JP2006225315A

JP2006225315A - 地衣類からの氷結晶制御物質の製造方法

Info

Publication number: JP2006225315A
Application number: JP2005040792A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Obata; 斉小幡; Hidehisa Kawahara; 秀久河原
Original assignee: Kansai University
Current assignee: Kansai University
Priority date: 2005-02-17
Filing date: 2005-02-17
Publication date: 2006-08-31

Abstract

【課題】氷結晶制御物質、とりわけ氷核タンパク質と不凍タンパク質を簡単な工程で効率よく、安価に製造する。特に、本発明は、１つの生物種から、食品に使用することのできる安全な氷核タンパク質と不凍タンパク質を同時に効率よく、安価に製造する技術を確立する。
【解決手段】地衣類の抽出物を有機溶媒にて分画することを特徴とする、地衣類からの氷核タンパク質および不凍タンパク質の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、地衣類からの氷結晶制御物質の製造方法に関する。詳細には、本発明は、地衣類の抽出物を有機溶媒にて分画することを特徴とする、地衣類からの氷核タンパク質および不凍タンパク質の製造方法に関する。

これまでに、低温下で棲息する生物が、氷結晶制御物質として氷核タンパク質と不凍タンパク質を生産することが明らかにされている。これらのタンパク質は、食品分野、医薬品分野、機械分野、土木建築分野、農業分野などにおける応用が期待されている。氷核タンパク質は、例えば、人工降雪剤として実用化されており、食品の凍結濃縮剤としての利用も始まっている。さらに土木工事における含水量の高い地層を凍結させて工事をしやすくする用途についても研究されている。また、不凍タンパク質は、細胞や組織を凍結から守る用途、例えば、冷凍食品の融解時のドリップ防止、精子や臓器などの凍結保存、機器の可動部の凍結防止、除霜剤などへの利用について多くの研究が行われている。なかでも、食品への応用には安全性の高い氷核タンパク質と不凍タンパク質が求められており、多くの研究や特許出願がある。例えば、凍結濃縮に用いる氷核タンパク質は、キサンタンガム生産菌であるキサントモナス・キャンペストリスが生産菌として特許出願されている（特許文献１参照）。また、不凍タンパク質に関しては、魚由来のもの（特許文献２等参照）、担子菌由来のもの（特許文献３等参照）、冬野菜由来のもの（特許文献４参照）や細菌由来のもの（特許文献５参照）がある。また、安全性とは関係なく、新規物質として地衣類由来の不凍タンパク質が報告されている（特許文献６参照）。地衣類は南極など極寒の地域でも高い耐凍性によって棲息しており、その氷核タンパク質と不凍タンパク質の両タンパク質についての論文も報告されている（非特許文献１および２参照）。

しかしながら、これらのタンパク質の需要が増大する一方で、製造がそれに伴わないという問題が生じている。これらのタンパク質の起源生物が限られているうえ、製造工程が複雑で、困難あるいは非効率的な工程を含むことがその理由である。しかも、これらのタンパク質は、特に食品に利用する場合、安全なものが要求される。例えば、氷核タンパク質については、安全性の高いキサントモナス・キャンペストリスから生成し、菌体自身を破砕して得られた破砕物を溶液として利用されているが、多糖との分離工程が厄介なものとなっている。また、不凍タンパク質についても同様の問題があり、工業的スケールでの生産が困難なものが多い。そのうえ、１つの生物種から氷核タンパク質と不凍タンパク質を同時に効率よく製造する技術はまだ確立されていない。
特開平６−１１３８２５号公報特開２００４−０８３５４６号公報特願２００３−６６２８６号特開２００１−２４５６５９号公報特開２００４−１６１７６１号公報特公２００２−５０８３０３号 Mol. Microbiol., 5, 239-243 (1991) Cryobiology, 40, 218-227 (2000)

上述のごとく、氷結晶制御物質、とりわけ氷核タンパク質と不凍タンパク質を簡単な工程で同時に効率よく、安価に製造することが当該分野において課題となっている。特に、本発明は、１つの生物種から、食品に使用することのできる安全な氷核タンパク質と不凍タンパク質を同時に効率よく、安価に製造する技術を確立することを解決課題とした。

