JP7005003B2 - ゲル化用組成物 - Google Patents
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Description
項1.
オリーブ葉のタンパク質非変性抽出物を含有するゲル化用組成物。
項2.
脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコン含むオリーブ葉抽出物を含有するゲル化用組成物。
項3.
脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコンを含有するゲル化用組成物。
項4.
アミノ基およびチオール基からなる群より選択される少なくとも1種の基を含有する物質のゲル化用である、項1~3のいずれかに記載のゲル化用組成物。
項5.
タンパク質及びキトサンからなる群より選択される少なくとも1種の物質のゲル化用である、項4に記載のゲル化用組成物。
項6.
ゲル化誘起用、ゲル化促進用、又はゲル物性改変用である、項1~5のいずれかに記載のゲル化用組成物。
項7.
項1~6のいずれかに記載のゲル化用組成物によりゲル化したゲル。
項8.
項1~6のいずれかに記載のゲル化用組成物によりゲル化した、タンパク質及びキトサンからなる群より選択される少なくとも1種の物質のゲル。
項9.
オリーブ葉をタンパク質非変性条件下で抽出する工程を含む、ゲル化用組成物製造方法。
当該ゲル化(官能基どうしの結合)は、脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコンとアミノ基(-NH2)及び/又はチオール基(-SH)を有するゲル化対象物質とを混合することで起こりえる。
オリーブ葉を液体窒素を用いて瞬間凍結させ、ミルサーでパウダー状になるまで粉砕した。得られた粉末パウダー(オリーブ葉凍結パウダー)50gに対して500mLの割合で水を加え、1時間25℃でマグネチックスターラーを用いて撹拌し、オリーブ葉に含まれる成分を抽出した。その後、遠心分離(8800g、10分、4℃)により不溶物を取り除き、上清(抽出液)を回収した。得られた抽出液を凍結乾燥機を用いて凍結乾燥してパウダー状にした。得られたパウダー(抽出パウダー)をオリーブ葉抽出物として、以下の検討に用いた。なお、以下、当該パウダー状のオリーブ葉水抽出物を「OLEx」と表記することがある。
各葉の抽出パウダー1gをそれぞれ20mLの純水に溶解させ、これを均質化した卵白80mLと混合した。当該混合液を、2N HClによりpH7.0に調整し、25℃で減圧脱気した。30分後、当該混合液を直径15mmのケーシングチューブに詰め、80℃で30分間インキュベートし、ゲル化させることで、円柱状ゲルを得た(OLEx添加卵白ゲル)。30分後、流水で冷却を行い(30分間)、25℃で1時間静置した。当該ゲルの抽出パウダー含有量は1w/v%である。
抽出パウダーによりゲル化した卵白ゲル(OLEx添加卵白ゲル)を輪切りにして、円柱状(直径15mm、高さ1cm)にした。当該円柱状ゲルについて、レオメーター(RE 2-3305、株式会社山電)により破断強度を測定した。具体的には、3mmの円柱プランジャーを用い、測定速度1mm/s、測定歪率80%の条件で測定した。測定によって得られた、応力(N/m2)-歪率(%)曲線の最初のピークの頂点を破断点とし、破断点における応力を破断応力(N/m2)とした。各抽出パウダー添加卵白ゲルについての、応力(N/m2)-歪率(%)曲線を図2aに、また破断応力(N/m2)を図2bに、それぞれ示す。図中「Ct」はコントロールゲルを表す。
OLExを0.1、又は0.5w/v%含んだゲルを、上記と同様にして調製した。そして、OLExを0.1、0.5、又は1.0w/v%含んだ円柱状の卵白ゲル(直径15mm、高さ1cm)の重量(Wi)を測定した。各円柱状ゲルの両端(円柱の底面及び上面)をそれぞれ2枚のろ紙で挟み、レオメーター(RE 2-3305、株式会社山電)で120gfの荷重により加圧した。加圧したゲルの重量(Wc)を測定し、以下の式で加圧により排出された水の割合(Expressible water )[%]を算出した。
