CN103415533A - 源自植物种子的冰结晶化抑制物质 - Google Patents

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CN103415533A CN2012800117014A CN201280011701A CN103415533A CN 103415533 A CN103415533 A CN 103415533A CN 2012800117014 A CN2012800117014 A CN 2012800117014A CN 201280011701 A CN201280011701 A CN 201280011701A CN 103415533 A CN103415533 A CN 103415533A
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Abstract

本发明所要解决的问题是提供具有优异的功能和性质的、新的冰结晶化抑制物质，其在工业上有用，可通过适合食品制造的安全的方法容易、高效、稳定地制造。另外，本发明的目的还在于提供与该冰结晶化抑制物质特异性结合的抗体，以及包含该冰结晶化抑制物质的组合物、食品、生物试样保护剂及化妆品，以及成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标的肽。本发明所涉及的冰结晶化抑制物质包含源自豆科豇豆属植物、或豆科豇豆属植物的近缘品种、或者它们的改良品种的种子蛋白质。

Description

源自植物种子的冰结晶化抑制物质
技术领域
本发明涉及源自植物种子的冰结晶化抑制物质、与该冰结晶化抑制物质特异性结合的抗体，以及包含冰结晶化抑制物质的组合物、食品、生物试样保护剂和化妆品，以及成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标的肽。
背景技术
已知在低温下栖息的生物会生产出抗冻蛋白(antifreeze protein，以下简称为“AFP”)等冰结晶化抑制物质，以作为保护自身防止细胞冻结的手段。AFP为一种具有热滞后、抑制水溶液冻结、控制冰结晶形状等作用的蛋白质，从例如鱼类、昆虫、植物、菌类、微生物等中有发现。
在至今所发现的来源于鱼类、昆虫类及微生物的AFP中，有的来自杜父鱼科(cottidae)的鱼类，有的来自黄粉虫(Tenebrio molitorゴミムシダマシ)的幼虫等昆虫，有的来自黄杆菌（Flavobacterium）属等微生物等，这些物质具有较高的冰结晶化抑制活性(专利文献1～3)。另外，作为来源于植物的AFP，例如，已知有来自冬黑麦或胡萝卜的AFP(非专利文献1～2)。
另外，作为来源于菌类的AFP，公知有例如来自雪腐病核瑚菌（Typhulaishikariensis）以及南极产金针菇(Flammulina velutipes KUAF-1)等担子菌类的AFP(专利文献4～5)。
近年来，尝试着将上述性质用于工业中，将AFP用于维持冰淇淋等冷冻点心制品及冷冻食品的品质(专利文献6～7)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-83546号公报
专利文献2：日本特表2002-507889号公报
专利文献3：日本特开2004-161761号公报
专利文献4：日本特开2004-24237号公报
专利文献5：日本特开2004-275008号公报
专利文献6：国际公开第92/22581号小册子
专利文献7：国际公开第94/03617号小册子
非专利文献
非专利文献1：Plant Physiology(植物生理学)，第119卷，第1361～1369页(1999年)
非专利文献2：Biochem.J.(生物化学杂志)，第340卷，第385～391页(1999年)
发明内容
发明要解决的问题
然而，难以完全除去来源于鱼类的AFP的异味。另外，昆虫及微生物难以作为食品原料，所以来自昆虫及微生物的AFP不适宜用于食品。
另一方面，由于植物一直以来被用作食品原料，因此期待将来源于植物的AFP用于食品。但是，由于其与冰的结合能力比其它AFP弱且热稳定性不充分等理由，基本未能实现工业化。
因此，本发明要解决的问题是提供具有优异的功能和性质的、新的冰结晶化抑制物质，其在工业上有用，可通过适合食品制造的安全的方法容易、高效、稳定地制造。另外，本发明的目的还在于提供与该冰结晶化抑制物质特异性结合的抗体，以及包含该冰结晶化抑制物质的组合物、食品、生物试样保护剂及化妆品，以及成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标的肽。
解决问题的方法
本发明人等为了解决所述问题进行了潜心研究。其结果发现了从豆科植物的豇豆属植物的种子中，能够获得具有优异特性的冰结晶化抑制物质，从而完成了本发明。
