KR20210021376A - 두날리엘라 살리나의 수성 추출물을 수득하는 방법 및 이의 화장품 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 a) 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계; b) 글루코스를 단계 a)에서 수득된 혼합물에 첨가하는 단계; c) 사해 염을 첨가하는 단계; d) 사해 염을 단계 b)에서 수득된 혼합물에 완전히 용해시킨 후, pH가 5 내지 8인 수득된 배양 매질에 미세조류 두날리엘라 살리나를 첨가하는 단계; e) 단계 d)에서 수득된 혼합물을 어둠 및 실온에서 12시간 이상의 기간 동안 적당히 교반하여 미세조류 두날리엘라 살리나를 발효시키는 단계; f) 단계 e)에서 수득된 발효된 두날리엘라 살리나 혼합물을 분쇄하고 이어서 여과하여 가용성 물질 및 불용성 물질을 분리하는 단계; g) 사해 염이 첨가된 가용성 수성 원료 추출물을 회수하는 단계; h) 0.2 μm 이하의 공극률 임계값으로 멸균 여과를 수행하는 단계; 및 i) pH가 3.5 내지 4.5인 두날리엘라 살리나의 발효된 수성 추출물을 수득하는 단계에 따라 미세조류 두날리엘라 살리나를 효모 추출물, 당 및 염을 포함하는 배양 매질에서 빛 없이 배양하여 미세조류 두날리엘라 살리나의 수성 추출물을 수득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 두날리엘라 살리나의 수성 추출물, 본 발명에 따른 이러한 추출물을 포함하는 조성물, 및 피부 관리, 두피 관리 또는 피부 부속기관 관리를 위한 본 발명에 따른 조성물의 화장품 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 화장품 분야에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 구체적으로 미세조류 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)의 수성 추출물을 수득하는 방법, 이러한 방법에 의해 수득가능한 추출물 및 이러한 추출물을 포함하는 화장품 조성물, 및 피부 관리, 두피 관리 및 피부 부속기관 관리를 위한 이의 화장품 용도에 관한 것이다.
피부는 신체의 전체 표면을 덮고 보호, 민감, 면역, 대사 또는 체온조절 기능을 수행하는 복수의 층(진피, 증식 층 및 각질 층)으로 구성된 중요한 기관이다. 피부는 신체와 외부 환경 사이의 계면이다. 피부는 외부의 공격으로부터 신체를 보호할 뿐만 아니라 물의 확산을 제한하여 탈수와 싸우는 것을 목표로 한다. 이러한 피부 장벽은 주로 표피에 의해 제공된다. 다른 기관과 마찬가지로 피부도 노화된다.
피부의 외관은 내부(고유 노화, 질병, 및 호르몬 변화, 예컨대 임신) 또는 외부(환경 요인, 예컨대 오염, 햇빛, 병원체, 온도 변화 등)의 변화에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변화에 따라 주름과 잔주름, 색소 결함, 피부의 건조 또는 심지어 탈수, 표피의 얇아짐, 탄력, 흠, 검버섯 등이 나타날 수 있다. 이러한 모든 변화는 피부뿐만 아니라 손발톱 및 모발과 같은 각질성 부속기관에도 영향을 미친다.
반면에, 용어 "미세조류(또는 미세생물)"는 용어는 미세한 조류를 지칭한다. 두날리엘라 살리나는 두날리엘라를 비롯한 약 30개의 속을 포함하는 클로로파이세아에(Chlorophyceae) 과에 속하는 녹색, 단세포, 이중-편모 및 호염성 미세조류의 일종이다. 두날리엘라 속에는 약 10개의 종이 있고, 가장 공지되어 있고 연구된 종은 두날리엘라 터티올렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 메디아(Dunaliella media), 두날리엘라 유클로라(Dunaliella euchlora), 두날리엘라 미누타(Dunaliella minuta), 두날리엘라 파바(Dunaliella parva) 및 두날리엘라 비리디스(Dunaliella viridis)이다. 상기 언급된 모든 종이 두날리엘라 살리나만큼 높은 염 농도를 견디는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다. 일부 두날리엘라 종은 과염수 환경에서 보고된 적이 없는 해양 유기체이다.
따라서, 두날리엘라 살리나와 같이 높은 염 농도를 갖는 조건에서 생존할 수 있는 유기체는 거의 없다. 두날리엘라 종은 실제로 0.2 내지 약 35%의 다양한 농도의 NaCl을 견딜 수 있다. 또한, 사해(Dead Sea)에서 두날리엘라 종, 구체적으로 두날리엘라 살리나가 주로 발견된다(문헌[Volacani BE, 1944]). 사해는 시리아-아프리카 단층 선을 따라 놓여 있다. 사해는 3백만년 전에 시작된 지질 현상의 결과이다. 거대한 자연적 격변 동안, 여러 층의 미네랄이 풍부한 토양이 표면으로 나왔고 샘물이 솟아 나와 계곡과 해수면 아래의 호수가 생겼다. 수천년 동안 계속 된 증발은 현재 사해라고 불리는 호수의 물에 다른 어떤 바다 또는 대양에서도 발견되지 않는 수준의 염 및 미네랄의 농도를 야기하였다. 이에 따라, 사해의 물은, 예를 들어 지중해보다 3배 초과의 나트륨, 30배 초과의 마그네슘, 16배 초과의 칼륨, 36배 초과의 칼슘을 함유한다. 미세조류 두날리엘라 살리나는 염분이 매우 중요한 환경에서 살 수 있는 소수의 종 중 하나이다. 두날리엘라 살리나는 또한 pH 1 내지 pH 11의 매우 높은 pH 내성을 가지고, 0℃ 미만 및 38℃ 초과의 온도를 견딜 수 있다.