本発明者らが上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、地衣類の抽出物を有機溶媒にて分画することにより氷核タンパク質画分と不凍タンパク質画分とに容易に分画できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は：
（１）地衣類の抽出物を有機溶媒にて分画することを特徴とする、地衣類からの氷核タンパク質および不凍タンパク質の製造方法、
（２）地衣類が食用地衣類である（１）記載の方法、
（３）食用地衣類がムシゴケである（２）記載の方法、
（４）有機溶媒がエタノールである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法
（５）ムシゴケの抽出物をエタノールにて分画することにより得られる、氷核タンパク質および不凍タンパク質。
を提供するものである。

本発明によれば、地衣類から、抽出および有機溶媒分画という簡単な工程により、氷核タンパク質と不凍タンパク質を、同時に効率よく、比較的高純度で、かつ安価に製造する方法が提供される。しかも、食用地衣類をタンパク質源として用いた場合、安全な氷核タンパク質と不凍タンパク質が同時に得られる。

上述のごとく、本発明は、地衣類の抽出物を有機溶媒にて分画することを特徴とする、地衣類からの氷結晶制御物質、とりわけ氷核タンパク質および不凍タンパク質の製造方法に関するものである。本発明の方法に使用する生物種は地衣類である。多種多様な地衣類が地球上に広く分布しており、その棲息環境も様々である。地衣類は、子嚢地衣類（ホシゴケ、ピンゴケ、モジゴケ、サラゴケ、キゴウゴケ、ツメゴケ、トリハダゴケ、サネゴケ、アナイボゴケなど）、担子地衣類（ケットゴケ、アオウロコゴケなど）、不完全地衣類（レプラゴケなど）に分類されている。また、外形によって葉状地衣類（キウメノキゴケ、マツゲゴケなど）、樹枝状地衣類（ハナゴケ、サルオガセなど）、固着地衣類（チャシブゴケ、モジゴケなど）に区別されている。本発明に用いる地衣類はいずれの種類のものであってもよいが、寒冷地、例えば、極地や高山地域に棲息する地衣類が好ましい。そのような地衣類の例としては、ダイダイゴケ、イワカラタチゴケ、サルオカゼ、ウメノキゴケなどが挙げられる。

得られるタンパク質の安全性の面から、本発明の方法に使用する地衣類は食用であることが好ましい。食用地衣類の例としては、イワタケ、バンダイキノリ、カブトゴケモドキ、ムシゴケ、ウメノキゴケなどが挙げられる。本発明の方法に用いる地衣類で特に好ましいものは、高山に棲息しているムシゴケ（Thamnolia vermicularis）である。ムシゴケを乾燥させたものは「雪茶」として市販されている。

本発明の方法の最初の工程において、地衣類を粉砕して内容物を抽出する。地衣類は生のままでも、乾燥したものであってもよい。地衣類の粉砕手段は各種のものが使用可能である。例えば、ポッター−エルベージェムホモジナイザーなどのホモジナイザー、ワーリングブレンダーなどのブレンダー、ダイノーミルなどの粉砕器、フレンチプレス、乳鉢および乳棒、らいかい器、液体窒素による凍結および破砕、超音波処理などの手段により地衣類を破砕することができる。地衣類破砕物を水、食塩水または適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液）などの媒体に懸濁し、内容物の抽出を行う。所望により、抽出時に撹拌してもよい。懸濁媒体は、目的タンパク質の変性が少ないもの、毒性が低いものが好ましい。好ましい懸濁媒体としては、水、食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが挙げられる。懸濁時の緩衝液、ｐＨ、温度、時間は使用地衣類の種類および目的とするタンパク質の種類や性質などに応じて選択することができる。目的タンパク質が氷核タンパク質や不凍タンパク質などの氷結晶制御物質の場合には低温で、例えば約２０℃以下の温度で抽出を行うことが好ましい。例えば、氷核タンパク質および不凍タンパク質の調製を目的としたムシゴケ内容物の抽出にはトリス塩酸緩衝液を用い、抽出温度を０〜１０℃、抽出ｐＨをｐＨ７．０〜８．０として、２０〜２４時間抽出するのが好ましい。

次工程において、有機溶媒を用いて地衣類抽出物を分画する。必要ならば、得られた抽出物を、デカンテーション、ろ過、または遠心分離などに付して固形分および粒子状物質を除去してから分画を行ってもよく、限外濾過などの手段によりあらかじめ分画および濃縮しておいてもよい。有機溶媒は水溶性のものであればいずれのものであってもよい。有機溶媒の種類は、使用地衣類の種類、目的とするタンパク質の種類や性質などに応じて選択することができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。好ましい有機溶媒は、目的タンパク質の変性が少ないもの、毒性が低いものである。好ましい有機溶媒としてはエタノールが挙げられる。