本发明所涉及的冰结晶化抑制物质包含源自豆科豇豆属植物、或豆科豇豆属植物的近缘品种、或者它们的改良品种的种子蛋白质。
上述豆科豇豆属植物优选是小豆或绿豆。基于本发明人等的实验观察发现，从这些植物的种子所获得的种子蛋白质中，存在具有非常优异的冰结晶化抑制活性的物质。
此外，作为种子蛋白质，优选：籽粒灌浆期蛋白质、LEA蛋白（胚胎发育后期富集蛋白）、以及氨基酸序列为序列号1～2（SEQ ID NO:1～2）的各序列，或者为上述各序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸而成的、且包含成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标的序列的序列。本发明人等证实了这些种子蛋白质的优异的冰结晶化抑制活性。
本发明所涉及的冰结晶化抑制物质中所包含的种子蛋白质还可以与其他变性蛋白质形成复合体。本发明人等发现的显示出冰结晶化抑制作用的种子蛋白质具有与其他变性蛋白质形成复合体的结构特征。
本发明涉及的抗体与上述冰结晶化抑制物质特异性地发生反应。
本发明涉及的组合物、食品、低温保护剂以及化妆品包含本发明涉及的上述冰结晶化抑制物质。
本发明涉及的肽包括序列号2（SEQ ID NO:2）的序列，或者为该序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸而成的、且包含成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标的序列的序列。
发明效果
本发明涉及的冰结晶化抑制物质可以由豆科豇豆属植物、或豆科豇豆属植物的近缘品种、或者它们的改良品种的种子中容易且高效地制造，能够稳定地供给。此外，不存在臭气等问题，并且是来源于植物的，因此可以放心地使用于食品。因此，本发明的冰结晶化抑制物质可以有助于维持例如冷冻食品的品质等。此外，也可有效地用作器官、细胞、血液本身、血小板等的冷冻保藏的保护剂、化妆品等中。
附图说明
图1是利用本发明所涉及的冰结晶化抑制物质而使形态得到了控制的冰结晶的放大照片。
图2是利用本发明所涉及的冰结晶化抑制物质而使形态得到了控制的冰结晶的放大照片。
具体实施方式
以下对本发明做进一步详细说明。
在本发明中，冰结晶化抑制物质是指结合在冰结晶的结晶面上，具有抑制冰结晶成长的功能的物质。此外，该结合通过阻止自由水进一步结合至冰结晶上，由此抑制冰的再结晶化。换言之，本发明所涉及的冰结晶化抑制物质意指可通过冰再结晶化抑制活性测定、热滞后测定、冰结晶结构的观察等公知的任意方法来定义的、具有冰结晶化抑制作用的物质。
例如，冰结晶化抑制活性可以如下测定：将含有30w/v%蔗糖的冰结晶化抑制物质溶液冷却至-40℃之后，升温至-6℃，测定30分钟后可见的冰结晶的平均面积。另外，对作为对照的蔗糖的30w/v%水溶液进行相同的处理，测定冰结晶的平均面积。冰结晶的平均面积可以按照如下进行测定：例如可使用Imsoft公司生产的Image Factory、Adobe公司生产的ADOBEPHOTOSHOP ELEMENT8、Scion公司生产的Scion Image等市售图像分析处理软件来分析冰结晶的显微镜图像，用图像中的冰结晶总面积除以图像中的冰结晶个数，由此进行测定。之后，可以将测定的冰结晶的平均面积除以对照的平均面积所获得的数值作为指标，定量地评价冰结晶化抑制活性。换言之，冰结晶化抑制物质的冰结晶化抑制活性越强，所生成的冰结晶的平均面积越小，因此，与对照相比，添加冰结晶化抑制物质时即使仅稍稍地抑制冰结晶形成，则上述数值也会小于1，可以判断其具有冰结晶化抑制活性。
热滞后是指由于冰结晶化抑制物质的存在而产生的冰的融解温度与水的冻结温度之差，这个数值越高，则意味着冰结晶化抑制物质的活性越高。例如，可以如下对热滞后进行测定。
使用可在低温下控制温度的相位差显微镜，将玻璃培养皿保持在-20℃，在上面放置1mL样品，以100℃/分钟的速度将温度降低至-40℃，使其形成冰结晶。以100℃/分钟的速度将生成的冰结晶加温至-5℃，之后以5℃/分钟的速度加温，使冰结晶溶解而成为单结晶，再用1℃/分钟的速度降低温度，测定成为单结晶的冰结晶开始成长的时间，可由以下公式计算出热滞后。
热滞后（℃）＝［60-1］（℃/秒）×测定时间（秒）
如果所得数值在0.02℃以上，则可以判断具有冰结晶化抑制活性。热滞后进一步优选为0.025℃以上，更优选为0.03℃以上。
此外，还可以通过观察添加了被检测物质的水或水溶液中生成的冰结晶结构，判断是否为冰结晶化抑制物质。换言之，普通的水冷却获得的冰结晶是扁平圆板状，而添加了冰结晶化抑制物质后生成的冰结晶的形态，变成与结合了该物质的冰结晶面对应的各种形态，例如六方晶状（扁平六角柱状）或双锥（Bipyramid）形等，因此，当添加后的冰结晶表现出扁平圆板状以外的形态时，可以判断为冰结晶化抑制物质。