두날리엘라 세포가 단단한 세포벽을 갖지 않으므로, 이들은 다량의 글리세롤을 생성하여 높은 염 농도에 대처하고 삼투압으로부터 보호한다. 따라서, 글리세롤은 효소를 불활성화 및 억제로부터 특별히 보호하는 "상용성 용질"로 작용한다(문헌[Brown and Borowitzka, 1979]). 또한, 때때로 강렬한 빛에 노출되어도 생존하기 위해, 이러한 미세조류는 카로티노이드를 합성한다. 이러한 다량의 카로티노이드는 또한 항산화 활성을 제공한다. 두날리엘라 살리나는 1838년에 마이클 펠릭스 두날(Michael Felix Dunal)에 의해 프랑스 남부의 염 증발 분지에서 처음 발견되었고, 1905년 테오도레스코(Teodoresco)에 의해 발견된 후 명명되었다. 이러한 발견 후, 두날리엘라 살리나는 염 적응 연구의 모델 유기체가 되었다. 삼투 평형을 달성하기 위해 유기 화합물과 호환되는 용질 개념의 확립은 실제로 두날리엘라 종에 대한 연구에 크게 기초한다.
두날리엘라 종의 세포 형상은 타원형, 난형, 원통형, 서양배형 및 방추형에서 거의 구형까지 다양하다. 소정 종의 세포는 환경 조건에 따라 형상이 변할 수 있고, 종종 불리한 조건 하에 구형이 된다.
세포 크기는 성장 조건 및 광도에 따라 어느 정도 변할 수 있다(문헌[Marano, 1976]; 문헌[Riisgard, 1981]; 문헌[Einsphar et al., 1988]).
미세조류는 전세계적으로 수천년 동안 소비되어 왔다. 예를 들어, 아즈텍 시대에 멕시코에서 다양한 종의 미세조류가 소비된 흔적이 발견되었다. 유럽 및 선진국은 영양 실조와 싸우기 위한 식품 보충제로서, 및 양식업을 위해 미세조류를 사용한다. 이러한 미세조류, 구체적으로 두날리엘라 살리나는 세계에서 이러한 미세조류의 주요 용도를 나타내는 바이오연료로 지칭되는 대체 연료 솔루션에 특히 사용된다. 이러한 경우, 이들은 "레이스웨이(raceway)" 연못 또는 폐쇄된 환경, 광생물반응기에서 야외에서 배양된다. 실제로, 두날리엘라 종, 구체적으로 두날리엘라 살리나는 다량의 지질인 β-카로틴을 점적 형태로 생성하고 축적하는 능력으로 공지되어 있고, 이에 따라 세포는 녹색이 아닌 적색-주황색으로 보인다. 두날리엘라 과에 의해 생성된 이러한 분자는 바이오연료 생산, 화장품 또는 기능식품과 같은 다양한 분야에서 적용례를 갖는다.
오늘날, 미세조류, 구체적으로 두날리엘라 살리나를 배양하는 가장 일반적인 방법은 개방된 연못에서 독립영양 조건 하에 배양하는 것이다. 이러한 유형의 배양에서, 미세조류는 빛 에너지를 포착하고, CO2를 탄소 공급원으로 사용하여 광합성을 수행한다. 이때, 배양 매질은 미세조류가 번식할 수 있는 미네랄 요소를 충분히 포함한다. 그러나, 광-독립영양 배양은 낮은 수율을 갖는다. 바이오매스 생산은 배양 중 바이오매스 증가로 인한 자체-음영으로 인해 실제로 심각하게 제한되어, 성장이 끝날 때까지 빛의 이용가능성을 차단한다. 또한, 이러한 유형의 배양은 높은 비용이 필요하다.
두날리엘라와 같은 일부 미세조류는 혼합영양 조건에서도 성장할 수 있다. 이러한 경우, 유기 탄소 공급원과 빛 에너지를 둘 다 사용한다.
마지막으로, 두날리엘라는 소위 종속영양 배양 조건 하에서도 성장할 수 있다: 미세조류는 어둠에서, 폐쇄형 또는 개방형 생물반응기에서 배양된다. 이때, 이들은 에탄올, 아세테이트 및 글루코스와 같은 유기 탄소의 공급원을 가져야 한다.
이러한 모든 배양 방법은 과학 문헌에 널리 기술된다(문헌[Bumbak et al., 2011]).
생물반응기 생산의 이점은 잘 제어할 수 있다는 것이다. 실제로, 미세조류의 성장에 필요한 모든 배양 매개변수, pH, 온도, 배양 매질, 당 수준 또는 기타 분자를 제어하는 것이 가능한다. 단점은 생물반응기 배양이 이러한 유형의 배양에 필요한 모든 장비를 확보하는 데 드는 비용을 나타낸다는 것이다.
일반적으로, 두날리엘라와 같은 미세조류의 종속영양 조건 하의 배양 매질은 빛이 없는 상태에서 성장에 필수적인 분자를 함유하여야 한다. 사용되는 배양 매질은 종종 두날리엘라의 배양에 널리 사용되는 존슨(Johnson)의 변형 매질(문헌[Johnson et al., 1968]; 문헌[Borowitzka, 1988])에서 발견되는 바와 같이, 염, 거대-영양소 및 미량-영양소, 비타민, 미네랄 염을 함유하는 합성 배양 매질이다. 이러한 환경은 탄수화물의 제공에 의해 두날리엘라의 성장을 보장하여야 한다. 두날리엘라 미세조류는 또한 성장을 위한 질소의 공급원이 필요하고, 이는 니트레이트, 암모니아, 우레아의 형태로 제공되거나, 박테리아, 효모의 배양에 자주 사용되는 효모 추출물을 사용하여 제공될 수 있다. 인은 또한 에너지 전달 및 핵산 및 인지질의 합성과 같은 여러 세포 과정에 관여하기 때문에 미세조류의 성장을 위한 주요 영양소이다. 이러한 인은 주로 무기 형태(H2PO4 - 또는 HPO4 2-)로 동화된다(문헌[Barsanti and Gualtieri, 2006]).
