CN109370982A - 一种鸡胚提取物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鸡胚提取物及其制备方法，以及该鸡胚提取物在动物细胞体外培养中的应用。本发明采用超声破碎鸡胚浸出液中组织和细胞内的营养成分，再加上液氮的反复冻融，其营养物质的质和量显著高于现有的鸡胚提取物。本发明经过研磨、超声破碎和冻融的鸡胚提取物内含有大量的细胞生长因子、大分子蛋白及一些小分子氨基酸等，有促进细胞生长的作用，可用于动物细胞尤其是家禽细胞的体外培养，所培养的细胞形态饱满，繁殖活力强。

Description

一种鸡胚提取物及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种鸡胚提取物及其制备方法，以及该鸡胚提取物在动物细胞体外培养中的应用。
(二)背景技术
鸡胚胎是受精种蛋通过人工或自然孵化培育出来的未孵化出小鸡之前的一种动物胚胎。鸡胚胎在血管全部形成后，呈现似肉非肉，似蛋非蛋的状态，含有丰富的蛋白质、十八种氨基酸及多种微量元素。
鸡胚提取物是从生长9～12天的鸡胚中提取的，其是一种优质蛋白，蛋白质含量高，氨基酸模式与人体的氨基酸模式一致，含有丰富的矿物元素和维生素，具有很高的营养价值，可作为组织培养中的生长因子补充成分。
现有鸡胚提取物主要利用Hanks液来浸出鸡胚中的营养成分，提取物营养不全；部分采用置入冰箱反复冻融，耗时长，且营养成分有所流失。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种营养物质含量高的鸡胚提取物及其制备方法，以及该鸡胚提取物在动物细胞体外培养中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种鸡胚提取物，由如下方法制备获得：
(1)种蛋孵化：选取鸡新鲜种蛋，于恒温孵化箱内进行孵化；
(2)蛋壳消毒：孵育至10日龄取出种蛋，消毒蛋壳表面，气室端向上置于消毒过的蛋托上；
(3)取鸡胚：去除气室端蛋壳，拨开尿囊膜，用镊子夹取鸡胚置于平皿中；
(4)鸡胚处理：去除胚眼、喙、气囊、膜囊、尿囊膜，用无菌PBS充分冲洗鸡胚；
(5)鸡胚研磨：将处理好的鸡胚置于无菌玻璃皿中充分剪碎后置于离心管中，用全自动冷冻组织研磨仪充分研磨至匀浆状；
(6)浸出：在离心管中加入等量Hanks液，吹打均匀，封口膜密封后置于37℃恒温培养箱中1小时；
(7)超声破碎：将密封的离心管取出后，进行超声破碎；
(8)反复冻融：将离心管投入液氮中彻底冷冻后取出，室温放置至彻底溶解，如此反复冻融3次；
(9)离心：离心，吸取上清液，收集于小瓶中；
(10)过滤：将收集的上清液依次用0.44μm和0.22μm滤膜过滤后，即得所述鸡胚提取物，置于-80℃冰箱中保存备用。
本发明采用超声破碎浸出液中组织和细胞内的营养成分，再加上液氮反复冻融，其营养物质的质和量显著高于现有Hanks浸提、冰箱反复冻融等常规方法所获提取物。
本发明还涉及所述鸡胚提取物的制备方法，所述方法包括：
(1)种蛋孵化：选取鸡新鲜种蛋，置于37℃全自动恒温孵化箱内进行孵化；
(2)蛋壳消毒：孵育至10日龄取出种蛋，用酒精消毒蛋壳表面，气室端向上置于消毒过的蛋托上；
(3)取鸡胚：去除气室端蛋壳，拨开尿囊膜，用镊子夹取鸡胚置于平皿中；
(4)鸡胚处理：去除胚眼、喙、气囊、膜囊、尿囊膜，用无菌PBS充分冲洗鸡胚3次；
(5)鸡胚研磨：将处理好的鸡胚置于无菌玻璃皿中充分剪碎后置于离心管中，用全自动冷冻组织研磨仪充分研磨至匀浆状；
(6)浸出：在离心管中加入等量Hanks液，吹打均匀，封口膜密封后置于37℃恒温培养箱中1小时；
(7)超声破碎：将密封的离心管取出后，利用非接触式超声波粉碎机进行破碎；
(8)反复冻融：将离心管投入液氮中彻底冷冻后取出，室温放置至彻底溶解，如此反复冻融3次；
(9)离心：冷冻离心机中4℃、4000r/min离心30分钟，吸取上清液，收集于小瓶中；
(10)过滤：将收集的上清液依次用0.44μm和0.22μm滤膜过滤后，即得所述鸡胚提取物，置于-80℃冰箱中保存备用。
