CN110129251A - 钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，属于生物技术领域，包括：在盐胁迫环境下，对螺旋藻进行耐盐驯化培育的工序；将驯化培育后的螺旋藻置于氧分压上升的环境中进行细胞分化培育的工序；以及，进一步扩大化培育，并收集所得耐盐耐氧性螺旋藻藻种的工序；上述盐胁迫环境中初始盐浓度为0.1‑1％，终止浓度为3.5‑5％。本发明提供的培育方法能在细胞早期进行刺激性培育，能使得藻类超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性升高，能增加藻丝螺距和长度以提高生物质密度和过滤采收效率，能降低丙二醛生成量，促进藻体中藻蓝蛋白和多糖含量增加，有利于工业化定向获取藻蓝蛋白、多糖等营养物质。

Description

钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法。

背景技术

螺旋藻是一种开发价值极高的新资源微藻，它富含藻多糖、不饱和脂肪酸、藻胆蛋白、β-胡萝卜素、超氧化物歧化酶以及多种维生素等生物活性物质，具有营养保健、预防疾病和辅助治疗的功效，是天然保健食品和药源食物。目前全世界已知螺旋藻有30余种，国内外人工养殖和工厂化生产的螺旋藻只有极大螺旋藻和钝顶螺旋藻2种。与钝顶螺旋藻相比，极大螺旋藻的藻丝更长、螺距更宽，但从营养成分来说，钝顶螺旋藻的营养成分更高、更易于吸收，所以国际上都食用钝顶螺旋藻。钝顶螺旋藻的作用比较多，一般最常用也最主要的作用为提高机体免疫力、促进肠胃蠕动、补充机体的常规元素和微量元素。值得一提的是螺旋藻藻蓝蛋白，藻蓝蛋是一种天然的食用色素、浴于水，不溶于油脂和醇类，是一种蓝色粉末。具有抗癌、促进细胞再生的功能、可作为高级的天然色素。

螺旋藻作为一种重要的经济蓝藻，从各种不同盐度的生境中分离出来，一般在干旱和半干旱条件下的室外开放池中大规模养殖。螺旋藻的养殖通常需要较高的温度和较强的阳光辐射，因此在室外养殖条件下，由于水分的大量蒸发会造成养殖池中培养液中盐浓度不断的增长。因此，室外养殖的螺旋藻细胞一直经受着持续的盐胁迫条件。盐度是影响植物生长及其产量的重要环境因子，盐胁迫条件下，螺旋藻的光合作用和呼吸作用系统都会被抑制，进而影响螺旋藻的生长发育及藻丝形态，而藻丝的形态对螺旋藻的收获会产生很大的影响，如果藻丝断裂严重，并出现大量短小个体，会增大收获的难度和成本，进而影响螺旋藻产量及生产成本。植物在受到逆境胁迫时，会表现出不同的性状，盐胁迫是影响植物生长发育的一个重要环境因素，因此在盐胁迫环境下培育钝顶螺旋藻，并定向增产和获取藻蓝蛋白、多糖等营养物质，对指导螺旋藻养殖产业生产、降低养殖成本具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能在细胞早期进行刺激性培育，能使得藻类超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性升高，能降低丙二醛生成量，促进藻体中藻蓝蛋白和多糖含量增加，能增加藻丝螺距和长度以提高生物质密度和过滤采收效率的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，包括：在盐胁迫环境下，对螺旋藻进行耐盐驯化培育的工序；将驯化培育后的螺旋藻置于氧分压上升的环境中进行细胞分化培育的工序；以及，进一步扩大化培育，并收集所得耐盐耐氧性螺旋藻的工序；上述盐胁迫环境中初始盐浓度为0.1-1％，终止浓度为3.5-5％。该培育方法利用盐胁迫环境和氧分压上升的环境对螺旋藻进行驯化培育，能在细胞早期发育环境的条件下进行刺激性培育，使得细胞产生自身防御特性及抗性物质，进而获得被驯化培育的螺旋藻繁殖产物，该培育方法所得螺旋藻产物较正常环境中培育的螺旋藻的生长状态有显著的有益增长，产物细胞繁殖分化效率提高，藻丝螺距和长度显著增加，以此提高螺旋藻的生物质密度和过滤采收效率，螺旋藻中藻胆蛋白含量、多糖含量及叶绿素a浓度显著增多，β-胡萝卜素和玉米黄质积累量也有所提升，有利于工业化定向获取藻蓝蛋白、多糖等营养物质。