本发明所涉及的冰结晶化抑制物质，包含源自豆科豇豆属植物（Vigna）、或豆科豇豆属植物的近缘品种、或者它们的改良品种的种子蛋白质。
作为豆科豇豆属植物的种子，以其日文名称可列举：Hokuto-dainagon（ほくと大納言）、Toyomi-dainagon（とよみ大納言）、Akane-dainagon（アカネダイナゴン）、Kamui-dainagon（カムイダイナゴン）、Beni-dainagon（ベニダイナゴン）、Sahoro-shozu（サホロショウズ）等大粒小豆（大纳言小豆（大納言小豆）），襟裳小豆（Erimo-shozu（エリモショウズ））、大雪山朱鞠小豆（シュマリショウズ）、北国少女（きたのおとめ）、Sahoro-shozu（サホロショウズ）等普通小豆，きたほたる、Hokkaishiroshouzu（ホッカイシロショウズ）等白小豆，绿豆（ヤエナリ），豇豆等。其中，从食用经验丰富，易于取得，每单位重量获得的提取物的冰结晶化抑制活性、热滞后活性优异的观点来看，优选小豆，更优选大粒小豆。
在本发明中，作为“豆科豇豆属植物的近缘品种”，是指例如在属于同一豆科的植物且不属于豇豆属的植物中，在学术分类上与豇豆属相近的品种。另外，具体的豆科豇豆属植物的近缘品种是指在学术分类上与该植物相近的品种。此外，“豆科豇豆属植物的改良品种”是指经过人为的选择、杂交、突变、基因重组等改良的豆科豇豆属植物。
作为上述种子蛋白质，只要是从上述植物中提取的种子蛋白质即可，没有特殊的限制，也可以是含有所述蛋白质的级分。具体而言，可列举通常定义为“在意指植物种子成熟、肥大的‘籽粒灌浆’过程中合成积累的蛋白质”的各种籽粒灌浆期蛋白质(grain filling stage protein)，例如:白蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白等各种种子储藏蛋白；热休克蛋白等应激蛋白（stressprotein）；LEA蛋白（胚胎发育后期富集蛋白，Late embryogenesis abundantprotein）等。上述籽粒灌浆期蛋白质中特别优选LEA蛋白。
本发明所涉及的冰结晶化抑制物质可以仅含有1种上述种子蛋白质，也可以含有2种以上的上述种子蛋白质。此外，在本发明所涉及的冰结晶化抑制物质中，上述种子蛋白质也可以与其他蛋白质形成复合体。特别是已知LEA蛋白可与其他变性蛋白相互作用。与本发明所涉及的种子蛋白质形成复合体的变性蛋白可以来源于含有种子蛋白质的种子，也可以来源于与所述种子不同的种子。此外，该变性蛋白质可以仅是1种，也可以是2种以上。
上述LEA蛋白是一类在细胞中发生水分胁迫时被诱导特异性表达的高亲水性蛋白质，在植物种子成熟、肥大的灌浆过程中合成积累。在种子以外的叶、根、花粉等中，有时也可见LEA蛋白的积累。在本发明中，只要与豆科豇豆属植物的种子蛋白质有同源性，且是冰结晶化抑制物质，则存在于种子之外的蛋白质也包含在发明范围内。
本发明所涉及的冰结晶化抑制物质的分子量没有特殊的限制，例如优选通过凝聚过滤色谱测定的平均分子量是1kDa以上且200kDa以下的。所述分子量在1kDa以上就可以充分发挥冰结晶化抑制活性。另一方面，所述分子量过大，则存在着该溶液粘度变得过高的担忧，因此，所述分子量优选在200kDa以下。所述分子量进一步优选是180kDa以下，更优选是160kDa以下。需要说明的是，冰结晶化抑制物质可以是复合体，上述平均分子量中也包括其单体的平均分子量。此外，只要表现出冰结晶化抑制活性等，则具有上述分子量的冰结晶化抑制物质的各种分解物也包含在本发明的范围内。
作为本发明所涉及的冰结晶化抑制物质，其氨基酸序列优选为：具有氨基酸序列为序列号1～3（SEQ ID NO:1～3）的各序列，或者为上述各序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸而成的、且包含成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标的序列的序列。
在上述冰结晶化抑制物质中，缺失、取代或添加的氨基酸的个数优选是1个以上、5个以下，进一步优选是1个以上、3个以下，更优选是1或2个。
在上述冰结晶化抑制物质中，“成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标”是指：对于含有上述的具有缺失等的序列的蛋白质，可认为其具有通过冰再结晶化抑制活性测定、热滞后测定、冰结晶结构的观察等公知的任意方法来定义的冰结晶化抑制作用。
作为获得本发明的冰结晶化抑制物质的方法，可列举例如从上述豆科豇豆属植物等的种子中提取处理的方法。以下将详细说明制造方法。
事先将用于提取处理的豆科豇豆属植物种子低温驯化，由此可进一步诱导冰结晶化抑制物质。例如，可以将种子在20℃以下保管3天以上。但是，即使不进行低温驯化处理，也可以从豆科豇豆属植物种子中充分获得冰结晶化抑制物质。