본 발명자들은, 예를 들어, 해수요법에 사용하기 위해 농축된 해수에서 두날리엘라를 배양하는 방법을 기술하는 일본 출원공보 제JP2003325165호를 알고 있다. 두날리엘라는 분말 또는 페이스트 형태로 사용될 수 있다.
본 발명자들은 또한 해수(80%), 글루코스(1.8%) 및 효모 추출물(0.05%)을 포함하는 미세조류 배양 매질을 개시하는 문헌[Gladue et al., "Microalgal feeds for aquaculture", Journal of applied phycol, Kluwer, Dordrecht, NL, vol.6 no.2, 1 April 1994, pages 131-14]을 알고 있다. 두날리엘라 살리나는 pH 7.5 내지 8로 24시간 이상의 기간 동안 적당한 교반과 함께 빛이 없는 이러한 배양 매질에서 성장한다.
본 발명자들은 또한 목탄 및 NaOH를 첨가하여 천연 해수에서 두날리엘라를 성장시키는 방법을 기술하는 국제 공개공보 제WO2013/058431호를 알고 있다.
두날리엘라 살리나의 성장 및 β-카로틴의 생산을 향상시키기 위해 질소 공급원(KNO3, NH4NO, CO(NH2)2, (NH4)2CO3, NH4NO3, NaNO3), 인 및/또는 칼륨의 공급원(KH2PO4, KNO3, Na3PO4), 무기 탄소의 공급원(NaHCO3), 염(NaCl 또는 해수) 및 임의적으로 비타민 또는 이온 화합물을 포함하는 매질에서 두날리엘라 살리나를 성장시키는 상이한 방식을 기술하는 특허 문헌(예컨대, 중국 출원공보 제CN102851214호, 제CN102936569호, 제CN104988065호, 대한민국 출원공보 제KR2006-000307호, 또는 중국 출원공보 제CN1923994호)이 공지되어 있다.
구체적으로, 6 내지 8의 pH를 갖고 NaH2PO4 및 CH4N2O를 포함하는 배양 매질에서 10 내지 35℃의 온도에서 빛에서 염수 중 두날리엘라 살리나 분말로부터 2 내지 3주 동안 두날리엘라 살리나를 배양하는 것을 기술하는 중국 출원공보 제CN1446904호가 공지되어 있다. 이러한 조류는 화장품 또는 치료적 관리 및 유전공학 목적으로 사용될 수 있다.
따라서, 두날리엘라 살리나는 구체적으로, 항산화 활성에 대해 공지되어 있고 비타민 A의 합성에 필수적인, 화장품에 함유된 β-카로틴을 부분적으로 사용하는 화장품에서 사용되는 것으로 공지되어 있다. β-카로틴은 태양의 유해한 광선으로부터 피부를 보호하고, 피부에서 비타민 A로 전환되어 피부의 재생을 허용한다. 두날리엘라 살리나는 또한 많은 아미노산(글리신과 알라닌 포함), 및 비타민 E와 B가 풍부한 필수 지방산을 함유한다. 이러한 요소는 피부 노화와의 싸움에서 기본이다. 두날리엘라 살리나는 또한 중요한 수분 흡수 및 유지 특성을 갖는 다량의 글리세롤을 함유한다.
또한, 피부 치료용으로 시판 중인 노화방지 화장품에도 불구하고, 소위 "비천연" 및 화학적으로 합성된 제품은 환경 및 사람에게 위험하다고 인식될 수 있다. 반면에, 천연 제품은 일반적으로 더 양호하게 인식된다.
식물 또는 조류로부터 추출된 많은 천연 제품은 피부에 유익한 효과를 줄 수 있는 식물화합물(phytocompound)을 함유하는 것으로 공지되어 있지만, 활성 성분으로서 천연 성분을 사용하여, 피부 및 모발에 대한 노화방지, 보습 효과를 갖는, 국소적으로 적용되는 신규하고 효과적인 화장품 조성물에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명에서 기술되는 두날리엘라 살리나의 추출물은 이미 시판 중이고 합성 배양 매질을 사용하는 다른 추출물과는 달리, 완전 천연 배양 매질의 존재 하에 종속영양 조건 하에서 수행된 두날리엘라 살리나의 배양물로부터 수득되는 장점을 갖는다. 종속영양 배양의 이점은 빛이 없는 상태에서 두날리엘라 살리나의 배양을 수행할 수 있게 하여, 미세조류와 같은 미생물의 배양 전용 장치 없이도 배양 방식을 대규모로 더욱 용이하게 적용할 수 있다.
상기 기재내용에 비추어 볼 때, 본 발명이 해결하려는 과제는 두날리엘라 살리나를 배양하여 피부 관리에 유익한 화합물이 풍부한 추출물을 수득하는 신규한 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 이러한 천연 추출물은 개선된 노화방지 및 보습 효과를 갖는다.
이러한 과제의 해결 수단은 첫 번째로, a) 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계; b) 글루코스를 단계 a)에서 수득된 혼합물에 첨가하는 단계; c) 사해 염을 첨가하는 단계; d) 사해 염을 단계 b)에서 수득된 혼합물에 완전히 용해시킨 후, pH가 5 내지 8인 수득된 배양 매질에 미세조류 두날리엘라 살리나를 첨가하는 단계; e) 단계 d)에서 수득된 혼합물을 어둠 및 실온에서 12시간 이상의 기간 동안 적당히 교반하여 미세조류 두날리엘라 살리나를 발효시키는 단계; f) 단계 e)에서 수득된 발효된 두날리엘라 살리나 혼합물을 분쇄하고 이어서 여과하여 가용성 물질 및 불용성 물질을 분리하는 단계; g) 사해 염 또는 방부제, 예컨대 나트륨 벤조에이트가 첨가된 가용성 수성 원료 추출물을 회수하는 단계; h) 0.2 μm 이하의 공극률 임계값으로 멸균 여과를 수행하는 단계; 및 i) pH가 3.5 내지 4.5인 두날리엘라 살리나의 발효된 수성 추출물을 수득하는 단계에 따라 미세조류 두날리엘라 살리나를 효모 추출물, 당 및 염을 포함하는 배양 매질에서 빛 없이 배양하여 미세조류 두날리엘라 살리나의 수성 추출물을 수득하는 방법이다.