对本发明而言，氧分压上升的环境是包括在低氧分压和更高的氧分压下进行细胞培养的环境，其中低氧分压环境中氧含量为0.1-5％，更高的氧分压环境中氧含量为5.1-7.5％。优选地，氧分压改变时间点是在培育周期的3/4处。在低氧环境下对螺旋藻细胞进行分化诱导培育，由于外源氧可利用率改变，会刺激细胞分化时器官发生因子表达量的改变，如超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性升高，并产生比在含氧量正常条件下生长时高1.5倍以上水平表达的细胞，因此氧分压上升的环境下对螺旋藻的驯化培育具有显著的有益影响。

对本发明而言，耐盐驯化培育采用盐浓度递增的培育方法，盐浓度以0.5％的浓度梯度递增，盐浓度增加间隔时间为24-36h。采用逐步增加盐浓度进行耐盐强化的方法，能减轻瞬间高浓度盐对螺旋藻细胞造成的冲击和毒害，逐级增加盐浓度才能增加螺旋藻的抗盐性和耐盐性，进而驯化出耐盐螺旋藻。

对本发明而言，驯化培育及扩大化培育用培养液中HCO₃ ^-的浓度为2-3g/L，CO₃ ^2-的浓度为9-10.5g/L；分化培育用培养液中HCO₃ ^-的浓度为3.5-4.5g/L，CO₃ ^2-的浓度为11-12g/L。通过调控环境因子，尤其是增加HCO₃ ^-、CO₃ ^2-浓度，能促进螺旋藻丝上HCO₃ ^-转运蛋白表达增强，致使螺旋藻藻丝螺距及长度增加，经过对HCO₃ ^-、CO₃ ^2-浓度调控，分化培育所得螺旋藻丝平均螺距从40-50μm增加到70-80μm，藻丝平均长度从400-550μm增加到650-800μm，显著提高了生物质密度和过滤采收效率，增加了螺旋藻的生长采收效益。

对本发明而言，驯化培育及扩大化培育的培育条件为：光照：昼8000-15000lx/夜0-5000lx，光/暗周期为12h/12h，培育周期皆为5-7d；分化培育的培育条件为：光照：昼25000-32000lx/夜0-8000lx，光/暗周期为12h/12h，培育周期为7-10d。优选地，培育中培养液温度控制为：日28-32℃/夜25-28℃。通过优化螺旋藻生长培育条件，筛选出在胁迫环境下生长良好的螺旋藻或藻种，促进辅助色素如β-胡萝卜素和玉米黄质以及叶绿素a的积累，能提高光合作用效率及营养物质积累量，对于实际生产具有重要的经济意义。

对本发明而言，培育用培养液中包括浓度分别为20-50mg/L的聚戊烯醇提取物和10-30mg/L的4-羟基丁酸钠。培养液中加入的聚戊烯醇和4-羟基丁酸钠协同培养液中其他组分对螺旋藻生长起促进生长的作用，一方面在盐胁迫环境下螺旋藻生长被抑制，其细胞内外具有明显的渗透压差，聚戊烯醇和4-羟基丁酸钠通过亲和力高的羟基渗透进细胞中，降低了细胞膜上的电势差和电稳定性，并降低了盐胁迫下膜脂过氧化物丙二醛的生成量，从而减小细胞膜的渗透性和膜脂过氧化物对细胞膜的损伤，另一方面聚戊烯醇和4-羟基丁酸钠能在外源氧刺激细胞分化时，增加藻蓝蛋白裂合酶的表达量，进而增加螺旋藻中藻蓝蛋白的含量，有利于工业化定向获取藻蓝蛋白，增加螺旋藻的营养价值和药用价值。