作为用于提取处理的豆科豇豆属植物种子的形态，可使用其粉碎物、破碎物、磨碎物等。需要说明的是，这些粉碎物等可以是将生的状态的种子粉碎等而获得的，也可以是将干燥的种子粉碎等而获得的。
通过将种子粉碎等，可提高提取效率。作为植物种子的粉碎方法，可使用各种普通的方法。例如，可以使用加压破坏、机械磨碎、超声波处理、均化器等物理破碎方法。典型的粉碎方法的例子可列举Potter-Elvehjem（ポッター-エルベ-ジェム）均化器等的均化器、瓦氏高速组织捣碎器（Waringblender）等搅拌机、Dinomill等粉碎器、法式压碎机、以及研钵和研棒、擂溃机、液氮冷冻及破碎、超声波处理等的方法。
此外，在粗粉碎后，还可以用研钵和研棒、球磨机或锤碎机等进一步磨碎或微破碎至更加微细。
在提取时，将种子的粉碎物等悬浮在提取介质中，对内容物进行提取。需要说明的是，在使用干燥种子的情况下，为了容易进行提取，优选预先浸渍于提取介质中。
提取介质优选是使目标物质变性少的、毒性低的介质。优选的提取介质可列举：水；食盐水；醋酸钠缓冲液、磷酸缓冲液、TRIS-盐酸缓冲液等缓冲液；甲醇、乙醇、丙酮等亲水性有机溶剂；乙酸乙酯等其他有机溶剂；以及它们的混合溶液等。考虑到将本发明的冰结晶化抑制物质适用于食品的情况，优选的提取介质为：水、食盐水、醋酸钠水溶液或将它们适宜混合的物质。可以适当选择提取介质的组分、pH等。一般而言，提取介质的pH优选是在5以上、9以下左右的中性附近。
可以适当选择相对于种子的提取介质的量，通常是将种子整体浸泡在提取介质中的程度。例如，相对于所使用的种子，提取介质的量是在1mL/g以上、5mL/g以下左右即可。
在提取时，可以将生(raw)的状态的、或被干燥的种子与提取介质混合，再使用搅拌机等在提取介质中对种子进行粉碎等。此外，可以只是浸泡、再进行减压提取，也可以在提取时进行搅拌。
提取温度适当调整即可。例如，提取温度可以是在0℃以上、100℃以下，更优选在2℃以上、10℃以下。特别是通过使其在10℃以下，降低包含在种子中的蛋白酶的活性，可以更确切地抑制蛋白质的分解。需要说明的是，关于温度调节，可以在添加提取介质后，一边将包含种子的混合物调节至给定的温度一边进行提取；也可以添加预先调节至给定温度的提取介质，并在维持温度的状态下进行提取。例如，可以在将种子浸泡在水等中的状态下，在2℃以上、10℃以下保持足够的时间后，再置换为提取介质，一边对种子进行粉碎等一边进行提取。
提取时间也可适当调节，通常可以是5分钟以上、100小时以下。
在提取后，通过对得到的提取液过滤或离心分离等进行分离，将此用作冰结晶化抑制物质。也可以进一步对提取残渣重复进行同样的提取处理，将得到的提取液合并，并将其用作冰结晶化抑制物质。
可以向得到的提取液中添加碱，进行碱处理步骤。通过碱处理步骤，有时可以提高蛋白质的冰结晶化抑制活性。
碱处理的条件没有特殊的限制，可以适当调整。例如，作为碱，可以使用氢氧化钠或氢氧化钾等碱金属氢氧化物。pH优选是在10.0以上，更优选在10.5以上。pH的上限没有特殊限制，优选是在13.0以下，更优选在12.0以下。
如上所述，在提高pH后，使用盐酸等将pH中和至6.0以上、8.0以下左右即可。
可以根据需要对如上述得到的冰结晶化抑制物质进一步纯化。例如，可以在适当地组合倾析、过滤及离心分离等除去固体成分的基础上，适当地组合使用以下方法，例如，盐析或通过有机溶剂沉淀；通过亲和色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤、使用低速冷却装置与冰进行结合等进行的纯化；透析或超滤等进行浓缩。
本发明的冰结晶化抑制物质的形态，依照其用途可以是多种多样的，可以是固体、溶液、浓缩液、悬浮液等。此外，也可以根据需要，加工为粉末状或颗粒状、片剂等任意的形态。加工方法没有特别限定，可列举例如：通过喷雾干燥或冷冻干燥等常规方法对上述提取物进行粉末化的方法，将提取物吸附或担载于赋形剂上从而固型化为粉末或颗粒状的方法等。这些操作为本领域技术人员所公知，可以根据用途适当选择使用。
在由于水发生冰结晶化而产生障碍的各领域中，本发明涉及的冰结晶化抑制物质可以基于抑制该障碍的目的加以利用。例如，可以在食品领域、机械领域、土木领域、化妆品领域、使用生物材料的医疗领域等中使用。
根据其用途，本发明的冰结晶化抑制物质的形态是多种多样的，原样的，也可以是原本形态、溶液、浓缩液、悬浮液、冷冻干燥物、粉末、颗粒及片剂等。另外，也可以是与赋形剂等混合制成的组合物。
本发明涉及的抗体是与上述冰结晶化抑制剂进行特异性反应的物质，可以用于测试担子菌或其培养液中有无该冰结晶化抑制物质或用于鉴定源于担子菌培养液等的具有冰结晶化抑制活性的多糖类。
本发明涉及的抗体根据常用方法来制备即可。例如，使用上述冰结晶化抑制物质对小鼠、大鼠等进行免疫，使其抗体产生细胞或脾细胞与骨髓瘤细胞相融合，得到杂交瘤细胞。克隆该杂交瘤细胞，筛选产生与上述冰结晶化抑制物质进行特异性反应的抗体的克隆体。培养该克隆体，并纯化分泌的单克隆抗体即可。
