CN105646647A

CN105646647A - 一种鸡胚多肽及其制备方法与应用

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Publication number: CN105646647A
Application number: CN201511017069.6A
Authority: CN
Inventors: 耿威; 金英花; 战铁楠; 耿利; 李杨; 王莉红; 王笑琳; 耿晓宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2016-06-08

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡胚多肽及其制备方法与应用。本发明提供的鸡胚多肽的分子量为10kDa～50kDa。本发明提供的鸡胚多肽能够清除自由基，特别是细胞内的自由基，从而起到抗氧化、抗衰老的作用。本发明提供的鸡胚多肽的制备方法操作简便，通过匀浆、冻融和超声破碎，最大程度上的破碎了细胞膜，使胞内的活性肽得到良好的溶出，再经酶解、离心、超滤等生物技术工艺，从而提高了提取效率。

Description

一种鸡胚多肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡胚多肽及其制备方法与应用。

背景技术

肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。多肽与蛋白质之间并无明显的界限，通常10个以上的氨基酸组成的肽称为多肽，而本发明的多肽是由完整的生命体提取的多肽，其中含有丰富的细胞因子类多肽。

鸡胚即鸡的胚胎，是受精鸡蛋孵化至一定天数后，还未破壳的可食用鸡蛋。研究表明，鸡胚中包含的营养成分包括蛋白质、多肽、氨基酸、碳水化合物(葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、呋喃糖等)、脂类、脂肪酸等。另外，鸡胚中还包括抗感染成分和生物活性物质。所述的抗感染成分有球蛋白、干扰素、胎儿蛋白、溶菌酶和磷酸二酯酶；所述的生物活性物质有唾液酸、儿苯酚胺、胰岛素样生长因子-I、胰岛素、激肽酶、组胺酶、胆碱、红细胞生成素、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶等。相对于未孵化的鸡蛋，鸡胚中营养成分，特别是小分子蛋白或多肽的含量更加丰富，而对人体不理的脂肪、胆固醇等含量则大幅下降。

鸡胚营养丰富，具有潜在的护肤、保健和药用价值。但目前对鸡胚中肽的研究目前还较少，应对其在化妆品、保健品和药品的研究中进行进一步的开发和利用。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种鸡胚多肽及其制备方法与应用。本发明提供的鸡胚多肽具有良好的清除自由基的效果，能够起到抗氧化、抗衰老的作用。

本发明提供的鸡胚多肽的分子量为10kDa～50kDa。

本发明制得的鸡胚多肽中，共检测到活性肽105条，分别来自49种不同的蛋白质。根据PSMs(Peptide-SpectralMatch)，这些蛋白质主要为：登录号为E1BTF4的蛋白、Ovomucoid(登录号B6V1G0)、Parvalbumin,thymic(登录号P19753)、登录号为F1NZY2的蛋白、HistoneH3.2(登录号P84229)、登录号为F1NIU9的蛋白、Polyubiquitin-B(登录号P0CG62)、Ovalbumin-relatedproteinX(登录号R9TNA6)、Vitellogenin-1(登录号F1P350)和Vitellogenin-2(登录号P02845)。

本发明的鸡胚多肽中，鸡胚多肽的浓度为0.1g/μL。

本发明提供的鸡胚多肽的制备方法包括：将鸡胚去壳、匀浆后，破碎细胞；经胰酶酶解后，离心收集上清液，超滤截留分子量为10kDa～50kDa的组分。

本发明所采用的鸡胚为孵化至14～19天的鸡胚。

具体的，鸡胚的获取方式为，取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.5℃，相对湿度60％，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至14～19天，

作为优选，采用孵化至16～17天的鸡胚。

受精鸡胚孵化至14天～19天的鸡胚的胚胎处于干细胞高度增长期，各种组织器官基本形成。在鸡胚的孵化过程中，蛋白质的代谢十分剧烈，孵化期间，蛋白质和多肽的含量呈持续上升状态。研究表明，在孵化的第14天～19天，鸡胚中蛋白质和多肽的增加幅度最大，各种细胞因子类多肽最多。

