类等。
在通过本发明涉及的担子菌来源的多糖类来抑制液体冰结晶化的情况下，根据液体中含有的溶质的浓度及凝固点等对多糖类的添加量进行适当调整即可，例如，以糖浓度计，可以采用0.05μg/ml以上且10mg/ml以下左右。该浓度为0.05μg/ml以上时，可以更可靠地抑制液体冰结晶化。另一方面，该浓度过高时，有时效果饱和，因此，该浓度优选10mg/ml以下。该浓度更优选0.1μg/ml以上，进一步优选0.5μg/ml以上，另外，更优选1mg/ml以下，进一步优选400μg/ml以下，特别优选200μg/ml以下。
在本发明的方法中，除了有意识地向需要抑制冰结晶化的液体中添加本发明的多糖类之外，也包含从结果上说将本发明多糖类与需要抑制冰结晶化的液体混合的情况。例如，向道路等散布本发明的多糖类，该多糖类与夜里的露水接触而溶解，从而抑制道路等的冻结的情况也包含在本发明涉及的范围之内。
实施例
以下示出实施例对本发明进行更为具体的说明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例1
在容量500ml的三角烧瓶中放入100ml的YG培养基(含有0.25%酵母提取物和1%葡萄糖，pH为6.0)，接种市售的金针菇(Flammulina velutipes种)菌丝。在18℃、以120rpm进行旋转培养一周，再于4℃进行低温驯化培养一周。
洗涤低温驯化之后的金针菇菌丝并冷冻干燥，在由此得到的干燥金针菇菌丝(50g)中加入水(500ml)，在100℃加热6小时。接着，滤取固体成分。对得到的残渣重复同样的热水处理三次，回收残渣(34.4g)。
接着，在热水处理之后的上述残渣(34.4g)中加入2w/v%氢氧化钾水溶液(500ml)，在100℃加热2.5小时(以下称为“2%KOH处理”)。滤取固体成分，对得到的残渣重复同样的2%KOH处理三次。在得到的残渣中加入25w/v%氢氧化钾水溶液(500ml)，以100℃加热2.5小时(以下称为“25%KOH处理”)。对处理之后的残渣重复同样的25%KOH处理三次，回收各萃取液并混合。
利用蒸发器对得到的溶液进行浓缩，在浓缩后溶液中加入3倍体积量的乙醇。将通过添加乙醇所产生的沉淀物悬浮在水中，利用醋酸水溶液进行中和之后，用水透析48小时。将其冷冻，然后，再于4℃的条件下缓慢溶解，通过离心分离进行分离并回收生成的沉淀物。
将得到的沉淀物溶解在二甲基亚砜(DMSO)中并在40℃处理48小时，然后回收上清液，通过冷冻干燥除去DMSO，由此得到木糖甘露聚糖级分(0.164g)。将得到的木糖甘露聚糖级分溶解在水(46ml)中，分别利用苯酚硫酸法和双辛可宁酸法(BCA法)测得糖浓度和蛋白质浓度分别为6.3μg/ml、4.4μg/ml。
实施例2
将实施例1中得到的木糖甘露聚糖级分的水溶液稀释至其糖浓度为1.0μg/ml(蛋白质浓度0.7μg/ml)，测定冰结晶化抑制活性。具体而言，首先，按照30w/v%的比例向该稀释溶液中添加蔗糖。在具备冷却调节功能的具有载物台的显微镜下，将该溶液冷却至-40℃之后再升温至-6℃，以溶解冰结晶，在保持-6℃的状态下观察30分钟，测定此时所确认的冰结晶面积，由此测定冰结晶化抑制活性。冰结晶化抑制活性越强，该冰结晶的平均面积越小，因此，用该平均面积除以按照同样的方法对用作对照的、蔗糖的30w/v%水溶液测得的冰结晶平均面积，将得到的数值(RI值)作为指标，由此对冰结晶化抑制活性进行定量评价，其结果RI值为0.25。需要说明的是，RI值越较1.0小，则表示冰结晶化抑制活性越强。
实施例3
除使用干燥金针菇菌丝0.46g之外，通过实施例1相同的方法，对木糖甘露聚糖级分1.5mg进行纯化。将得到的木糖甘露聚糖级分溶解在含有0.3M氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，得到的水溶液(200μl、糖浓度3.9mg/ml、蛋白质浓度17μg/ml)作为试样，上样至凝胶过滤柱(东曹公司制造的TSK-gelG3000SＷXL、21.5mm I.D.×30cm)，在4℃的温度条件下，以2.0ml/分钟的流速条件流过上述磷酸缓冲液，从而洗脱非吸附级分，在215nm和280nm的吸收波长下进行检测。
通过凝胶过滤而得到的非吸附级分中，在分子量约为310,000处确认到单一的峰。回收该级分，与上述实施例2同样地，确认到冰结晶化抑制活性。
实施例4