두 번째 목적은 추출물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 2 g/kg의 단백질 단편, 0.3 내지 3 g/kg의 당, 0.5 내지 3 g/kg의 아미노산 및 20 내지 150 mg/kg의 페놀 화합물을 포함하는, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 두날리엘라 살리나의 수성 추출물이다.
세 번째 목적은 활성 노화방지제로서 효과량의 본 발명에 따른 두날리엘라 살리나의 수성 추출물 및 생리학적으로 허용가능한 매질을 포함하는 조성물이다.
마지막으로, 본 발명의 마지막 목적은 피부 관리, 두피 관리 및 피부 부속기관 관리를 위한 본 발명에 따른 조성물의 화장품 용도이다.
본 발명자들은 종속영양 배양 시스템을 기반으로 두날리엘라 살리나를 성장시키는 신규한 방법을 개발하였고, 이때 두날리엘라 살리나는 발효에 의해 유익한 화합물을 생산한다.
본 발명의 이점 중 하나는 미세조류 두날리엘라 살리나가 사해로부터의 효모 추출물, 당 및 염으로 이루어진 특정한 완전 천연 배양 매질에서 종속영양 조건 하에서 살아있는 채로 사용되고 배양된다는 것이다. 미세조류의 성장에 사용되는 모든 요소는 천연적이고 배양 매질에 합성 분자가 첨가되지 않는다. 영양 매질이 미세조류의 성장에 필요한 모든 화합물을 함유하므로 발효가 발생한다. 다양한 화합물은 미세조류 두날리엘라 살리나에 의해 대사되어 성장을 허용한다. 실제로, 효모 추출물의 사용은 미세조류의 성장에 필요한 질소 공급원을 제공하고, 글루코스의 첨가는 미세조류의 성장에 또한 필요한 탄소 공급원을 제공한다. 또한, 두날리엘라 살리나가 염수 환경에서 작동하여야 한다는 사실은 모든 필수 미네랄을 제공하기 위해 사해 염을 첨가함으로써 가능하다. 사해 염을 사용하는 이점은 화장품에서 오랫동안 인식되어 온 피부에 유익한 특성으로부터 유래한다. 올리고-미네랄이 매우 풍부한 물은 피부에 진정 효과 및 유익한 특성을 부여한다. 실제로, 사해의 물의 조성은 독특하고, 대양을 비롯한 세계의 다른 어떤 염수보다 높은 농도의 마그네슘, 칼륨, 실리카, 나트륨 및 칼슘을 함유한다.
본 발명에 따른 이러한 배양 조건 하의 미세조류 두날리엘라 살리나의 발효는 세포 바이오매스의 추출 후, 미세조류 및 이의 배양 매질로부터 다양한 유익한 화합물이 매우 풍부한 최종 추출물을 수득할 수 있도록 한다. 후자는 천연 분자로만 구성되기 때문에 추출 중에 보존될 수 있다. 건조된 두날리엘라 살리나로만 만든 추출물과 달리, 두날리엘라 살리나의 신규한 추출물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따라 발효된 두날리엘라 살리나의 추출물은 아미노산, 단당류, 단백질 및 펩티드와 같은 유익한 화합물이 풍부하다. 사해 염의 미네랄 염과 관련하여 피부에 유익한 효과로 공지된 이러한 모든 수용성 분자는 두날리엘라 살리나의 발효되지 않은 추출물에 비해 본 발명에 따른 추출물의 개선된 효능에 기여한다.
본 명세서에서, 달리 특정되지 않는 한, 범위가 주어지면 범위의 상한치 및 하한치를 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명 및 이로부터 유래하는 이점은 첨부된 도면과 관련하여 작성된 하기 명세서 및 비제한적인 구현 모드를 읽음으로써 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 본 발명에 따른 실시예 1의 방법에 따른 배양물에서 두날리엘라 살리나의 성장을 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 1의 방법에 따른 배양물에서 두날리엘라 살리나의 헥소스의 소비를 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1의 방법에 따른 배양 매질에 함유된 아미노산(단백질)의 농도에 대한 두날리엘라 살리나의 존재의 효과를 도시한다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 1의 방법에 의해 수득된 발효된 두날리엘라 살리나의 수성 추출물의 생체외 피부에 대한 수분의 이동 및 장벽 기능에 대한 평가를 도시한다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 1의 방법에 따른 배양물에서 두날리엘라 살리나의 성장을 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 1의 방법에 따른 배양물에서 두날리엘라 살리나의 헥소스의 소비를 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1의 방법에 따른 배양 매질에 함유된 아미노산(단백질)의 농도에 대한 두날리엘라 살리나의 존재의 효과를 도시한다.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 1의 방법에 의해 수득된 발효된 두날리엘라 살리나의 수성 추출물의 생체외 피부에 대한 수분의 이동 및 장벽 기능에 대한 평가를 도시한다.
양태의 기술
본 발명은 효모 추출물, 당 및 염을 포함하는 매질에서 빛이 없는 상태에서 종속영양 배양 조건 하에 배양된 살아있는 두날리엘라 살리나로부터 발효된 두날리엘라 살리나의 수성 추출물을 수득하는 방법에 관한 것이다. 배양은 개방된 환경에서 유리하게 수행된다.
두날리엘라는 두날리엘라 종의 모든 미세조류를 의미하는 것으로 이해된다. 두날리엘라는 독립영양(빛으로부터의 에너지), 종속영양(탄소 유입으로부터의 에너지), 혼합영양(빛 및 탄소의 혼합)의 다양한 유형의 환경에서 성장할 수 있는 미세조류이다.
바람직하게는, 추출물은 두날리엘라 살리나의 발효로부터 수득된다.