对本发明而言，聚戊烯醇提取物为经HPLC分析，纯度为75-95％的聚戊烯醇提取物；聚戊烯醇提取物提取原料为南方红豆杉。从南方红豆杉中所提取得聚戊烯醇为15-21个异戊烯基单元及终端异戊烯醇组成的线性长链化合物，分子中含有许多不饱和双键，终端还含有一个烯醇，具有很高的生物活性，且聚戊烯醇是植物源化合物，易生物降解，且对植物能产生正效应的促进植物生长的作用。

作为优选，聚戊烯醇提取物通过以下步骤制备：取南方红豆杉粉碎针叶用石油醚于80-90℃下提取8-10h后，收集提取液，并用浓度为5％的氢氧化钠甲醇溶液水解除杂，再用丙酮冷析除杂，即得。聚戊稀醇类化合物在植物体内的自然存在形式是以游离态和乙酸酯结合体共同存在的，因此通过水解将聚戊稀醇乙酸酯结合态完全转化为极性较弱的游离态，并将极性成分和可皂化组分转移到极性有机相中并去除，使得提取物纯度提高，更容易被藻类吸收，单位有效利用率提高。

更优选地，水解除杂操作条件为：温度60-80℃，震荡转速为200-250rpm/min，时间为2-3h；冷析除杂操作条件为：温度为0-4℃，时间为6-8h。

更优选地，氢氧化钠甲醇溶液中含有0.05-0.1wt％焦没食子酸和0.03-0.05wt％的肉桂酸。由于水解过程中化合物极性发生变化，震荡容易发生乳化现象而导致分离时间被延长，焦没食子酸和肉桂酸加入水解体系后，破坏了因碱性产生的梯度相容，达到破除乳化的效果，另外两者与聚戊烯醇的醇羟基形成较强的氢键并进入培养液体系中，在外源氧含量升高的情况下，细胞中氧自由基逐渐增多，焦没食子酸和肉桂酸中羟基脱离聚戊烯醇，转而与氧自由基间形成氢键，降低氧自由基活性，避免活性氧对光合膜的氧化伤害，从而降低外源氧对光合效率的不良影响，促进藻体中多糖含量的增加以增加螺旋藻的药用价值。

本发明的有益效果为：

1)本发明利用盐胁迫和氧分压上升的环境对螺旋藻进行培育，能在细胞早期发育环境的条件下进行刺激性培育，使得细胞产生自身防御特性及抗性物质，如超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性升高，从而获得被驯化培育的耐盐耐氧性螺旋藻；

2)本发明通过培养液-光照-盐/氧的联合作用，有效降低盐胁迫和氧胁迫对钝顶螺旋藻生长的抑制作用，驯化出具有更高耐受力的螺旋藻或藻种，使得螺旋藻藻丝螺距和长度显著增加，提高了螺旋藻的生物质密度和过滤采收效率，增加了螺旋藻的生长采收效益；

3)本发明中采用的专用培养液能降低盐胁迫下膜脂过氧化物丙二醛的生成量，减小细胞膜的渗透性和膜脂过氧化物对细胞膜的损伤，降低氧自由基活性，避免活性氧对光合膜的氧化伤害，降低外源氧对光合效率的不良影响，促进藻体中多糖含量的增加，并增加藻蓝蛋白裂合酶的表达量，进而增加螺旋藻中藻蓝蛋白的含量，有利于工业化定向获取藻蓝蛋白，增加螺旋藻的营养价值和药用价值。

本发明采用了上述技术方案提供钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1为钝顶螺旋藻经盐胁迫环境培育后藻丝螺距及长度的变化示意图；