分画に用いる有機溶媒の濃度は、使用地衣類の種類、目的とするタンパク質の種類などに応じて様々な範囲で選択することができる。例えば、ムシゴケ抽出物を、０−５０％エタノール画分および５０％以上の画分に分けて、それぞれから氷核タンパク質および不凍タンパク質を得ることができる。有機溶媒による分画操作は、公知の操作と何ら変わることがないが、目的タンパク質が氷核タンパク質や不凍タンパク質の場合には低温で、例えば約２０℃以下の温度で操作を行うことが好ましい。

得られた画分を、そのまま、あるいは有機溶媒の除去、濃縮、凍結乾燥のごとき乾燥などの処理を行って、タンパク質標品として用いることができる。有機溶媒の除去は減圧蒸発による方法が一般的であるが、クロマトグラフィーなどの他の方法を用いてもよい。濃縮についても多くの方法が知られており、減圧濃縮、限外ろ過、硫安沈殿などの方法がある。

このように、本発明によれば、地衣類を凍結破砕後、抽出し、抽出物を有機溶媒にて分画するという簡単な工程で、氷核タンパク質画分および不凍タンパク質画分を同時に得ることができる。

必要に応じて、得られた画分をさらに精製してもよい。精製手段としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ｐＨ勾配クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの各種クロマトグラフィーのほか、さらなる有機溶媒での分画、硫安分画、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動などの手段を用いて精製することができる。目的タンパク質に応じて種々の濃縮、乾燥、精製手段を利用することができる。精製標品をそのまま用いてもよく、あるいは濃縮、乾燥などの処理に付してから用いてもよい。

タンパク質標品の形状は、使用目的に応じて様々であり、溶液、濃縮液、懸濁液、パスタ、ゲル、凍結乾燥物、粉末、顆粒、錠剤などに成形することができる。氷核タンパク質標品は様々な用途に使用することができる。例えば、人工降雪剤として使用でき、特に、食用地衣類由来のものは食品の凍結濃縮剤としても使用できる。さらに土木工事における含水量の高い地層を凍結させて工事をしやすくする用途もある。また、不凍タンパク質標品は、細胞や組織を凍結から守る用途、例えば、精子や臓器などの凍結保存、機器の可動部の凍結防止、除霜剤などに利用することができる。特に、食用地衣類由来のものは冷凍食品の品質保持剤として、例えば融解時のドリップ防止などに使用することができる。

次に、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であって、本発明を限定するものではない。

よく冷やした乳鉢に液体窒素と市販の「雪茶」（ムシゴケ乾燥物）を入れ、凍結粉砕したものを３．０ｇ秤量し、地衣類成分抽出緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液，ｐＨ７．４）１５０ｍｌに懸濁し、２４時間、５℃で撹拌した。超音波破砕し（レベル５．０、４時間）、遠心分離（４℃、２５０００Ｘｇ、３０分）、フィルター濾過（０．４５μｍ）した後、限外濾過（分画分子量１００００）を行い、濃縮したサンプルを粗抽出液とした。得られた粗抽出物をエタノール（ＥｔＯＨ）にて分画した。エタノール濃度を０−１０％、１０−２０％、２０−３０％、３０−４０％、４０−５０％、５０−６０％、６０−７０％、７０−８０％、８０％以上として分画を行った（本明細書において、エタノールの％は体積／体積である）。分画操作は、低エタノール濃度の画分から始めてエタノール濃度範囲ごとに遠心分離を行って沈殿と上清に分け、沈殿をトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、上清を次のエタノール濃度で処理することにより行った。

図１に、各画分の氷核活性、不凍活性、およびタンパク質量を示す。タンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。氷核活性はＶａｌｉの小滴凍結法で測定した。不凍活性はＭｅｙｅｒらの方法（FEBS Lett., 447, 171-178 (1999)）により測定した。図１の棒グラフからわかるように、氷核活性はエタノール０％から５０％までの画分に多く見られた。また、図１の氷結晶の写真からわかるように、不凍活性はエタノール５０％から８０％までの画分に特異的に見られた。エタノール８０％以上の画分には氷核活性、不凍活性ともに見られなかった。