在食品领域中，通过抑制食品中所包含的水的冰结晶化，可以防止该食品口味的劣化等。例如，通过抑制由于食品中的水冰结晶化而物理性压迫蛋白质及油脂成分等而导致其结构变化所带来的口味及品质等的劣化，由此，可以改善冷冻食品等的品质。
在机械领域和土木领域中，可以用作机械可动部、道路、地基等的防冻剂。
在化妆品领域中，可以用作防止化妆品品质劣化等的添加剂。例如，含有油脂成分的化妆品冻结时，该化妆品中所含有的水产生冰结晶化，会物理性压迫该油脂成分，从而破坏其结构，由此品质及使用感变差。使用本发明涉及的冰结晶化抑制物质，通过防止水的冰结晶化来保持油脂成分的结构，因此能够抑制品质的劣化等。
在医疗领域中，可以将其用作冷冻保存生物样品时的保护剂。例如，将细胞、血液、器官、生理活性蛋白质、生理活性肽、生物体来源的低分子化合物等生物样品放入现有公知的保存液中冷冻保存时，保存液中的水分冻结而产生冰结晶，有时该冰结晶会对生物样品产生损伤。然而，如果添加本发明涉及的冰结晶化抑制物质，则可以抑制冰结晶的产生、成长，因此可以保护生物样品免受冰结晶引起的损伤。
本申请要求基于2011年3月4日申请的日本国专利申请第2011-048318号的优先权的权益。出于参考的目的，本申请援引2011年3月4日申请的日本国专利申请第2011-048318号的说明书的全部内容。
实施例
以下给出实施例对本发明进行更为具体的说明，但本发明不受这些实施例的限定。
需要说明的是，使用市售的测定试剂盒（Thermo SCIENTIFIC公司生产，BCA Protein Assay），通过二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定以下实施例中的蛋白质浓度。测定条件根据常规方法，使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白。
实施例1
将市售的大纳言小豆（100ｇ）加入到1,000mL容量的烧杯中，加入蒸馏水至盖住小豆的程度，在4℃浸泡48小时。去除蒸馏水后，加入5mMTris-HCl缓冲液（pH8.0，500mL），使用搅拌器在4℃进行破碎处理后，用纱布过滤破碎液，在4℃、8,000×ｇ条件下离心分离30分钟。将离心分离后的上清液（460mL）作为粗提取液回收。用BCA法测定获得的粗提取液的蛋白质浓度，是42mg/mL。
实施例2
向实施例1得到的粗提取液（460mL）中，逐次少量的滴入冷却至-30℃的丙酮，添加丙酮至25v/v%，分离不溶性成分（不溶性级分1）和丙酮溶液。对于不溶性级分1，未确认到冰结晶化抑制活性。之后，在上述丙酮溶液中加入丙酮至75v/v%之后，分离不溶性成分（不溶性级分2）和75v/v%丙酮溶液。将获得的不溶性级分2溶解在5mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0，100mL）中。用透析膜（截留分子量（molecular weight cutoff）:14,000）透析所获得的溶液后，获得用相同缓冲液置换的溶液（230mL）。将如上所述获得的溶液作为丙酮级分回收，用BCA法测定其蛋白质浓度，为8.3mg/mL。
实施例3
将实施例2得到的溶液（230mL）上样到用相同缓冲液平衡了的DEAE柱（东曹公司生产，产品名“DEAE TOYOPEARL650M”），在0～0.5Ｍ的NaCl梯度、流速2.0mL/分钟的条件下洗提，将非吸附级分作为活性级分回收。用透析膜（截留分子量:14,000）透析所获得的级分，将溶剂置换为20mM醋酸钠缓冲液（pH5.0），获得溶液（485mL）。用BCA法测定获得的DEAE柱色谱活性级分的蛋白质浓度，是1.8mg/mL。
实施例4
将实施例3得到的溶液（485mL）上样到用相同缓冲液平衡了的阳离子交换柱（东曹公司生产，产品名“CM TOYOPEARL650M”），在0～0.5Ｍ的NaCl梯度，流速2.0mL/分钟的条件下洗提，将吸附级分作为活性级分回收。用透析膜（截留分子量:14,000）对所获得的级分进行透析、脱盐，将溶剂置换为20mM磷酸缓冲液（pH6.0），得到溶液（132mL）。用BCA法测定获得的活性级分（CM1级分）的蛋白质浓度，是0.73mg/mL。
实施例5
将实施例4得到的溶液（132mL）上样到用相同缓冲液平衡了的阳离子交换柱（东曹公司生产，产品名“CM TOYOPEARL650M”），在0～0.5Ｍ的NaCl梯度，流速2.0mL/分钟的条件下洗提，分别回收柱非吸附级分（CM2非吸附级分）和柱吸附级分（CM2吸附级分）。用透析膜（截留分子量:14,000）对柱吸附级分进行透析、脱盐，将溶剂置换为20mM磷酸缓冲液（pH6.0）。用BCA法测定获得的CM2非吸附级分（126mL）和CM2吸附级分（64mL）的蛋白质浓度，分别是0.22mg/mL、0.29mg/mL。