图2为盐胁迫环境下钝顶螺旋藻中超氧化物歧化酶活性变化示意图；

图3为盐胁迫环境下钝顶螺旋藻中过氧化物酶活性变化示意图；

图4为盐胁迫环境下钝顶螺旋藻中过氧化氢酶活性变化示意图；

图5为盐胁迫环境下钝顶螺旋藻中丙二醛含量变化示意图；

图6为钝顶螺旋藻中藻胆蛋白含量变化示意图；

图7为钝顶螺旋藻中多糖含量变化示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：

实施例1：

钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，包括：在盐胁迫环境下，对螺旋藻进行耐盐驯化培育的工序；将驯化培育后的螺旋藻置于氧分压上升的环境中进行细胞分化培育的工序；以及，进一步扩大化培育，并收集所得耐盐耐氧性螺旋藻的工序；上述盐胁迫环境中初始盐浓度为1％，终止浓度为3.5％。该培育方法利用盐胁迫环境和氧分压上升的环境对螺旋藻进行驯化培育，能在细胞早期发育环境的条件下进行刺激性培育，使得细胞产生自身防御特性及抗性物质，进而获得被驯化培育的螺旋藻繁殖产物，该培育方法所得螺旋藻产物较正常环境中培育的螺旋藻的生长状态有显著的有益增长，产物细胞繁殖分化效率提高，藻丝螺距和长度显著增加，以此提高螺旋藻的生物质密度和过滤采收效率，螺旋藻中藻胆蛋白含量、多糖含量及叶绿素a浓度显著增多，β-胡萝卜素和玉米黄质积累量也有所提升，有利于工业化定向获取藻蓝蛋白、多糖等营养物质。

上述氧分压上升的环境是包括在低氧分压和更高的氧分压下进行细胞培养的环境，其中低氧分压环境中氧含量为3.5％，更高的氧分压环境中氧含量为7.0％。优选地，氧分压改变时间点是在培育周期的3/4处。在低氧环境下对螺旋藻细胞进行分化诱导培育，由于外源氧可利用率改变，会刺激细胞分化时器官发生因子表达量的改变，如超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性升高，并产生比在含氧量正常条件下生长时高1.5倍以上水平表达的细胞，因此氧分压上升的环境下对螺旋藻的驯化培育具有显著的有益影响。

上述耐盐驯化培育采用盐浓度递增的培育方法，盐浓度以0.5％的浓度梯度递增，盐浓度增加间隔时间为32h。采用逐步增加盐浓度进行耐盐强化的方法，能减轻瞬间高浓度盐对螺旋藻细胞造成的冲击和毒害，逐级增加盐浓度才能增加螺旋藻的抗盐性和耐盐性，进而驯化出耐盐螺旋藻。

上述驯化培育及扩大化培育用培养液中HCO₃ ^-的浓度为2.5g/L，CO₃ ^2-的浓度为9g/L；分化培育用培养液中HCO₃ ^-的浓度为4.5g/L，CO₃ ^2-的浓度为12g/L。通过调控环境因子，尤其是增加HCO₃ ^-、CO₃ ^2-浓度，能促进螺旋藻丝上HCO₃ ^-转运蛋白表达增强，致使螺旋藻藻丝螺距及长度增加，经过对HCO₃ ^-、CO₃ ^2-浓度调控，分化培育所得螺旋藻丝平均螺距增加到70-80μm，藻丝平均长度增加到750-800μm，显著提高了生物质密度和过滤采收效率，增加了螺旋藻的生长采收效益。

上述驯化培育及扩大化培育的培育条件为：光照：昼12000lx/夜2000lx，光/暗周期为12h/12h，培育周期皆为6d；分化培育的培育条件为：光照：昼25000lx/夜4000lx，光/暗周期为12h/12h，培育周期为7d。优选地，培育中培养液温度控制为：日28℃/夜25℃。通过优化螺旋藻生长培育条件，筛选出在胁迫环境下生长良好的螺旋藻或藻种，促进辅助色素如β-胡萝卜素和玉米黄质以及叶绿素a的积累，能提高光合作用效率及营养物质积累量，对于实际生产具有重要的经济意义。