将实施例3中得到的纯化样品溶解在含有7v/v%乙腈的0.2M硼酸钾缓冲液(pH8.9)中。得到的水溶液(50μl、纯化样品1.0μg)作为试样，上样至糖成分分析用柱(生化学工业公司制造的Honenpak C18，21.5mm I.D.×30cm)中，在30℃的温度条件下，以1.0ml/分钟的流速条件，将上述硼酸钾缓冲液作为洗脱液洗脱，在305nm激发波长、360nm荧光波长处进行检测。另外，在同样的条件下，洗脱甘露糖、葡萄糖、木糖(各1.5nmol)作为标准物质。由得到的峰保留时间和荧光强度确认纯化样品的糖组成(摩尔比)为甘露糖：木糖＝2：1。
实施例5
冷冻干燥市售的荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes种)子实体。在得到的干燥荷叶离褶伞子实体(0.2g)中添加15w/v%氢氧化钾水溶液(10ml)，在100℃加热处理2.5小时。接着，以10,000×g离心分离20分钟，由此得到粗提液。
使用乙醇对通过与实施例1相同的方法得到的粗提液进行处理，回收生成的沉淀物。将得到的沉淀物溶解于20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，将其作为乙醇回收级分。
实施例6
通过与实施例5相同的方法，由市售的杏鲍菇(Pleurotus eryngii种)子实体得到乙醇回收级分。
实施例7
通过与实施例5相同的方法，由市售的玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji种)子实体得到乙醇回收级分。
实施例8
通过与实施例5相同的方法，由市售的滑蘑(Pholiota nameko种)子实体得到乙醇回收级分。
实施例9
将实施例5～8中得到的担子菌的乙醇回收级分，分别用水稀释至糖浓度为1.0μg/ml，通过与实施例2相同的方法测定冰结晶化抑制活性。将结果示于表1。
[表1]
实施例10
通过与实施例3相同的方法，利用凝胶渗透色谱法，对实施例5中得到的荷叶离褶伞的乙醇回收级分进行分级，得到显示分子量约为467,000的峰的级分。将得到的级分的糖浓度调整为5.0mg/ml，通过与实施例2相同的方法，测定冰结晶化抑制活性，结果RI值为0.29。
实施例11
通过与实施例4相同的方法，分析实施例10中得到的纯化样品的糖组成。其结果是，由得到的峰的保留时间确认：纯化样品为包含半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖及鼠李糖的多糖。
实施例12
通过与实施例1相同的方法，冷冻干燥金针菇菌丝。对得到的干燥金针菇菌丝(20.0g)反复进行热水处理三次之后，添加2.0w/v%氢氧化钾水溶液(200ml)，在100℃加热处理2.5小时。接着，以10,000×g离心分离20分钟，由此得到粗提液。通过对得到的粗提液进行冷冻干燥，得到粗木糖甘露聚糖级分(2.05g)。
实施例13冷冻章鱼烧
根据表2的配比，将实施例12中得到的粗木糖甘露聚糖级分的水溶液与市售的章鱼烧粉混合，使用家用章鱼烧设备制成章鱼烧。使用商用快速冷冻机在-20℃冻结得到的章鱼烧。另外，为了进行比较，除了不使用粗木糖甘露聚糖组分之外，同样地制作章鱼烧并冷冻。需要说明的是，对于上述各粗木糖甘露聚糖级分的浓度而言，其蛋白质浓度分别为10μg/ml和50μg/ml。
[表2]
将得到的冷冻章鱼烧保存一周之后，在常温下解冻，切成两段并观察切面。其结果是，未含有粗木糖甘露聚糖组分的章鱼烧，由于冻结和解冻而产生劣化，表面和内部之间产生了间隙。另一方面，添加粗木糖甘露聚糖组分的章鱼烧的表面和内部不存在分离，保持冻结前的状态。由此可证明使用本发明涉及的冰结晶化抑制剂时，即使将食品冷冻也可以保持其品质。
实施例14冷冻蒸蛋黄
将实施例12中得到的粗木糖甘露聚糖组分混合在蛋黄中。此时，调整粗木糖甘露聚糖组分的量，以使其中蛋白质浓度为50μg/ml。使用水式烘炉(SHARP公司制造的Healsio AX-MX1-R)，对得到的蛋黄蒸制15分钟，制成蒸蛋黄。接着，使用商用快速冷冻机，在-20℃将得到的蒸蛋黄冻结。另外，为了进行比较，除了不使用粗木糖甘露聚糖组分之外，同样地制作蒸蛋黄并冷冻。
将得到的各蒸蛋黄保存一周之后，在常温下解冻，比较外观和口感。其结果是，未含有粗木糖甘露聚糖组分的蒸蛋黄，由于冻结和解冻而表面粗糙，口感变得非常松散。另一方面，添加粗木糖甘露聚糖组分的蒸蛋黄，表面仍然细腻，入口有弹性，有水润感，保持冻结前的状态。由此可以证明使用本发明涉及的冰结晶化抑制剂时，即使将食品冷冻也可以保持其品质。
实施例15冷冻细胞的保护