实施例6
将实施例5得到的CM2非吸附级分和CM2吸附级分分别溶解于20mM磷酸缓冲液中。获得的各水溶液（1000μL）的蛋白质浓度分别是5000μg/mL和5000μg/mL。以各水溶液为样品，上样到凝聚过滤柱（GE Healthcare公司生产，产品名“Sephacrl S300HR”），在4℃的温度条件下，以流速0.5mL/分钟的条件流过5mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0，包含0.15ＭNaCl），使非吸附级分洗脱，在215nm吸收波长下检测。此外，使分子量不同的标准蛋白在相同条件下洗脱。
在上述柱色谱中，在分子量约16万和13万处，分别确认到了单峰。分别回收各级分（CM2非吸附S300级分和CM2吸附S300级分），用水进行透析后，使用除粒子滤膜（KURABO公司生产，产品名“CENTRICUT”，截留分子量:10,000）浓缩，分别获得3.9mg和2.9mg纯化样品。使用其进行Native-PAGE时，分别确认到了单条带。此外，使用相同样品进行SDS-PAGE，其结果，确认到分别以46kDa和52kDa为主的多条带。由此可见，纯化物质的至少一部分形成了复合体。
试验例1测定冰结晶化抑制活性
测定实施例1～6的各溶液的冰结晶化抑制活性。具体而言，稀释实施例1～6中获得的各溶液，调整为表1记载的蛋白质浓度后，将这些溶液与60w/v%蔗糖水溶液等量混合，制备样品的30w/v%蔗糖溶液。作为冰结晶化抑制活性的评价，在具有冷却调节功能的载物台(stage)的显微镜下，将样品的30w/v%蔗糖溶液冷却至-40℃后，升温至-6℃，使冰结晶溶解，测定在保持-6℃的状态下观察30分钟时所观察到的冰结晶的平均面积。需要说明的是，使用市售的图像分析处理软件（Imsoft公司生产，Image Factory）对冰结晶的显微镜图像进行分析，通过用图像中的冰结晶的总面积除以图像中的冰结晶个数，测定冰结晶的平均面积。此外，对作为对照的30w/v%蔗糖水溶液进行同样的测定，计算出冰结晶的平均面积。
冰结晶化抑制活性越强，则冰结晶的平均面积越小，以该平均面积除以作为对照的30w/v%蔗糖水溶液的冰结晶平均面积而得到的数值（RI值）作为指标，对冰结晶化抑制活性进行了定量评价。此外，用BCA法测定样品的蛋白质浓度，将RI值的倒数除以蛋白质浓度，获得单位蛋白质的比活性，计算出相对于实施例1的粗提取液的相对值。结果显示在表1中。
[表1]
Figure BDA0000377029430000121
由表1可知，获得了具有比市售的大纳言小豆更优异的冰结晶化抑制活性的提取物，以及通过实施例2～6的分级、纯化，单位蛋白质的冰结晶化抑制活性（比活性）显著增加。
试验例2热滞后活性的测定
将实施例6获得的CM2非吸附S300级分和CM2吸附S300级分分别溶解在水中，使蛋白质浓度为0.25mg/mL，如下测定热滞后活性。换言之，使用能够在低温下控制温度的相位差显微镜（Olympus公司生产，产品名“L600A”），保持玻璃培养皿在-20℃，在上面放置1mL样品，以100℃/分钟的速度，将温度降低至-40℃，使其形成冰结晶。用100℃/分钟的速度将生成的冰结晶加热至-5℃，之后以5℃/分钟的速度加热使冰结晶溶解，成为单结晶。接下来，用1℃/分钟的速度降低温度，测定成为单结晶的冰结晶开始成长的时间，根据以下公式计算出热滞后。
热滞后（℃）＝［60-1］（℃/秒）x测定时间（秒）
该数值越大表示冰结晶化抑制物质的活性越高。结果显示在表2中。此外，图1表示通过CM2非吸附S300级分使得形态得到控制的冰结晶的放大照片，图2表示通过CM2吸附S300级分使得形态得到控制的冰结晶的放大照片。
[表2]
样品 热滞后(℃)
CM2非吸附S300级分 0.036
CM2吸附S300级分 0.055
根据表2的结果可知，在实施例6得到的纯化蛋白质作为冰结晶化抑制物质具有优异的热滞后。
此外，根据图1～2，添加实施例6中获得的纯化蛋白质所得到的冰结晶的形态均为平缓的六角形，不同于从普通的水或水溶液所得到的扁平圆板状的冰结晶。这样的形态变化显示出得到的纯化蛋白质结合在冰结晶的特定的结晶面上。因此，上述实验结果，成为这些纯化蛋白质是冰结晶化抑制物质的证据。需要说明的是，图1的照片是从侧面方向观察六角形的结晶的情况。
试验例3纯化蛋白质的氨基酸序列的测定
将实施例6中获得的CM2吸附S300级分（4.0μg）溶解于用蒸馏水（5μL），根据常规方法进行蛋白酶处理。然后，按1:1混合样品缓冲液（ATTO公司生产，产品名“EzApply”）（5μL）和溶液后，在99℃热处理3分钟。将热处理后的样品应用于10～20%聚丙烯酰胺凝胶（ATTO公司生产，产品名“e-Pagel”），以20mA进行85分钟SDS-PAGE。用半干（semi-dry）法将SDS-PAGE后的凝胶转移到PVDF膜（Millipore公司生产，产品名“ImmobilonPSQ”）上，再进行CBB染色。切割出经过蛋白酶消化的、以52kDa为主的多条带，使用蛋白质测序仪（岛津制作所生产，产品名“PPSQ-33A”），通过Edman法测定氨基酸序列。获得的序列如序列号1～3（SEQ ID NO:1-3）所示。