上述培育用培养液中包括浓度分别为35mg/L的聚戊烯醇提取物和25mg/L的4-羟基丁酸钠。培养液中加入的聚戊烯醇和4-羟基丁酸钠协同培养液中其他组分对螺旋藻生长起促进生长的作用，一方面在盐胁迫环境下螺旋藻生长被抑制，其细胞内外具有明显的渗透压差，聚戊烯醇和4-羟基丁酸钠通过亲和力高的羟基渗透进细胞中，降低了细胞膜上的电势差和电稳定性，并降低了盐胁迫下膜脂过氧化物丙二醛的生成量，从而减小细胞膜的渗透性和膜脂过氧化物对细胞膜的损伤，另一方面聚戊烯醇和4-羟基丁酸钠能在外源氧刺激细胞分化时，增加藻蓝蛋白裂合酶的表达量，进而增加螺旋藻中藻蓝蛋白的含量，有利于工业化定向获取藻蓝蛋白，增加螺旋藻的营养价值和药用价值。

上述聚戊烯醇提取物为经HPLC分析，纯度为80％的聚戊烯醇提取物；聚戊烯醇提取物提取原料为南方红豆杉。从南方红豆杉中所提取得聚戊烯醇为15-21个异戊烯基单元及终端异戊烯醇组成的线性长链化合物，分子中含有许多不饱和双键，终端还含有一个烯醇，具有很高的生物活性，且聚戊烯醇是植物源化合物，易生物降解，且对植物能产生正效应的促进植物生长的作用。

上述聚戊烯醇提取物通过以下步骤制备：取南方红豆杉粉碎针叶装包并置于索氏提取设备中，加入4倍量石油醚，并于70℃下保温12h，然后于80℃下提取9h后，收集提取液，减压浓缩后得浸膏，将浸膏用2倍量石油醚溶解，按料液比1:6加入浓度为5％的氢氧化钠甲醇溶液，于70℃、230rpm/min下震荡水解除杂2.5h，减压浓缩后得浸膏，将浸膏溶于8倍量丙酮中，于0℃下静置除杂6h，减压浓缩，所得浸膏即为聚戊烯醇提取物。聚戊稀醇类化合物在植物体内的自然存在形式是以游离态和乙酸酯结合体共同存在的，因此通过水解将聚戊稀醇乙酸酯结合态完全转化为极性较弱的游离态，并将极性成分和可皂化组分转移到极性有机相中并去除，使得提取物纯度提高，更容易被藻类吸收，单位有效利用率提高。

上述氢氧化钠甲醇溶液中含有0.05wt％焦没食子酸和0.03wt％的肉桂酸。由于水解过程中化合物极性发生变化，震荡容易发生乳化现象而导致分离时间被延长，焦没食子酸和肉桂酸加入水解体系后，破坏了因碱性产生的梯度相容，达到破除乳化的效果，另外两者与聚戊烯醇的醇羟基形成较强的氢键并进入培养液体系中，在外源氧含量升高的情况下，细胞中氧自由基逐渐增多，焦没食子酸和肉桂酸中羟基脱离聚戊烯醇，转而与氧自由基间形成氢键，降低氧自由基活性，避免活性氧对光合膜的氧化伤害，从而降低外源氧对光合效率的不良影响，促进藻体中多糖含量的增加以增加螺旋藻的药用价值。

本发明中培养液基液采用Zarrouk氏培养基，基液中各成分及其浓度为：碳酸氢钠16.8g/L、磷酸氢钾0.5g/L、硝酸钠2.5g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸铁0.01g/L、硫酸钾1.0g/L、一水氯化钙0.04g/L、EDTA0.08g/L，调节pH为8-10。上述基液配制完成后，将基液添加进聚戊烯醇提取物和4-羟基丁酸钠的乳液中，混合均匀后，调节HCO₃ ^-、CO₃ ^2-浓度，即得培养液。聚戊烯醇提取物和4-羟基丁酸钠的乳液通过以下步骤配制：取聚戊烯醇提取物和4-羟基丁酸钠，加入1/2倍量的吐温、2倍量的乙醇和10倍量的水，在超声波破碎仪中进行超声波均质，得到乳液。