根据通用方法(Theodore T.PUCK等、The Journal lf Experimental Medicine,vol.108,pp.945-(1958))，对中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)进行传代培养，然后，通过胰蛋白酶处理进行剥离，通过离心分离进行回收。在回收的细胞中加入培养基，再次离心分离，除去胰蛋白酶。将得到的细胞悬浮在细胞冷冻保存液(日本全药工业公司制造的Cell Banker)中。向该悬浮液中添加通过与实施例1相同的方法得到的纯化木糖甘露聚糖级分，使用移液管进行充分混合。以其蛋白质浓度计，该悬浮液中纯化木糖甘露聚糖级分的浓度分别为20μg/ml、50μg/ml及200μg/ml。以每次1ml的方式将得到的细胞液分批注入冻存管并在-80℃的低温冷冻箱中冷冻。
另外，为了进行比较，将如上述同样回收的CHO细胞悬浮在10v/v%DMSO溶液中，使用移液管充分混合之后，以每次1ml的方式将得到的细胞液分批注入冻存管并在-80℃的低温冷冻箱中冷冻。
为了进行进一步比较，将如上述那样回收的CHO细胞悬浮在不含有木糖甘露聚糖的细胞冷冻保存液(日本全药工业公司制造的Cell Banker)中，使用移液管充分混合之后，以每次1ml的方式将得到的细胞液分批注入冻存管并在-80℃的低温冷冻箱中冷冻。
将上述得到的细胞冷冻保存液在冷冻库中冻存2天。接着，从冷冻库取出冻存管，快速浸渍在37℃的水浴中解冻。解冻后，将细胞快速地悬浮在培养基(10ml)中并进行离心分离。将回收的细胞再次悬浮在培养基(1ml)中。利用台盼蓝对得到的细胞悬浮液中含有的死细胞进行选择性染色。使用红血球计数板统计活细胞和死细胞，算出细胞生存率。将结果示于表3。
[表3]
如表3中的结果所示，悬浮在DMSO溶液中的细胞，由于冻结有85%死亡。在使用可以长期冷冻保存细胞的细胞冷冻保存液的
情况下，细胞生存率虽然提高，但也仅为83.2%。另一方面，在向细胞冷冻保存液中添加本发明涉及的冰结晶化抑制剂即木糖甘露聚糖级分的情况下，细胞生存率显著提高，约为100%。从以上结果可以明确，本发明涉及的冰结晶化抑制剂作为生物试样保护剂非常有用。
工业实用性
将本发明涉及的冰结晶化抑制剂添加在食品中，有助于保持食品的品质等。另外，也可以有效地用于冷冻保存器官、细胞、血液(血小板)等生物样本时的保护剂、及用于保护皮肤不受低温损害或具有低温稳定性优异等特性的化妆品中。

Claims (12)

1.冰结晶化抑制剂，其为担子菌来源的木糖甘露聚糖，构成所述木糖甘露聚糖的甘露糖和木糖的构成比为：相对于木糖1摩尔，甘露糖为1.5摩尔以上且2.5摩尔以下。
2.根据权利要求1所述的冰结晶化抑制剂，其中，所述木糖甘露聚糖是在碱水溶液中对担子菌进行加热萃取处理而成的。
3.根据权利要求1或2所述的冰结晶化抑制剂，其中，木糖甘露聚糖的分子量为280,000以上且340,000以下。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的冰结晶化抑制剂，其中，担子菌为金针菇(Flammulina velutipes种)、荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes种)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii种)、玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji种)、滑蘑(Pholiotanameko种)或其近缘品种或者改良品种。
5.根据权利要求4所述的冰结晶化抑制剂，其中，担子菌为金针菇(Flammulina velutipes种)或其近缘品种或者改良品种。
6.抗体，其与权利要求1～5中任一项所述的冰结晶化抑制剂特异性地进行反应。
7.组合物，其包含权利要求1～5中任一项所述的冰结晶化抑制剂。
8.食品，其包含权利要求1～5中任一项所述的冰结晶化抑制剂。
9.生物试样保护剂，其包含权利要求1～5中任一项所述的冰结晶化抑制剂。
10.化妆品，其包含权利要求1～5中任一项所述的冰结晶化抑制剂。
11.来源于担子菌的木糖甘露聚糖用于抑制含水液体的冰结晶化的用途，其中构成所述木糖甘露聚糖的甘露糖和木糖的构成比为：相对于木糖1摩尔，甘露糖为1.5摩尔以上且2.5摩尔以下。
12.用于抑制含水液体的冰结晶化的方法，其包括：将来源于担子菌的木糖甘露聚糖添加至该液体中的工序，其中构成所述木糖甘露聚糖的甘露糖和木糖的构成比为：相对于木糖1摩尔，甘露糖为1.5摩尔以上且2.5摩尔以下。
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