这些序列与作为已知的种子蛋白质的LEA蛋白（胚胎发育后期富集蛋白）的氨基酸序列的一部分表现出高度的同源性。根据上述结果可知：从小豆获得的冰结晶化抑制物质是种子蛋白质。
实施例7
通过与实施例1相同的方法，制备属于豆科豇豆属的市售的绿豆、白小豆和日本十胜（Tokachi)产小豆的粗提取液。将浓度调整为蛋白质浓度2.0mg/mL，通过与试验例1相同的方法，测定冰结晶化抑制活性。结果显示在表3中。
[表3]
原材料 冰结晶化抑制活性(RI值)
绿豆 0.24
白小豆 0.18
日本十胜产小豆 0.33
表3的结果显示出从上述豆科豇豆属植物的种子获得的种子蛋白质具有优异的冰结晶化抑制活性。
实施例8
为了去除沉淀，将实施例7获得的绿豆粗提取液在-20℃冷冻，解冻后进行离心分离，回收上清液。用BCA法测定获得的粗提取液的蛋白质浓度，是15.5mg/mL。向所述粗提取液（200mL）中加入氢氧化钠，调节其pH至11.0。再加入盐酸，将其pH中和至7.0后，用透析膜（截留分子量:14,000）进行透析，将溶剂置换为水，得到溶液（230mL）。用BCA法测定得到的溶液的蛋白质浓度，是10.0mg/mL。
实施例9
将实施例8获得的碱处理后的粗提取液（100mL）提供至如下所述的冰结合物质浓缩操作（指型冷冻器（Cold Finger，CF）法）。换言之，将圆筒（cylinder）状的冷却棒插入到包含冰结晶化抑制物质的实施例8的粗提取液中，低速冷却周围的溶液（在16小时内从-0.5℃至-1.5℃）。在16小时后，回收在冷却棒周围生成的冰结晶化抑制物质所吸附的冰。重复该操作2次，获得CF处理后的溶液（50mL）。用BCA法测定获得的溶液的蛋白质浓度，是4.4μg/mL。使用该溶液进行SDS-PAGE，结果在约48kDa的位置确认到单一的带。
实施例10
向实施例8中得到的碱处理后的粗提取液（230mL）中，逐次少量滴加冷却至-30℃的丙酮，加入丙酮至25v/v%，分离不溶性成分（不溶性级分3）和丙酮溶液。之后，在上述丙酮溶液中加入丙酮至50v/v%后，分离不溶性成分（不溶性级分4）和丙酮溶液。进一步在上述丙酮溶液中加入丙酮至75v/v%后，分离不溶性成分（不溶性级分5）和丙酮溶液。将不溶性级分3～5溶解在5mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中，用透析膜（截留分子量:14,000）透析后，用相同缓冲液置换溶液。不溶性级分3和不溶性级分5没有发现冰结晶化抑制活性；仅不溶性级分4（30mL）确认到强的冰结晶化抑制活性。因此，将不溶性级分4作为丙酮级分回收，用BCA法测定其蛋白质浓度，是3.0mg/mL。
实施例11
将实施例10得到的丙酮级分（3.0mg）上样到用5mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）平衡了的DEAE柱（东曹公司生产，产品名“DEAE TOYOPEARL650M”），在0～0.5Ｍ的NaCl梯度，流速2.0mL/分钟的条件下洗提。将在吸收波长215nm下检测到峰的吸附级分的馏分作为活性级分回收。用透析膜（截留分子量:14,000）透析所获得的级分而脱盐，用去离子水置换溶剂。用BCA法测定获得的级分的蛋白质浓度，是12μg/mL（产量:30mL）。
试验例4测定冰结晶化抑制活性
按与试验例1相同的方法，测定从绿豆提取获得的实施例7～11的各溶液的冰结晶化抑制活性。用与试验例1相同的计算公式，通过BCA法测定的各溶液的蛋白质浓度和作为冰结晶化抑制活性的指标的RI值，求出单位蛋白质的比活性，计算相对于实施例7的粗提取液的相对值。此外，从溶液量和蛋白质浓度计算出从每100ｇ绿豆提取的总蛋白质量。将其结果显示在表4和表5中。
[表4]
Figure BDA0000377029430000161
[表5]
Figure BDA0000377029430000162
如表4所示，实施例7～9通过纯化处理，绿豆的冰结晶化抑制物质被纯化为比活性1.3倍，蛋白质浓度1/3100。此外，如表5所示，通过实施例10～11的纯化处理，绿豆的冰结晶化抑制物质被纯化为比活性5.9倍，蛋白质浓度11/3100。
此外，如表4～5所示，通过实施例8的碱处理，冰结晶化抑制作用增加至1.3倍。该结果显示出碱处理等引起蛋白质变性的条件有增强冰结晶抑制活性的作用。相关结果与已知的抑制变性蛋白质凝集的LEA蛋白特征相关，因此，如下进行试验例5和试验例6。
试验例5使用纯化级分的抑制蛋白质凝集的效果