实施例2：

1)取南方红豆杉粉碎针叶装包并置于索氏提取设备中，加入5倍量石油醚，并于80℃下保温10h，然后于85℃下提取8.5h后，收集提取液，减压浓缩后得浸膏，将浸膏用2.5倍量石油醚溶解，按料液比1:5加入浓度为5％的氢氧化钠甲醇溶液，于780℃、7250rpm/min下震荡水解除杂2h，减压浓缩后得浸膏，将浸膏溶于6倍量丙酮中，于4℃下静置除杂6.5h，减压浓缩，所得浸膏即为提取物聚戊烯醇，上述氢氧化钠甲醇溶液中含有0.07wt％焦没食子酸和0.05wt％的肉桂酸；

2)取聚戊烯醇提取物和4-羟基丁酸钠，加入1/2倍量的吐温、2倍量的乙醇和10倍量的水，在超声波破碎仪中进行超声波均质，得到乳液；

3)配制Zarrouk氏培养基作为基液，将基液添加进聚戊烯醇提取物和4-羟基丁酸钠的乳液中，混合均匀后，调节HCO₃ ^-、CO₃ ^2-浓度，即得培养液，配制的驯化培育及扩大化培育用培养液中HCO₃ ^-的浓度为2g/L，CO₃ ^2-的浓度为95g/L，分化培育用培养液中HCO₃ ^-的浓度为4g/L，CO₃ ^2-的浓度为11.5g/L；

4)将培养至指数生长期的螺旋藻细胞转入培养液中，调整初始接种密度至OD₅₆₀为0.2，在温度为日30℃/夜27℃、光照：15000lx/夜3000lx、光/暗周期为12h/12h的条件下进行培育，培育周期为7d，培养液中初始盐浓度为1％，以0.5％的浓度梯度递增，盐浓度增加间隔时间为24h，终止浓度为4.5％；

5)将驯化培育后的藻液添加进分化培育的培养液中，在温度为日30℃/夜27℃、光照：昼30000lx/夜5000lx、光/暗周期为12h/12h的条件下进行培育，培育周期为8d，低氧分压环境中氧含量为4.5％，在第6天结束时，调整环境中氧分压，调整后氧含量为6.5％，再进行2d培育即可结束分化培育；

6)将分化培育完成的藻液添加进扩大化培育用培养液中，在温度为日30℃/夜27℃、光照：15000lx/夜3000lx、光/暗周期为12h/12h的条件下进行培育，培育周期为7d，完成培育后，用孔径为40μm的滤布过滤培养液，得到浓缩藻泥，即为耐盐耐氧性螺旋藻。

实施例3：

本实施例与实施例2不同之处在于：步骤1)中水解除杂用氢氧化钠甲醇溶液中未添加焦没食子酸和肉桂酸；

其他步骤与实施例2中一致，制得耐盐耐氧性螺旋藻。

实施例4：

本实施例与实施例2不同之处在于：培养液以Zarrouk氏培养基作为基液，调节HCO₃ ^-、CO₃ ^2-浓度后，即得培养液，即培养液中未添加聚戊烯醇提取物和4-羟基丁酸钠；

其他步骤与实施例2中一致，制得耐盐耐氧性螺旋藻。

实施例5：

本实施例与实施例2不同之处在于：步骤3)培养液配制具体措施为：配制Zarrouk氏培养基作为基液，将基液添加进聚戊烯醇提取物和4-羟基丁酸钠的乳液中，混合均匀，即得培养液，即培养液未调节HCO₃ ^-、CO₃ ^2-浓度；

其他步骤与实施例2中一致，制得耐盐耐氧性螺旋藻。

实施例6：

本实施例与实施例2不同之处在于：

步骤5)分化培育未采用氧分压上升的环境，而是在氧分压稳定的环境中培育，所用氧分压环境中氧含量为5％；

其他步骤与实施例2中一致，制得耐盐性螺旋藻。

试验例1：

钝顶螺旋藻藻丝形态变化试验

试验样品：实施例2、实施例5所制螺旋藻。

试验方法：取实施例中完成培育的螺旋藻，并以正常盐浓度环境下生长的螺旋藻为对比组，然后用显微镜观察样品藻丝形态变化，钝顶螺旋藻藻丝形态测定时，测量5个以上视野，每个视野约60-100条藻丝，并用码照相机拍摄照片，通过Axio Vision图像分析系统对图片进行分析处理。分析及统计结果如附图1所示。