OLExを1.0w/v%含んだ円柱状の卵白ゲル(直径15mm、高さ1cm)のクリープ特性を、レオメーター(RE 2-3305、株式会社山電)により測定した。40mmの円柱プランジャーを用い、測定荷重120gf、測定速度5mm/sで2分間測定した。得られたクリープ曲線から、クリープ粘弾性解析ソフト(Windows Ver.1.6 (CAS-3305)、株式会社山電)で弾性率と粘性率を算出した。結果を図4a(弾性率)及び図4b(粘性率)を示す。オリーブ葉水抽出物を用いることで、用いない場合より弾性率及び粘性率が向上したゲルを調製できることが分かった。
0、0.25、0.5、又は1.0mg/mLのOLExを含む、5mg/mL卵白タンパク質溶液(10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で調製)を、80℃で30分間加熱処理した。加熱処理した溶液200μLに、12.5% SDS及び8M尿素を含む20mMリン酸緩衝液(pH8.0)を800μL加えたもの(サンプル溶液)を以下の実験(1)~(3)に用いた。また、OLExが蛍光強度(実験(1))及び吸光度(実験(2))に与える影響を是正するために、0.25、0.5、又は1.0mg/mL OLEx溶液(10mMリン酸緩衝液(pH 7.0)で調製)をブランク溶液として以下の実験に用いた。
サンプル溶液又はブランク溶液150μLとOPA(o-フタルアルデヒド)溶液3mLとを混合し、2分後、蛍光強度(Em:360nm、Ex:460nm)を測定した。なお、OPA溶液としては、4%OPAメタノール溶液2mL、0.1M Na2B4O7溶液50mL、20%SDS溶液5mL、及び2-メルカプトエタノール0.2mLを混合し、100mLに水でメスアップしたものを用いた。コントロールゲルの蛍光強度を100%としたときの各OLEx濃度ゲルの蛍光強度の割合を算出し、当該割合がアミノ基量を反映しているものとした。結果を図5aに示す。オリーブ葉水抽出物の添加濃度依存的に、アミノ基量が減少していたことから、オリーブ葉水抽出物中の成分が、卵白タンパク質のアミノ基と結合していることが示された。
サンプル溶液又はブランク溶液3mLと0.01M DTNB溶液20μLとを混合し、5分後、吸光度(412 nm)を測定した。コントロールゲルの吸光度を100%としたときの各OLEx濃度ゲルの吸光度の割合を算出し、当該割合がチオール基量を反映しているものとした。結果を図5bに示す。オリーブ葉水抽出物の添加濃度依存的に、チオール基量が減少していたことから、オリーブ葉水抽出物中の成分が、卵白タンパク質のチオール基と結合していることが示された。
サンプル溶液50μLに、5% SDS及び0.004% Bromophenol blueを含む100mMトリス塩酸緩衝液(pH 6.7)12.5μL、並びにβ-メルカプトエタノール3μLを添加し、90℃で2分間加熱した。加熱後、10μLを分取し、SDS-PAGE(ゲル濃度:上層4.5%、下層12.5%)により解析した。泳動後のゲルをCBBでタンパク質染色した。結果を図5cに示す。オリーブ葉水抽出物の添加濃度依存的に、高分子量のバンドが増加していたことから、オリーブ葉水抽出物中の成分が、卵白タンパク質の重合を促進していることが示された。
OLExに含まれるフェノール性化合物並びに、卵白タンパク質とOLExを混合して卵白タンパク質と結合しなかったOLExのフェノール性化合物をHPLCで分析し、比較した(図6:上側がOLExに含まれるフェノール性化合物のHPLC解析結果、下側が卵白タンパク質と反応させたOLExの残渣に含まれるフェノール性化合物のHPLC解析結果)。その結果、タンパク質と反応させることによって保持時間(RT)49.16 minのピークが大幅に減少したことがわかった。このことからRT49.16 minのフェノール性化合物がタンパク質と最も結合能が高く、ゲル化に寄与していることがわかった。このフェノール性化合物をLC-MSで分析したところ、分子量は320であった。オリーブ葉フェノール性化合物を分析した文献から、このフェノール性化合物は脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコン(アルデヒド基が2つ)であることが示唆された。従って、脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコンが、卵白ゲルのゲル化及び物性改変に最も関わっていると考えられた。また、脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコンの有するアルデヒド基が、アミノ基(-NH2)及び/又はチオール基(-SH)と反応して結合し、架橋されることで、ゲル化が促進されることが推測された。さらに、オリーブ葉凍結パウダーを処理する抽出液として、抽出前にパウダーを95℃で5分間加熱した以外は同様にして調製した抽出物(抽出パウダー)を用いたゲルでは、その物性はコントロールゲルとほとんど変わらなかったことから考えると、オリーブ葉に含まれる酵素(特にβグルコシダーゼ、脱炭酸酵素、酸化酵素及び)が、抽出時に、オレウロペインを脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコンへと変化させているものと推測された。