本发明还涉及所述鸡胚提取物在动物细胞体外培养中的应用。
具体为，所述鸡胚提取物在培养基中的添加量为1～2mL/100mL。
本发明所述经过研磨、超声破碎和冻融的鸡胚提取物内含有大量的细胞生长因子、大分子蛋白及一些小分子氨基酸等，具有促进细胞生长的作用，可用于动物细胞尤其是家禽细胞体外培养，所培养的细胞形态饱满，繁殖活力强，具有较好应用前景。
(四)附图说明
图1为细胞贴壁培养48h显微镜观察图片；(A)完全培养基内未添加鸡胚提取物，(B)完全培养基内添加现有鸡胚提取物，(C)完全培养基内添加本发明鸡胚提取物。
图2为细胞生长曲线比较
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
鸡胚提取物提取方法：
(1)种蛋孵化：选取鸡新鲜种蛋，置于37℃全自动恒温孵化箱内；
(2)蛋壳消毒：孵育至10日龄取出种蛋，酒精消毒蛋壳表面，气室端向上置于消毒过的蛋托上；
(3)取鸡胚：去除气室端蛋壳，拨开尿囊膜，用镊子夹取鸡胚置于平皿中；
(4)鸡胚处理：去除胚眼、喙、气囊、膜囊、尿囊膜等，用无菌PBS充分冲洗鸡胚3次；
(5)鸡胚研磨：将处理好的鸡胚置于无菌玻璃皿中充分剪碎后置于离心管中，用全自动冷冻组织研磨仪充分研磨至匀浆状；
(6)浸出：在离心管中加入等量Hanks液，吹打均匀，封口膜密封后置于37℃恒温培养箱中1小时；
(7)超声破碎：将密封的离心管取出后，利用非接触式超声波粉碎机进行破碎；
(8)反复冻融：将离心管投入液氮中彻底冷冻后取出，室温放置至彻底溶解，如此反复冻融3次；
(9)离心：冷冻离心机中4℃、4000r/min离心30分钟，吸取上清液，收集于小瓶中；
(10)过滤：将收集的上清液依次用0.44μm和0.22μm滤膜过滤后，即得所述鸡胚提取物，置于-80℃冰箱中保存备用。
注：所有过程均遵循无菌操作规范。
实施例2：
采用酶消化法培养原代鸡成肌细胞，比较(A)完全培养基内未添加鸡胚提取物、(B)完全培养基内添加现有鸡胚提取物(每100mL培养基中加入1mL现有鸡胚提取物，爱必信(上海)生物科技有限公司)和(C)完全培养基内添加本发明鸡胚提取物(每100mL培养基中加入1mL实施例1鸡胚提取物)所培养的细胞形态和增殖速度。
1.细胞贴壁培养48h显微镜观察
结果如图1所示，采用酶消化法培养原代鸡成肌细胞48h后，成肌细胞完全贴壁。比较完全培养基内未添加鸡胚提取物(A)、完全培养基内添加现有鸡胚提取物(B)和完全培养基内添加本发明鸡胚提取物(C)的细胞形态，发现添加鸡胚提取物后的细胞贴壁后形态比未添加鸡胚提取物饱满、更有立体感，呈梭形或三角形，且从肉眼判断细胞数量为：完全培养基内添加本发明鸡胚提取物(C)>完全培养基内添加现有鸡胚提取物(B)>完全培养基内未添加鸡胚提取物(A)。
2.细胞生长曲线比较
采用酶消化法培养原代鸡成肌细胞，绘制完全培养基内未添加鸡胚提取物(A)、完全培养基内添加现有鸡胚提取物(B)和完全培养基内添加本发明鸡胚提取物(C)所培养的细胞的生长曲线。绘制细胞生长曲线采用第二代鸡成肌细胞，在96孔细胞培养板中每孔加入大约0.2×104个细胞，设3个重复孔，连续培养9天，每天定时加入10μL CCK-8溶液后继续在细胞培养箱内孵育150min，以只有完全培养液的孔为空白对照，用酶标仪在450nm测定吸光度进行检测。采集9天的数据进行比较。
比较结果如图2所示，三个组的细胞生长曲线基本都呈“S”形，符合一般细胞的生长规律。在完全培养基内添加本发明鸡胚提取物(C)后，细胞增殖速度显著高于添加现有鸡胚提取物组(B)和未添加鸡胚提取物组(A)。完全培养基内添加本发明鸡胚提取物组(C)的细胞培养2天后大量增殖，细胞数量明显增多，培养至第7天时细胞生长速度明显减缓，到第8天时细胞生长进去平台期。而完全培养基内添加现有鸡胚提取物组(B)和未添加鸡胚提取物组(A)的细胞在培养3天后才大量增殖，且细胞在第6天生长速度明显下降，到第7天时细胞生长进入平台期。
实验结果表明本方法所制备的鸡胚提取物能够有效地促进细胞生长，所培养的细胞形态饱满，繁殖活力强。

Claims (4)