图1为钝顶螺旋藻经盐胁迫环境培育后藻丝螺距及长度的变化示意图。由图可知，实施例2培育的螺旋藻藻丝长度和螺距明显优于其他两组，实施例5和对比组的藻丝长度差异不明显，螺距有显著差异；说明通过调控培养液中HCO₃ ^-、CO₃ ^2-浓度，能促进螺旋藻丝上HCO₃ ^-转运蛋白表达增强，致使螺旋藻藻丝螺距及长度增加，进而提高生物质密度和过滤采收效率，增加螺旋藻的生长采收效益。

试验例2：

钝顶螺旋藻在盐胁迫下氧化损伤及酶活性调控试验

试验样品：实施例2、4及实施例6所制螺旋藻。

试验方法：取实施例中开始进行扩大化培育第0-48h的的螺旋藻，并以正常盐浓度环境下生长的螺旋藻为对比组，进行取样测定。测定指标及方法：1)超氧化物歧化酶活性：用NBT还原法测定；2)过氧化物酶活性：采用愈创木酚法；3)过氧化氢酶活性：5.73ml磷酸盐缓冲溶液+0.2ml酶液，沸水浴10min，然后再于25℃水浴5min后，逐管加入0.07ml H₂O₂反应液，每加完一管后即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下比色，每隔1min读数1次，共读数3次；4)丙二醛含量：硫代巴比妥酸法测定。处理剂统计结果如附图2、3、4、5所示。

图2为盐胁迫环境下钝顶螺旋藻中超氧化物歧化酶活性变化示意图，图3为盐胁迫环境下钝顶螺旋藻中过氧化物酶活性变化示意图，图4为盐胁迫环境下钝顶螺旋藻中过氧化氢酶活性变化示意图，图5为盐胁迫环境下钝顶螺旋藻中丙二醛含量变化示意图。

在盐胁迫环境下，第0-12h藻内部氧自由基逐渐增多，藻类自身防御特性下，氧化酶总体升高，第12-24h活性氧自由基被清除以致含量减少，酶活性降低，由于盐胁迫持续存在，因此24h以后活性氧自由基积累量不断增加，需要氧化酶进行清除和抵抗，酶活性再次增强，但存在程度差异化。综合图2、3、4可知，盐胁迫环境下钝顶螺旋藻中超氧化物歧化酶、过氧化物酶及过氧化氢酶的活性总体呈升高趋势，但随着胁迫时间的增加，对比组升高及波动幅度最缓，对氧自由基的清除效果及抵抗效果最差，容易造成严重的氧化损伤；实施例2和6相比，酶活性随着氧自由基的积累量发生较大的波动，但两者存在显著性差异，实施例2的活性更高，且对盐胁迫下的氧化损伤相应敏感程度更快，对细胞的保护作用更好。

由图5可知，随着盐胁迫进行，丙二醛含量总体呈上升趋势，但明显对比组上升较快，且处于持续上升状态，实施例4上升幅度较对比组稍缓，实施例2与其他两组则差异显著，前期呈上升趋势，但后期趋势明显缓慢，说明丙二醛的生成被抑制，生成量和积累量减少，进而说明实施例4所用培养液能降低盐胁迫中膜脂过氧化物对细胞膜的氧化损伤。

试验例3：

钝顶螺旋藻藻胆蛋白含量的影响试验

试验样品：实施例1、2及4所制螺旋藻。

试验方法：取实施例中完成培育的新鲜的螺旋藻藻体，并以正常盐浓度环境下生长的螺旋藻为对比组，并放入预冷的研钵，分批加入10mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH＝6.8)，冰浴下研磨成匀浆。将匀浆液在离心机中5000r/min离心10min(2-4℃)，所得上清液为样品提取液。吸取样品上清液，测定其在455、564、592、595、618、645nm处的吸光值。藻胆蛋白含量计算公式为：