OLEx添加卵白ゲル(OLEx0.1、0.5、若しくは1.0w/v%)又はコントロールゲルを5×5×2mmの大きさの直方体にメスで切り出した。切り出したゲルを2.5%グルタルアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)に浸し、4℃で24時間前固定した。前固定後、氷上で0.1M リン酸緩衝液(pH7.4)につけて洗浄し、1%四塩化オスミウムを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)で後固定した。0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄し、0、70、80、90、95、及び100%エタノールにそれぞれ10分間浸し脱水した。その後、ゲルを凍結乾燥し、完全に脱水した。脱水したサンプルを導電性処理後、簡易SEM(NeoScope JCM-6000、日本電子株式会社)で形態観察(高真空モード、加速電圧:15 kV、倍率:1,000倍)した。結果を図7に示す。オリーブ葉水抽出物は、卵白タンパク質の架橋を促進し、卵白ゲルのゲル骨格を密にすることが示唆された。また、ゲル骨格が密になることにより、上述のような物性改変が起こっている可能性が考えられた。
1gのOLExを20mLの10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、80℃に加熱した10%ゼラチン溶液(10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で調製)80mLと混合した。混合液を直径15mmのケーシングチューブに詰め(円柱状になる)4℃で静置し、ゲル化させた(OLEx添加ゼラチンゲル;1w/v%)。コントロール(OLEx無添加)のゼラチンゲルは、20mLの10mMリン酸緩衝液(pH7.0)を80℃に加熱した10%ゼラチン溶液と混合し、同様の手順で調製した。
OLEx添加ゼラチンゲルを輪切りにして、円柱状(直径15mm、高さ1cm)にした。当該円柱状ゲルについて、レオメーター(RE 2-3305、株式会社山電)で破断強度を測定した。具体的には、3mmの円柱プランジャーを用い、測定速度1mm/sとし、測定歪率はコントロールゼラチンゲルでは80%、OLEx添加ゼラチンゲルでは95%として、測定した。測定によって得られた応力(N/m2)-歪率(%)曲線の最初のピークの頂点を破断点とし、破断点における応力を破断応力(N/m2)とした。それぞれの結果を、図8a及び図8bに示す。また、破断歪率は、OLEx添加ゼラチンゲルが90.7%、コントロールゲルが46.5%であった(図8aの破断時の歪率)。
OLEx添加ゼラチンゲル(OLEx 1w/v%)及びコントロールゲルを、沸騰水を用いた湯煎により溶解させることを試みた。湯煎開始30秒後、コントロールゲルは完全に溶解したが、OLEx添加ゼラチンゲルは全く溶解しなかった(図9)。通常のゼラチンゲルは加熱により溶解するが、再び冷却するとゲルを再形成する、すなわち可逆性のゲルである。一方、OLEx添加ゼラチンゲルは、加熱により溶解しなかったことから、不可逆性のゲルであることが考えられる。
上記の通り、OLExによるゲル物性の改変は、OLEx中のフェノール性化合物(特に脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコン)が、アミノ基及びチオール基と反応して結合することで、起こっていると考えられた。そこで、糖であってアミノ基を有するキトサンについても、OLExを用いてゲル化することができるかを検討した。