발효는 구체적으로 유기 탄소의 공급원을 함유하는 본 발명에 따른 특정 영양 매질에서의 미세조류의 배양을 의미하는 것으로 이해되고, 이때 미세조류는 성장하기 위해 대사될 것이다.
더욱 구체적으로, 종속영양 조건 하의 미세조류 두날리엘라 살리나의 발효는 미세조류의 성장에 필요한 모든 영양소를 함유하고 탄소 공급원, 구체적으로 글루코스의 기여가 빛이 없는 환경에서 미세조류의 증식을 허용하는 매질에서의 배양을 의미한다(문헌[Barclay et al.1994, Heterotrophic production of long chain omega-3 fatty acids utilizing algae and algae-like microorganisms]; 문헌[Garcia et al.2013, A method for biodiesel production involving the heterotrophic fermentation of Chlorella protothecoides with glycerol as the carbon source]).
본 발명에 따른 미세조류 두날리엘라 살리나의 수성 추출물은 a) 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계; b) 글루코스를 단계 a)에서 수득된 혼합물에 첨가하는 단계; c) 사해 염을 첨가하는 단계; d) 사해 염을 단계 b)에서 수득된 혼합물에 완전히 용해시킨 후, pH가 5 내지 8인 수득된 배양 매질에 미세조류 두날리엘라 살리나를 첨가하는 단계; e) 단계 d)에서 수득된 혼합물을 어둠 및 실온에서 12시간 이상의 기간 동안 적당히 교반하여 미세조류 두날리엘라 살리나를 발효시키는 단계; f) 단계 e)에서 수득된 발효된 두날리엘라 살리나 혼합물을 분쇄하고 이어서 여과하여 가용성 물질 및 불용성 물질을 분리하는 단계; g) 사해 염 또는 방부제, 예컨대 나트륨 벤조에이트가 첨가된 가용성 수성 원료 추출물을 회수하는 단계; h) 0.2 μm 이하의 공극률 임계값으로 멸균 여과를 수행하는 단계; 및 i) pH가 3.5 내지 4.5인 두날리엘라 살리나의 발효된 수성 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로부터 수득된다.
두날리엘라 살리나는 사해에서 살 수 있는 소수의 살아있는 종 중 하나이다. 실제로, 해수의 평균 염도는 2 내지 4%이지만, 사해의 염도는 약 27.5%(또는 1 L 당 275 g)이다.
사해는 염수 호수이다. 이의 물은 미네랄 및 미량 원소가 매우 풍부하고, 많은 특성을 갖는다. 사해의 천연 염은 칼슘, 칼륨 및 마그네슘을 비롯한 26개의 필수 미네랄을 갖는다. 사해의 천연 염은 더욱 구체적으로 평균적으로 칼륨(120,000 mg/L), 마그네슘(85,000 mg/L), 염소(38,000 mg/L), 나트륨(23,000 mg/L), 칼슘(22,000 mg/L), 브롬(5,600 mg/L), 카본에이트, 크롬, 인, 철 등을 함유한다. 다양한 필수 미네랄이 풍부하므로, 사해 염은 화장품에 널리 사용되고, 구체적으로 피부에 대한 이의 유리한 특성으로 인정받는다. 이것은 피부에 대한 살균 및 회복 작용을 갖는다(문헌[Proksch et al., Int J Dermatol. 2005; 44 (2): 151-7]).
함유된 칼슘은 세포 교환을 촉진한다.
마그네슘은 노화 과정을 늦추고 근육을 이완시키는 데 도움을 준다. 또한, 관절을 완화시킨다. 이것은 자연스러운 안티-스트레스로 간주된다.
칼륨은 피부 수화 균형을 유지하는 데 도움을 준다. 따라서, 물 균형을 회복하는 데 도움을 준다.
본 발명에 따른 방법의 첫 번째 단계 a)에서, 예를 들어 분말 형태의 효모 추출물은, 바람직하게는 0.1 내지 2% w/w, 더욱 바람직하게는 0.2% w/w의 효모 추출물/물의 비로 물에 용해된다.
사용되는 물은 증류수, 탈염수, 또는 미네랄 염 및/또는 미량 원소가 풍부한 물, 바람직하게는 증류수이다.
바람직하게는, 효모 추출물은 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)의 추출물이다.
효모 추출물은 분말 또는 신선한 효모 추출물의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 효모 추출물은 분말 형태이다.
이어서, 단계 b)에서, 글루코스가 단계 a)에서 수득된 혼합물에 첨가된다.
글루코스 농도는 바람직하게는 0.1 내지 4%, 더욱 바람직하게는 0.2%이다. 이러한 농도는 미세조류 두날리엘라 살리나의 발효 수율을 최적화하기 위해 선택된다.
단계 c)에서, 일단 글루코스 및 효모 추출물이 용해되면, 바람직하게는 1 내지 5%, 더욱 바람직하게는 2.6%의 사해 염이 첨가되어 미세조류의 발달에 필수적인 모든 미네랄 염을 미세조류에 제공하여, 미세조류의 발달에 필수적인 물의 염도를 수득하고, 혼합물의 pH는 5 내지 8이어야 한다.
예를 들어, pH는 염산(HCl)의 용액 또는 시트르산 또는 락트산과 같은 화장품 용도와 상용성인 임의의 pH-조정 산을 첨가함으로써 조정된다.
이러한 혼합물은 미세조류를 수용하기 위한 최적의 배양 매질을 구성하고 이의 발달, 성장 및 세포 분열에 필요한 모든 영양소를 제공한다.
단계 d)에서, 미세조류 두날리엘라 살리나는 pH 5 내지 8의 이러한 가용성 영양 용액에 첨가된다.
본 발명에 따른 방법의 유리한 양태에 따라서, 바람직하게는 0.5 내지 10%, 더욱 바람직하게는 1 내지 5%, 더욱 더 바람직하게는 2%의 두날리엘라 살리나 접종물이 배양 매질에 첨가된다.