将15μg市售的乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）溶解在1.0mL水中。在该溶液中溶解9μg实施例9获得的CF处理后的绿豆纯化蛋白质。以未添加CF处理后的纯化蛋白质的LDH水溶液作为对照，用液氮分别冷冻各溶液，在室温解冻。测定解冻后的溶液在340nm的吸光度。结果显示在表6中。
[表6]
样品 吸光度(340nm)
LDH水溶液(对照) 0.21
LDH水溶液+CF纯化蛋白质 0.06
在作为对照的LDH水溶液中，由于冷冻-解冻造成LDH蛋白变性和凝集，溶液的浊度增加。与此相比，在添加了CF处理后的绿豆纯化蛋白质的溶液中，显著抑制了浑浊度的增加。该结果显示实施例9获得的绿豆纯化蛋白质具有抑制蛋白质凝集的LEA蛋白质的特征性功能，同时显示该绿豆纯化蛋白质对伴随冷冻-解冻的蛋白质变性具有保护效果。
试验例6伴有抑制凝集的绿豆粗提取液的冰结晶化抑制活性的增加
将实施例7获得的绿豆粗提取液的蛋白质浓度调整为60mg/mL。在240μL该溶液中溶解30μg实施例9获得的CF处理后的绿豆纯化蛋白质。以未添加CF处理后的纯化蛋白质的绿豆粗提取液作为对照，用液氮冷冻各溶液，在室温解冻。离心分离解冻后的溶液后，调整蛋白质浓度至0.95mg/mL。按与试验例1相同的方法测定溶液的冰结晶化抑制活性结果显示在表7中。
[表7]
原材料 冰结晶化抑制活性(RI值)
绿豆粗提取液(对照) 0.53
绿豆粗提取液+CF纯化蛋白质 0.32
通过添加极少量的实施例9获得的CF处理后的绿豆纯化蛋白质进行冷冻-解冻，显著增加了绿豆粗提取液的冰结晶化抑制活性。仅添加CF处理后的绿豆纯化蛋白质时，不会引起该冰结晶化抑制活性的增加，因此可认为是在施加冷冻-解冻的胁迫时，由于绿豆纯化蛋白质与粗提取液中的蛋白质等发生相互作用，而使冰结晶化抑制活性增加。
实施例12
将实施例11获得的DEAE级分4.5mg作为样品，将其上样到凝胶过滤柱（GE Healthcare公司生产，产品名“Sephacryl S300HR”），在4℃的温度条件下，以流速0.5mL/分钟的条件流过5mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0，含0.15M NaCl），洗提非吸附级分，在吸收波长215nm下检测。此外，用相同条件洗提不同分子量的标准蛋白质。通过上述柱色谱，确认到与实施例6纯化的大纳言小豆相同分子量（16万和13万）的吸收峰。
Figure IDA0000377029510000011

Claims (13)

1.冰结晶化抑制物质，其包含源自豆科豇豆属植物、或豆科豇豆属植物的近缘品种、或者它们的改良品种的种子蛋白质。
2.根据权利要求1所述的冰结晶化抑制物质，其中，所述豆科豇豆属植物为小豆或绿豆。
3.根据权利要求1或2所述的冰结晶化抑制物质，其中，所述种子蛋白质为籽粒灌浆期蛋白质。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的冰结晶化抑制物质，其中，所述种子蛋白质为LEA蛋白（胚胎发育后期富集蛋白）。
5.根据权利要求4所述的冰结晶化抑制物质，其中，所述种子蛋白质的氨基酸序列为序列号1的序列，或者为该序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸而成的、且包含成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标的序列的序列。
6.根据权利要求4所述的冰结晶化抑制物质，其中，所述种子蛋白质的氨基酸序列为序列号2的序列，或者为该序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸而成的、且包含成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标的序列的序列。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的冰结晶化抑制物质，其中，所述种子蛋白质与其他蛋白质形成复合体。
8.抗体，其与权利要求1～7中任一项所述的冰结晶化抑制物质特异性地反应。
9.组合物，其包含权利要求1～7中任一项所述的冰结晶化抑制物质。
10.食品，其包含权利要求1～7中任一项所述的冰结晶化抑制物质。
11.生物试样保护剂，其包含权利要求1～7中任一项所述的冰结晶化抑制物质。
12.化妆品，其包含权利要求1～7中任一项所述的冰结晶化抑制物质。
13.肽，其为序列号2的序列，或者为该序列中缺失、取代或添加了一个或多个氨基酸而成的、且包含成为具有冰结晶化抑制作用的蛋白质的指标的序列的序列。
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