一般に、フェノール性化合物によるゲル物性の改変では、ゲル化対象物質に対して、フェノール性化合物及び精製された酵素を添加する方法が一般的である。タンパク質変性条件で抽出したオリーブ葉水抽出物であってもフェノール性化合物は含まれていることから、タンパク質変性条件抽出物にさらに酸化酵素を加え、前記一般的なフェノール性化合物利用ゲル化方法を用いることで、ゲル物性を改変できるかを検討した。また、当該一般的な方法とOLExを用いた方法とで、得られるゲルのゲル物性が異なるかについても検討した。
オリーブ葉を液体窒素で瞬間凍結させ、ミルサーで粉砕した。50gの粉砕物を95℃で5分間加熱し、オリーブ葉に存在する酵素を失活させた。酵素を失活させたオリーブ葉パウダーをビーカーに入れ、500mLの純水と混合した。25℃で1時間マグネチックスターラーを用いて攪拌した。1時間後、遠心分離(8800g,10min,4℃)し、上清を回収した。回収した上清をHPLC分析で、オリーブ葉フェノール性化合物(特にオレウロペイン)が分解されていないことを確認した後に、凍結乾燥によってパウダー化した。このパウダーをオリーブ葉フェノール性化合物抽出物(以下「OP」と表記することがある)とした。
0.25gのOPを5mLの純水に溶解し、20mLの均質化した卵白と混合した。当該混合液を、2N HClでpH7.0に調整した(OP-卵白混合液)。OP-卵白混合液に5mgのポリフェノール酸化酵素であるラッカーゼ(ラッカーゼダイワ Y120、大和化成株式会社)を添加し、室温で3時間インキュベートした。3時間後、OP-卵白混合液が褐色に変化した(すなわち酸化反応が起こったこと)ことを確認した後に、直径15mmのケーシングチューブに詰め(円柱状になる)、80℃で30分間インキュベートしゲル化させた(OP+ラッカーゼ添加卵白ゲル)。その後、流水で30分間冷却した後、25℃で1時間静置した。得られたゲルを輪切りにして、円柱状(直径15mm、高さ1cm)にしたときの、OP+ラッカーゼ添加卵白ゲルを示す(図11)。
OP+ラッカーゼ添加卵白ゲル、並びに、上記「抽出パウダーを含む卵白ゲルの調製」で調製したOLEx1w/v%含有OLEx添加卵白ゲル及びコントロールゲルの、3種のゲルを検討用いた。3種のゲルの円柱状ゲル(直径15mm、高さ1cm)について、レオメーター(RE 2-3305、株式会社山電)で破断強度を測定した。3mmの円柱プランジャーを用い、測定速度1mm/s、測定歪率80%の条件で測定した。測定によって得られた応力(N/m2)-歪率(%)曲線の最初のピークの頂点を破断点とし、破断点における応力を破断応力(N/m2)とした。各卵白ゲルについての、応力(N/m2)-歪率(%)曲線を図12aに、また破断応力(N/m2)を図12bに、それぞれ示す。
Claims (7)
- オリーブ葉のタンパク質非変性抽出物を含有する、
アミノ基およびチオール基からなる群より選択される少なくとも1種の基を含有する物質のゲル化用である、
ゲル化用組成物。 - 脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコンを含むオリーブ葉抽出物を含有する請求項1に記載のゲル化用組成物。
- 脱カルボキシメチル型のオレウロペインアグリコンを含有する請求項1に記載のゲル化用組成物。
- タンパク質及びキトサンからなる群より選択される少なくとも1種の物質のゲル化用である、請求項1~3のいずれかに記載のゲル化用組成物。
- ゲル化誘起用、ゲル化促進用、又はゲル物性改変用である、請求項1~4のいずれかに記載のゲル化用組成物。
- 請求項1~5のいずれかに記載のゲル化用組成物によりゲル化したゲル。
- 請求項1~5のいずれかに記載のゲル化用組成物によりゲル化した、タンパク質及びキトサンからなる群より選択される少なくとも1種の物質のゲル。
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JP2011125301A (ja) | 2009-12-21 | 2011-06-30 | Kagawa Prefecture | ポリフェノールを高濃度に含有する、渋み・苦味をマスキングしたオリーブ葉エキスの製造法 |
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Int. J. Appl. Sci. Technol.,2014年,vol.4, no.5,pp.153-157 |
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