단계 e)에서, 단계 d)에서 수득된 혼합물은 12시간 이상의 기간 동안 어둠 및 실온에서 적당한 교반 하에 유지되어 미세조류 두날리엘라 살리나를 발효시킨다.
발효는 두날리엘라 살리나가 효모 추출물, 글루코스 및 사해 염을 함유하는 본 발명에 따른 특정 영양 매질에서, 실온의 물 또는 35℃의 최대 온도까지 가열된 물에서 12시간 이상 동안, 유리하게는 개방형 매질에서 배양될 때 수행된다.
단계 f)에서, 단계 e)에서 수득된 발효된 두날리엘라 살리나 혼합물이 분쇄되고, 이어서 여과되어 가용성 및 불용성 물질이 분리되어, 사해 염 또는 방부제, 예컨대 나트륨 벤조에이트가 첨가된 가용성 수성 원료 추출물이 단계 g)에서 회수된다.
사해 염의 첨가는 방부제로서 작용한다.
단계 h)에서, 0.2 μm 이하의 공극률 임계값을 갖는 멸균 여과가 수행된다.
마지막으로, 단계 i)에서, pH가 3.5 내지 4.5, 바람직하게는 3.5 내지 4.0이고, 더욱 바람직하게는 pH가 4.0인, 두날리엘라 살리나의 발효된 수성 추출물이 수득된다.
바람직하게는, 단계 d) 및 i)에서, pH는 염산(HCl) 또는 나트륨 하이드록사이드(NaOH)의 용액을 첨가함으로써 제어되고 가능하게 재조정된다.
본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 두날리엘라 살리나의 수성 추출물은 구체적으로 아미노산, 당, 단백질 단편 및 페놀 화합물로 구성된다.
본 발명에 따라 수득된 추출물은 투명하고 훌륭한 용액이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 두날리엘라 살리나의 이러한 수성 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 15 내지 25 g/kg의 건조 중량 추출물, 0.1 내지 2 g/kg의 단백질 단편, 0.3 내지 3 g/kg의 당, 0.5 내지 3 g/kg의 아미노산, 20 내지 150 mg/kg의 페놀 화합물을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 두날리엘라 살리나의 수성 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 0.5 내지 1 g/kg의 단백질 단편, 1 내지 2.5 g/kg의 당, 0.6 내지 2 g/kg의 아미노산 및 40 내지 100 mg/kg의 페놀 화합물을 포함한다.
본 발명에 따른 수성 추출물은 카로티노이드와 같은 검출가능한 양의 친유성 분자를 포함하지 않는다.
본 발명의 다른 목적은 활성 노화방지제로서 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 두날리엘라 살리나의 효과량의 수성 추출물 및 생리학적으로 허용가능한 매질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
효과량은 추출물, 구체적으로 화장품의 활성을 수득하고, 더욱 구체적으로 피부의 외관을 개선하거나, 피부 노화의 징후를 방지하거나, 피부의 수화를 개선하는 데 필요한 본 발명에 따른 추출물의 최소량을 의미하고, 이러한 양은 독성이 없다.
생리학적으로 허용가능한 매질은 독성, 자극, 과도한 알러지 및 유사한 반응, 또는 과민 반응 없이 피부 또는 점막의 외부 층에 접촉하기에 적합한 비히클을 의미하고, 합리적인 이익/위험 비에 비례한다.
의도된 적용 분야에서 통상적으로 사용되는 생리학적으로 허용가능한 매질의 예는 제형에 필수적인 보조제, 예컨대 용매, 증점제, 희석제, 산화방지제, 염료, 자외선차단제, 자가-태닝제, 안료, 충전제, 방부제, 향료, 냄새 흡수제, 정유, 비타민, 필수 지방산, 계면활성제, 필름-형성 중합체 등을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 두날리엘라 살리나의 수성 추출물을 조성물 총 중량을 기준으로 0.1 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%의 농도로 포함한다.
본 발명에 따라 사용가능한 조성물은 임의의 적절한 수단에 의해, 구체적으로 국소적으로 외부에 적용될 수 있고, 조성물의 제형은 당업자에 의해 적합화되어야 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 국소 적용에 적합한 형태이다. 따라서, 이러한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 매질(즉, 적용 중에 불편할 위험 없이 피부 및 피부 부속기관과 상용성임)을 함유하고 모든 적합한 화장품 형태를 포괄하여야 한다.
국소 적용은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 두날리엘라 살리나의 수성 추출물, 더욱 구체적으로 이를 함유하는 조성물을 피부, 점막 또는 피부 부속기관의 표면에 적용하거나 도포하는 것을 의미한다.
"피부"는 얼굴, 예컨대 눈 윤곽 및 입, 코, 이마, 목, 손의 피부, 및 전신의 피부를 의미한다.
피부 부속기관은 각질이 풍부한 인간 또는 동물 신체에 천연적으로 존재하는 물질, 구체적으로 모발, 속눈썹, 눈썹 및 손발톱을 의미한다.
본 발명을 구현하기 위한 국소 조성물은 구체적으로 화장품에 사용가능한 수성, 하이드로-알코올성 또는 유성 용액, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 다중 에멀젼, 마이크로-에멀젼, 나노에멀젼 또는 임의의 콜로이드 시스템의 형태일 수 있고; 이들은 또한 피부, 점막, 입술 및/또는 모발에 적용하기에 적합한 현탁액 또는 심지어 분말의 형태일 수 있다.
이러한 조성물은 다소 유동적일 수 있고, 또한 크림, 로션, 밀크, 혈청, 연고, 겔, 페이스트 또는 포말의 외관을 가질 수 있다. 이들은 또한 스틱과 같은 고체 형태이거나 에어로졸로서 피부에 적용될 수 있다.