エタノール０％から５０％までの画分を一緒にしてエタノール０−５０％画分とし、エタノール５０％から８０％までの画分を一緒にしてエタノール５０−８０％画分として、それぞれの氷核活性および不凍活性を調べた。表１に示すように、エタノール０−５０％画分の氷核形成温度がエタノール５０−８０％画分の氷核形成温度よりも低く、エタノール０−５０％画分に氷核活性が集中していることが示された。

エタノール０−５０％画分およびエタノール５０−８０％画分の不凍活性も調べた。図２に氷結晶の写真および熱ヒステレシスを示す。熱ヒステレシスはオスモメーターにて測定した。図２からわかるように、不凍活性がエタノール５０−８０％画分に特異的に存在することが示された。

エタノール０−５０％画分およびエタノール５０−８０％画分の熱安定性についても調べた。各画分を、トリス塩酸緩衝液中において図３に示す各温度に６０分間保った後、エタノール０−５０％画分については氷核活性を、エタノール５０−８０％画分については不凍活性を測定した。氷核タンパク質については、処理温度６０℃までは氷核形成温度にあまり差はなく、安定であることが示された。不凍タンパク質については、処理温度７０℃までは氷結晶の形態および熱ヒステレシスにあまり差はなく、安定であることが示された。

次に、エタノール０−５０％画分中の氷核タンパク質、ならびにエタノール５０−６０％、６０−７０％、７０−８０％画分、および粗抽出物中の不凍タンパク質の純度および分子量を調べた。氷核タンパク質についてはＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂによるゲルろ過クロマトグラフィーを用い（図４）、不凍タンパク質についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて分子量を測定した（図５）。氷核タンパク質はカラムのボイド体積で溶出され、分子量は４０万以上と推定され、凝集体の形成が示唆された。活性ピーク以外のところには目立ったタンパク質のピークは見られず、比較的高純度の氷核タンパク質の標品が得られたことがわかった。不凍タンパク質はエタノール６０−７０％画分中の不凍タンパク質の濃度は非常に高く、ほぼ１本のバンドとして出現し、その分子量は約３００００であった。エタノール５０−８０％画分の不凍タンパク質の純度も高いことがわかった。この不凍タンパク質は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過クロマトグラフィー分析によって、分子量６００００となり、分子量３００００の２量体であると考えられた（データ示さず）。

本発明は、地衣類から、抽出および有機溶媒分画という簡単な工程により、氷核タンパク質と不凍タンパク質を、同時に効率よく、比較的高純度で、かつ安価に製造する方法を提供するものである。しかも、食用地衣類をタンパク質源として用いた場合、安全な氷核タンパク質と不凍タンパク質が同時に得られる。したがって、本発明は、食品分野、医薬分野、土木建築分野、農業分野、人工降雪などに利用可能である。

図１は、雪茶（ムシゴケ）抽出物の各エタノール画分における氷核活性および不凍活性ならびにタンパク質量を示す図である。棒グラフは各エタノール画分の氷核活性を示す。棒グラフ中のＴ_５０（℃）は小滴の５０％が凍結する温度を示す。写真は不凍活性を示す氷結晶の形態である。写真の上に画分のエタノール濃度を、下にその画分のタンパク質量を示す。図２は、エタノール０−５０％画分およびエタノール５０−８０％画分の不凍活性を示す氷結晶の写真である。図３は、エタノール０−５０％画分については氷核活性、エタノール５０−８０％画分については不凍活性に関して熱安定性を調べた結果を示す図である。上２列の写真は不凍活性を示す氷結晶の形態である。下の表は氷核活性を示す。Ｔ_１０（℃）は小滴の１０％が凍結する温度を示す。Ｔ_５０（℃）は小滴の５０％が凍結する温度を示す。Ｔ_９０（℃）は小滴の９０％が凍結する温度を示す。図４は、エタノール０−５０％画分中の氷核タンパク質のＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂによるゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図である。黒丸は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、白丸は２１５ｎｍにおける吸光度を示す。エタノール５０−６０％、６０−７０％、７０−８０％画分、および粗抽出物中の不凍タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。蛋白染色は銀染色にて行った。

Claims

地衣類の抽出物を有機溶媒にて分画することを特徴とする、地衣類からの氷核タンパク質および不凍タンパク質の製造方法。
地衣類が食用地衣類である請求項１記載の方法。
食用地衣類がムシゴケである請求項２記載の方法。
有機溶媒がエタノールである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
ムシゴケの抽出物をエタノールにて分画することにより得られる、氷核タンパク質および不凍タンパク質。