藻红蛋白含量(％)＝[(A564－A592)－(A455－A592)×0.2]×0.12；

藻蓝蛋白含量(％)＝[(A618－A645)－(A595－A645)×0.15]×0.15。处理剂统计结果如附图6所示。

图6为钝顶螺旋藻中藻胆蛋白含量变化示意图。由图可知，各组间的钝顶螺旋藻藻红蛋白含量没有显著差异，而藻蓝蛋白含量差异显著，实施例1、2及实施例4较对比组有明显增长，且实施例1、2增长幅度更优于实施例4，说明实施例1和2所用培养液能增加螺旋藻中藻蓝蛋白的含量，有利于工业化定向获取藻蓝蛋白，增加螺旋藻的营养价值和药用价值。

试验例4：

钝顶螺旋藻多糖含量的影响试验

试验样品：实施例1、2及3所制螺旋藻。

试验方法：取实施例中完成培育的新鲜的螺旋藻藻体，并以正常盐浓度环境下生长的螺旋藻为对比组，并采用蒽酮硫酸法测定藻体中的多糖含量，处理及统计结果如图7所示。

图7为钝顶螺旋藻中多糖含量变化示意图。由图可知，实施例3与对比组的多糖含量没有显著差异，但较实施例1和2差异明显，实施例1和2藻体内多糖含量明显高于其它组，说明实施例1和2的培育方法能降低外源环境胁迫下对光合作用的不良影响，促进藻体中多糖含量的增加以增加螺旋藻的药用价值。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：包括，

在所述盐胁迫环境下，对螺旋藻进行耐盐驯化培育的工序；

将所述驯化培育后的螺旋藻置于氧分压上升的环境中进行细胞分化培育的工序；以及，

进一步扩大化培育，并收集所得耐盐耐氧性螺旋藻的工序；

所述盐胁迫环境中初始盐浓度为0.1-1％，终止浓度为3.5-5％。

2.根据权利要求1所述的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：所述氧分压上升的环境是包括在低氧分压和更高的氧分压下进行细胞培养的环境；所述低氧分压环境中氧含量为0.1-5％，更高的氧分压环境中氧含量为5.1-7.5％。

3.根据权利要求1所述的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：所述耐盐驯化培育采用盐浓度递增的培育方法，所述盐浓度以0.5％的浓度梯度递增，盐浓度增加间隔时间为24-36h。

4.根据权利要求1所述的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：所述驯化培育及扩大化培育用培养液中HCO₃ ^-的浓度为2-3g/L，CO₃ ^2-的浓度为9-10.5g/L；所述分化培育用培养液中HCO₃ ^-的浓度为3.5-4.5g/L，CO₃ ^2-的浓度为11-12g/L。

5.根据权利要求1所述的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：所述驯化培育及扩大化培育的培育条件为：光照：昼8000-15000lx/夜0-5000lx，光/暗周期为12h/12h，培育周期皆为5-7d；所述分化培育的培育条件为：光照：昼25000-32000lx/夜0-8000lx，光/暗周期为12h/12h，培育周期为7-10d。

6.根据权利要求1所述的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：所述培育用培养液中包括浓度分别为20-50mg/L的聚戊烯醇提取物和10-30mg/L的4-羟基丁酸钠。

7.根据权利要求6所述的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：所述聚戊烯醇提取物为经HPLC分析，纯度为75-95％的聚戊烯醇提取物；所述聚戊烯醇提取物提取原料为南方红豆杉。

8.根据权利要求6所述的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：所述聚戊烯醇提取物通过以下步骤制备：取南方红豆杉粉碎针叶用石油醚于80-90℃下提取8-10h后，收集提取液，并用浓度为5％的氢氧化钠甲醇溶液水解除杂，再用丙酮冷析除杂，即得。

9.根据权利要求8所述的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：所述水解除杂操作条件为：温度为60-80℃，震荡转速为200-250rpm/min，时间为2-3h；所述冷析除杂操作条件为：温度为0-4℃，时间为6-8h。

10.根据权利要求8所述的钝顶螺旋藻在盐胁迫环境下的培育方法，其特征在于：所述氢氧化钠甲醇溶液中含有0.05-0.1wt％焦没食子酸和0.03-0.05wt％的肉桂酸。