制备鸡胚多肽前，孵化鸡胚停止孵化。具体为，将孵化鸡胚放置于-20℃停止孵化。

本发明中，所述匀浆采用组织匀浆机。

具体为：将孵化至14d～19d的鸡蛋表面消毒，去除蛋壳后以组织匀浆机匀浆。作为优选，匀浆的温度为4℃，时间为20min转速为2500r/min。

经组织匀浆，鸡胚组织粉碎，细胞在匀浆机的机械作用下初步破碎。为了进一步破碎细胞，进行冻融和超声破碎。

在本发明实施例中，破碎细胞包括冻融和超声破碎的步骤；

冻融的冷冻温度为-20℃～-40℃，时间为60h～80h；溶解温度为4℃～8℃；

超声破碎的温度为4℃～8℃，功率为800W～1200W，时间为15min～25min。

在一些实施例中，破碎细胞包括冻融和超声破碎的步骤；

冻融的冷冻温度为-30℃，时间为72h；溶解温度为4℃；

超声破碎的温度为4℃，功率为1000W，时间为20min。

冻融使细胞在冷冻-融化的过程中，由于细胞内形成冰粒而使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞破碎。本发明中，溶解的温度为4℃，溶解至细胞匀浆融化。经冻融后，细胞膜进一步的破裂，再进行超声波破碎，从而使细胞膜的破碎程度更加完全，提高了活性肽的提取效率。

在本发明中，经过超声破碎的组织匀浆与等体积的水混合后，进行酶解。

所述酶解指在组织匀浆与胰酶共同孵育，使蛋白质发生分解的过程。

本发明中，酶解时胰酶的质量分数为2.5％。即将胰酶加入组织匀浆至质量分数为2.5％。

在本发明中，胰酶的酶活力为37000u/g。

在本发明中，酶解的温度为45℃～55℃，pH值为7.3～7.7，酶解时间为40min～80min。

在一些实施例中，酶解的温度为50℃，pH值为7.5，酶解时间为1h。

离心后，弃除组织碎片，收集上清液。该上清液中富含蛋白质、活性肽和游离氨基酸。

在本发明的实施例中，离心的转速为4500转/min，离心的时间为20min，离心的温度为4℃。

截留具体指使上清液经过50kDa的滤膜，收集分子量50kDa以内的超滤液；然后使超滤液经过10kDa的滤膜，收集分子量为10kDa～50kDa的部分。

本领域技术人员还可以按照公知的方法对组织匀浆、上清液以及超滤收集的组分进行冷冻干燥。

作为优选，截留后还包括调节pH值为6.8～7.2的步骤。

在pH值为6.8～7.2的范围内，鸡胚多肽的性质稳定，活性较高。

所述冷冻干燥为鸡胚活性肽与冷冻干燥剂混合，经冷冻干燥制得冻干粉。所述冷冻干燥剂为甘露醇。具体的，组织匀浆、上清液以及超滤收集的组分中加入甘露醇至质量分数为15％进行冷冻干燥。优选的，在超滤收集的组分中加入甘露醇至质量分数为15％进行冷冻干燥。

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，实验表明，本发明提供的鸡胚多肽能够消除自由基，其效果在鸡胚多肽浓度为0.4～1.73mg/mL范围内具有量效关系，在1.73mg/mL下其消除效果达约70％。另外，实验表明，本发明提供的鸡胚多肽能够清除细胞内的ROS，当鸡胚多肽的浓度为100μg/mL时鸡胚多肽能够消除H₂O₂产生的自由基，其消除效率高达77％。研究表明，衰老的原因主要有过度氧化和蛋白质的老化。本发明提供的鸡胚多肽能够清除自由基，具有抗氧化的作用，从而起到抗衰老的作用。