모든 경우에, 당업자는 보조제 및 이의 비율이 본 발명에 따른 조성물의 바람직한 유리한 특성을 해치지 않는 방식으로 선택되도록 하여야 한다. 이러한 보조제는, 예를 들어 조성물의 총 중량의 0.01 내지 20%에 해당할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물이 에멀젼인 경우, 지방 상은 조성물 총 중량의 5 내지 80 중량%, 바람직하게는 5 내지 50 중량%에 해당할 수 있다. 조성물에 사용되는 에멀젼화제 및 보조 에멀젼화제는 당업계에서 전통적으로 사용되는 것으로부터 선택된다. 예를 들어, 이들은 조성물 총 중량의 0.3 내지 30 중량%의 비율로 사용될 수 있다.
본 발명의 최종 목적은 피부 관리, 두피 관리 및 피부 부속기관 관리를 위한 본 발명에 따른 조성물의 화장품 용도에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 피부의 외관을 개선하거나, 피부 노화의 징후를 방지하거나, 피부의 수화를 개선하고 장벽 기능을 강화하기 위한 본 발명에 따른 조성물의 화장품 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 용도 및 조성물은 구체적으로 피부 관리 및 피부 부속기관 관리를 위한 것이다.
본 발명은 더욱 구체적으로 피부의 수화를 개선하고 장벽 기능을 강화하기 위한 본 발명에 따른 조성물의 화장품 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 더욱 구체적으로 피부 노화의 징후를 방지하고 피부의 외관, 구체적으로 피부의 탄력 및 탄성을 개선하기 위한 본 발명에 따른 조성물의 화장품 용도에 관한 것이다.
"피부의 외관 개선"은 피부 결이 더 미세하게 보이고, 광도가 더 강하고, 안색이 더 균일한 것을 의미한다.
"피부 노화의 징후"는 노화로 인한 피부의 외관의 임의의 변화, 예를 들어 잔주름, 주름, 갈라짐, 눈 아래 주머니, 다크 서클, 시들음, 탄성, 탄력 및/또는 피부 색조의 상실, 및 변형된 외관을 체계적으로 야기하지 않는 임의의 내부 변형, 예를 들어 피부의 얇아짐, 또는 오염 및 자외선과 같은 환경적 스트레스로 인한 내부 피부 손상을 의미한다.
"피부 수화의 개선"은 건조함, 팽팽함 및 불편함과 같은 탈수로 인한 피부 외관의 변화에서의 임의의 개선을 의미한다.
실시예
본 발명은 이제 하기 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예 1: 본 발명에 따른 발효된 두날리엘라 살리나 추출물의 제조
발효된 두날리엘라 살리나 추출물의 제조는 2일이 소요된다. 제1일에, 미세조류가 성장하는 영양 매질을 제조한다.
1 kg의 배양 매질을 제조하기 위해, 0.2%의 효모 추출물 분말(사카로마이세스 세레비지아에의 자가용해 추출물), 즉 약 800 mL의 증류수에 첨가된 2 g의 분말을 비이커에 위치시킨다. 분말이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반한다. 효모 분말이 잘 용해되면, 0.2%의 글루코스를 첨가한다. 즉, 2 g의 글루코스를 이전에 수득된 용액에 첨가한다. 용액을 제조 시간 동안 일정하게 교반한다. 당이 완전히 용해되면, 2.6%의 사해 염, 즉 26 g을 첨가한다. 용액을 염이 완전히 용해될 때까지 교반 하에 유지한다. 이어서, 영양 매질의 pH를 측정하고, 이는 5.5 내지 8이어야 하고, 필요에 따라 6 내지 7로 최적으로 조정하여야 한다. 이때, 배양 매질은 미세조류 두날리엘라 살리나를 수용할 준비가 된다. 2%의 두날리엘라 살리나 접종물을 배양 매질에 첨가한다. 접종물은 미세조류가 살아있는 두날리엘라 살리나의 농축된 액체 배양물을 의미한다. 증류수를 첨가하여 1 kg의 최종 총 중량을 수득한다. 이어서, 최종 용액의 pH를 측정하고, 필요에 따라 미세조류 두날리엘라 살리나의 최적 배양 pH인 6 내지 7로 조정한다. 용액을 개방형 환경에서 어둠 및 실온에서 12시간 이상 동안 교반 하에 유지한다. 두날리엘라 살리나의 발효가 유기 탄소 공급원의 존재 하에 어둠에서 일어나므로, 이러한 배양은 종속영양으로 공지되어 있다. 두날리엘라 살리나의 발효의 밤 후, 제2일에 분쇄 단계를 수행하여 미세조류의 세포 내용물을 방출하여 배양 매질을 가능한 한 풍부하게 한다. 이어서, 탄소-함유 필터를 사용한 여과 단계를 수행하여 추출물을 탈취하고, 고체 파편을 액상으로부터 분리하여 투명한 추출물을 수득한다. 이어서, 추출물의 정제를 1 μm로부터 0.3 μm로 공극률을 감소시키는 일련의 여과에 의해 수행한다. 추출물의 pH는 3.5 내지 4.5로 설정된다. 마지막으로, 멸균 여과의 최종 단계를 0.2 μm의 공극률로 수행한다. 이렇게 수득된 추출물은 본 발명에서 방부제-부재 버전으로 지칭된 것이고, 이는 하기 실시예 5에 기술된 생물학적 평가 시험에 사용한다.
임의적으로, 방부제, 예를 들어 8%의 사해 염 또는 나트륨 벤조에이트를 이렇게 수득된 추출물에 유리하게 첨가할 수 있다.
이렇게 수득된 두날리엘라 살리나의 추출물을 분석하고, 이는 하기 특징을 갖는다: 건조 물질의 중량: 22 g/kg; 총 단백질 함량(단백질 단편): 0.5 g/kg; 총 당 함량: 2.3 g/kg; 유리 아미노산 함량: 0.6 g/kg; 및 총 폴리페놀 함량: 40 mg/kg.
두날리엘라 살리나 추출물의 총 단백질 함량(단백질 단편)을 로우리(Lowry) 단백질 검정(문헌[Lowry et al., 1951])에 의해 측정한다. 샘플의 흡광도를 550 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 단백질 함량을 표준 BSA 곡선을 사용하여 측정한다.