1.一种鸡胚提取物，由如下方法制备获得：
(1)种蛋孵化：选取鸡新鲜种蛋，于恒温孵化箱内进行孵化；
(2)蛋壳消毒：孵育至10日龄取出种蛋，消毒蛋壳表面，气室端向上置于消毒过的蛋托上；
(3)取鸡胚：去除气室端蛋壳，拨开尿囊膜，用镊子夹取鸡胚置于平皿中；
(4)鸡胚处理：去除胚眼、喙、气囊、膜囊、尿囊膜，用无菌PBS充分冲洗鸡胚；
(5)鸡胚研磨：将处理好的鸡胚置于无菌玻璃皿中充分剪碎后置于离心管中，用全自动冷冻组织研磨仪充分研磨至匀浆状；
(6)浸出：在离心管中加入等量Hanks液，吹打均匀，封口膜密封后置于37℃恒温培养箱中1小时；
(7)超声破碎：将密封的离心管取出后，进行超声破碎；
(8)反复冻融：将离心管投入液氮中彻底冷冻后取出，室温放置至彻底溶解，如此反复冻融3次；
(9)离心：离心，吸取上清液，收集于小瓶中；
(10)过滤：将收集的上清液依次用0.44μm和0.22μm滤膜过滤后，即得所述鸡胚提取物，置于-80℃冰箱中保存备用。
2.权利要求1所述鸡胚提取物的制备方法，所述方法包括：
(1)种蛋孵化：选取鸡新鲜种蛋，置于37℃全自动恒温孵化箱内进行孵化；
(2)蛋壳消毒：孵育至10日龄取出种蛋，用酒精消毒蛋壳表面，气室端向上置于消毒过的蛋托上；
(3)取鸡胚：去除气室端蛋壳，拨开尿囊膜，用镊子夹取鸡胚置于平皿中；
(4)鸡胚处理：去除胚眼、喙、气囊、膜囊、尿囊膜，用无菌PBS充分冲洗鸡胚3次；
(5)鸡胚研磨：将处理好的鸡胚置于无菌玻璃皿中充分剪碎后置于离心管中，用全自动冷冻组织研磨仪充分研磨至匀浆状；
(6)浸出：在离心管中加入等量Hanks液，吹打均匀，封口膜密封后置于37℃恒温培养箱中1小时；
(7)超声破碎：将密封的离心管取出后，利用非接触式超声波粉碎机进行破碎；
(8)反复冻融：将离心管投入液氮中彻底冷冻后取出，室温放置至彻底溶解，如此反复冻融3次；
(9)离心：冷冻离心机中4℃、4000r/min离心30分钟，吸取上清液，收集于小瓶中；
(10)过滤：将收集的上清液依次用0.44μm和0.22μm滤膜过滤后，即得所述鸡胚提取物，置于-80℃冰箱中保存备用。
3.权利要求1所述鸡胚提取物在动物细胞体外培养中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述鸡胚提取物在培养基中的添加量为1～2mL/100mL。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114569636A (zh) * 2020-12-02 2022-06-03 西南交通大学 鸡胚胎加工品、其制备方法及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102908366A (zh) * 2011-08-02 2013-02-06 天津泽世德生物医药有限公司 一种鸡胚活性成分的制备方法
CN105380818A (zh) * 2015-12-30 2016-03-09 耿威 鸡胚活性肽在制备保护细胞活力的产品中的应用
CN105411874A (zh) * 2015-12-30 2016-03-23 耿威 一种鸡胚活性肽及其制备方法与应用
CN105646647A (zh) * 2015-12-30 2016-06-08 耿威 一种鸡胚多肽及其制备方法与应用
CN109069516A (zh) * 2016-02-01 2018-12-21 哈佛学院校长同事会 用于小鼠卫星细胞增殖的小分子

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102908366A (zh) * 2011-08-02 2013-02-06 天津泽世德生物医药有限公司 一种鸡胚活性成分的制备方法
CN105380818A (zh) * 2015-12-30 2016-03-09 耿威 鸡胚活性肽在制备保护细胞活力的产品中的应用
CN105411874A (zh) * 2015-12-30 2016-03-23 耿威 一种鸡胚活性肽及其制备方法与应用
CN105646647A (zh) * 2015-12-30 2016-06-08 耿威 一种鸡胚多肽及其制备方法与应用
CN109069516A (zh) * 2016-02-01 2018-12-21 哈佛学院校长同事会 用于小鼠卫星细胞增殖的小分子

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴琼: ""硒对鸡成肌细胞分化及骨骼肌验证基因表达影响的研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》 *
魏莉莉: ""早期鸡胚活性粗提物的初步应用研究"", 《中国优秀硕士论文（电子期刊）基础科学辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114569636A (zh) * 2020-12-02 2022-06-03 西南交通大学 鸡胚胎加工品、其制备方法及其用途

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