因此，本发明提供了：

鸡胚多肽在制备在制备抗氧化和/或抗衰老的产品中的应用。

一种抗氧化和/或抗衰老的保健品，包括本发明提供的鸡胚多肽。

本发明提供的保健品的剂型为口服液。

口服液中鸡胚多肽的含量为10mg/ml，辅料包括水、甜味剂和香料。

一种抗氧化和/或抗衰老的化妆品，包括本发明提供的鸡胚多肽。

本发明提供的化妆品的剂型为精华液、面膜、膏霜、消炎抗过敏、抗衰乳液等。

一种化妆品，包括鸡胚多肽、透明质酸、黄原胶、荷荷巴油、熊果苷、甘草酸二钾和甘油。

其中，鸡胚多肽的浓度为0.5mg/mL～3.0mg/mL，透明质酸的质量分数为0.3％，黄原胶质量分数0.3％，荷荷巴油质量分数1％，熊果苷质量分数0.5％，甘油的质量分数为3％，甘草酸二钾质量分数为0.1％，余量为去离子水。

本发明提供的鸡胚多肽的分子量为10kDa～50kDa。本发明提供的鸡胚多肽能够消除自由基，其消除效率高达70％以上。研究表明，衰老的原因主要有过度氧化和蛋白质的老化。本发明提供的鸡胚多肽能够清除自由基，具有抗氧化的作用，从而起到抗衰老的作用。本发明提供的鸡胚多肽的制备方法操作简便，通过匀浆、冻融和超声破碎，最大程度上的破碎了细胞膜，使细胞内的活性肽得到良好的溶出，从而提高了提取效率。

附图说明

图1示实施例1制得鸡胚多肽胞外去除自由基效果；

图2示实施例1制得鸡胚多肽胞内去除自由基效果。

具体实施方式

本发明提供了一种鸡胚多肽及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的材料、仪器或试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(1)孵化鸡胚：取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.5℃，相对湿度60％，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至16天，取出受精鸡蛋，放-20℃的冷库中，停止孵化并保存备用。

(2)匀浆及细胞破碎：对孵化的鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在4℃下将鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入灭菌后的密封盒中，放到-30℃的冷库中冷冻72小时，融解后于4℃的环境中对其进行细胞超声破碎，加入等量的注射用水，放置于4℃的冷藏库中备用。

(3)酶水解及离心：取细胞破碎后的冷藏液加热水浴至50℃,调pH至7.5，加入胰酶至浓度为2.5％(质量分数)水解恒温水浴1小时，在4℃、4500r/min条件下离心20分钟，收上清液在降温至4℃冷藏备用。

(4)超滤及调PH值：截留具体指使上清液经过50kDa的滤膜，收集分子量50kDa以内的超滤液；然后使超滤液经过10kDa的滤膜，收集分子量为10kDa～50kDa的部分。调pH值至6.8～7.2，制得鸡胚多肽。

实施例2

(1)孵化鸡胚：取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.5℃，相对湿度60％，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至14天，取出受精鸡蛋，放-20℃的冷库中，停止孵化并保存备用。

(2)匀浆及细胞破碎：对孵化的鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在5℃下将鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入灭菌后的密封盒中，放到-20℃的冷库中冷冻80小时，融解后于8℃的环境中对其进行细胞超声破碎，加入等量的注射用水，放置于4℃的冷藏库中备用。

(3)酶水解及离心：取细胞破碎后的冷藏液加热水浴至55℃,调pH至7.7，加入胰酶至浓度为2.5％(质量分数)水解恒温水浴80min，在4℃、4500r/min条件下离心20分钟，收上清液在降温至4℃冷藏备用。

实施例3

(1)孵化鸡胚：取SPF级受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.5℃，相对湿度60％，每2小时自动翻蛋一次，待孵化至19天，取出受精鸡蛋，放-20℃的冷库中，停止孵化并保存备用。

(2)匀浆及细胞破碎：对孵化的鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在4℃下将鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入灭菌后的密封盒中，放到-30℃的冷库中冷冻60小时，融解后于0℃的环境中对其进行细胞超声破碎，加入等量的注射用水，放置于4℃的冷藏库中备用。

(3)酶水解及离心：取细胞破碎后的冷藏液加热水浴至45℃,调pH至7.3，加入胰酶至浓度为2.5％(质量分数)水解恒温水浴40min，在4℃、4500r/min条件下离心20分钟，收上清液在降温至4℃冷藏备用。

实施例4

实施例1制得活性肽经shotgun分析，活性肽的含量为0.1μg/μL；肽段数量共计105条，分别来自50种不同的蛋白，具体结果如表1：

表1shotgun分析结果

实施例5

利用DPPH自由基清除法进行体外实验。鸡胚多肽清除自由基活性的检测：DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，在波长为517nm下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且吸光值下降程度与DPPH自由基消除活性呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。

采用DPPH自由基清除法测定鸡胚多肽消除自由基的作用：取DPPH1mg溶于约20mL95％乙醇中，样品溶于95％乙醇中，配成1mg/mL浓度。在预试过程中，发现加入鸡胚多肽260μL时颜色基本褪去，则260μL为鸡胚多肽的最大用量。样品用量设为60、110、160、210、260μL。A₀值的测量：取DPPH溶液2mL加入到EP管中，加95％乙醇1mL，测519nm下的吸光值为A₀。A值的测量：取DPPH溶液2mL加入EP管中，分别加鸡胚多肽溶液60、110、160、210、260μL，再用95％乙醇补齐至1000μL，混合，静置30分钟后，测其吸光值(519nm)为A。

清除率的计算公式：

结果如图1。结果表明：鸡胚多肽强效清除自由基，0.4～1.73mg/mL范围内具有量效关系，在1.73mg/mL下其消除效果达约70％。

实施例6

利用活性氧ROS检测方法。活性氧检测试剂盒(ReactiveOxygenSpeciesAssayKit)是一种基于荧光染料DCFH-DA的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞内，可被细胞内的酯酶水解生成DCFH。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。在最大激发波长480nm，最大发射波长525nm处，使用荧光显微镜或多功能酶标仪检测荧光信号。

采用ROS检测试剂盒检测细胞内的ROS含量。将HDF-细胞接种于6孔板内，培养24小时后，装载探针DCFH-DA(10M)，37℃细胞培养箱内孵育30分钟。分组为：1)正常对照组；2)阳性对照组：加终浓度为200M的H₂O₂；3)实验组分别为，4)、5)、6)：分别加入不同浓度的鸡胚多肽100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL)。孵育30分钟后，利用200M的H₂O₂处理1小时。收集细胞，用PBS重悬细胞，利用多功能酶标仪(TECAN，GENios)测定这些细胞的荧光值：激发光和发射光的波长分别为，488nm、525nm。

结果图2。结果表明：100g/mL鸡胚多肽能够高效消除H₂O₂产生的自由基，其消除效率高达77％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种鸡胚多肽，其特征在于，所述鸡胚多肽的分子量为10kDa～50kDa。

2.权利要求1所述鸡胚多肽的制备方法，其特征在于，包括：将鸡胚去壳、匀浆后，破碎细胞；经胰酶酶解后，离心收集上清液，超滤截留分子量为10kDa～50kDa的组分。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述破碎细胞包括冻融和超声破碎的步骤；

所述冻融的冷冻温度为-20℃～-40℃，时间为60h～80h；溶解温度为4℃～8℃；

所述超声破碎的4℃～8℃，功率为800W～1200W，时间为15min～25min。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的酶解液中，胰酶的质量分数为2.5％。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的温度为45℃～55℃，pH值为7.3～7.7，酶解时间为40min～80min。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为4500转/min，离心的时间为20min，离心的温度为4℃。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述截留后还包括调节pH值为6.8～7.2的步骤。

8.权利要求1所述的鸡胚多肽或权利要求2～7任一项所述制备方法制备的鸡胚多肽在制备抗氧化和/或抗衰老的产品中的应用。

9.一种抗氧化和/或抗衰老的化妆品，其特征在于，包括权利要求1所述的鸡胚多肽或权利要求2～7任一项所述制备方法制得的鸡胚多肽。

10.一种抗氧化和/或抗衰老的保健品，其特征在于，包括权利要求1所述的鸡胚多肽或权利要求2～7任一项所述制备方法制得的鸡胚多肽。