추출물의 아미노산 함량을 무어(Moore)에 의해 공개한 프로토콜(문헌[Moore et al., 1948])로부터 측정한다. 추출물의 유리 아미노산 함량을 닌하이드린 시약에 의해 아민 및 카복실산 작용기의 분해에 따라 착색된 복합체의 형성에 의해 평가한다. 복합체의 흡광도는 570 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 총 아미노산 함량은 표준물로서 아미노산 풀을 기준으로 측정한다.
추출물의 총 당 함량을 두보이스(Dubois)에 의해 기술된 검정(문헌[Dubois et al., "Colorimetric method for the determination of sugars and related substances", Anal. Chem., 1956, 28 (3), 350-356])을 적용하여 측정한다. 이러한 분석은 원료를 농축 황산에 용해시키고, 이어서 페놀과 반응시켜 착색된 복합체를 형성하는 것으로 구성된다. 복합체의 흡광도는 490 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 당 함량을 표준 글루코스 곡선을 사용하여 측정한다.
추출물의 폴리페놀 함량을 폴린-시오칼뉴(Folin-Ciocalteu) 검정을 사용하여 측정한다(문헌[Singleton et al., Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants using the Folin-Ciocalteu reagent, 1999, 299: 152]). 샘플의 폴리페놀 화합물을 폴린-시오칼뉴 시약과 반응시키고, 시약의 산화는 청색을 제공한다. 샘플의 흡광도를 760 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 함량을 표준 갈산 곡선을 사용하여 갈산 당량으로 표시한다.
실시예 2: 본 발명에 따라 수득된 발효된 두날리엘라 살리나 추출물의 특성규명
일반적으로, 두날리엘라 살리나의 수성 추출물은 매우 옅은 녹색이고 맑고 광택이 있고, 15 내지 25 g/kg의 건조 중량 추출물, 0.1 내지 2 g/kg의 단백질 단편, 0.3 내지 3 g/kg의 당, 0.5 내지 3 g/kg의 아미노산, 및 20 내지 150 mg/kg의 페놀 화합물을 함유한다.
실시예 1의 추출에서, 22 g/kg의 건조 중량 추출물의 수성 추출물을 수득한다. 이러한 추출물은 "발효된 비-보존된" 추출물로 지칭되고, 모든 생물학적 분석에 사용한다.
물리-화학적 분석은 이러한 추출물이 0.5 g/kg의 단백질 단편, 2.3 g/kg의 당, 640 mg/kg의 아미노산, 및 40 mg/kg의 페놀 화합물의 농도를 가짐을 나타낸다.
임의적으로, 이렇게 수득된 추출물은 8% 농도의 사해 염 또는 나트륨 벤조에이트와 같은 방부제를 첨가하여 유리하게 보존될 수 있다. 이어서, 추출물을 "보존된 추출물"로 지칭한다.
실시예 3: 두날리엘라 살리나의 "발효되지 않은" 추출물의 생산
"발효되지 않은" 것으로 공지된 두날리엘라 살리나의 추출물을 수득하기 위해, 추출물을 실시예 1에 기술된 방법에 의해 제조하고, 유일한 차이점은 배양 매질 및 미세조류를 함유하는 용액이 어둠에서 12시간 동안 교반되지 않았고, 그 동안 미세조류가 발효된다는 점이다. 미세조류를 매질에 첨가하자마자, 영양 매질 및 미세조류를 함유하는 용액을 즉시 분쇄하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 여과하였다. 이는 미세조류가 종속영양 발효를 거치지 않은 추출물을 수득하고, 이에 따라 물리-화학적 및 생물학적 평가 관점에서 비교 분석을 수행할 수 있도록 한다.
실시예 4: 실시예 1의 성장 조건 하에서 두날리엘라 살리나의 발효의 증명
미세조류 두날리엘라 살리나가 본 발명에 따라 기술된 배양 조건(실시예 1) 하에 성장할 수 있음을 증명하기 위해, 특정 배양 매개변수의 변형 및 특정 생물학적 마커의 분석을 수행한다.
배양물에서 미생물의 성장을 모니터링할 때 측정하여야 할 첫 번째 배양 매개변수 중 하나는 시간 경과에 따른 바이오매스이다. 세포 밀도를, 성장을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 매개변수인 광학 밀도(OD)에 의해 측정한다. 이를 위해, OD를, 미생물 배양물의 불투명도를 정의하는 데 통상적으로 사용되는 700 nm의 파장에서의 분광광도법으로 측정한다.
도 1은 배양 매질 단독(또는 영양 매질)(즉, 미세조류 두날리엘라 살리나를 첨가하지 않음), 및 미세조류 두날리엘라 살리나를 첨가한 배양 매질의 t = 0시간 및 t = 12시간에서 어둠 및 실온에서 측정된 OD를 도시한다. 두날리엘라 살리나의 존재 하에 12시간 후에 OD의 유의한 증가가 관찰된다. 이러한 증가는 이러한 12시간의 기간 동안 발효되고 분열된 두날리엘라 살리나의 성장에 기인한다.
이들의 성장에 필요한 물질을 소비함으로써 배양물에서 미생물의 성장을 증명하는 것도 가능하다. 이것은 미생물의 세포 분열을 위한 필수 영양소인 당의 경우이다. 실제로, 배양 매질의 탄소 공급원, 예를 들어 글루코스(헥소스)의 소비는 미생물의 성장을 모니터링하기 위해 인정되는 배양 모니터링 매개변수이다. 빛이 없는 실온에서 t = 0시간 및 t = 12시간에서 실온에서 미세조류 두날리엘라 살리나의 존재 및 부재와 관계 없이 배양 매질에서 헥소스의 농도의 비교 분석을 수행한다. 추출물의 총 헥소스 함량은 C6 당의 양이 비색 측정에 의해 결정되는 문헌[Hanssen and Moller (1975)]의 방법에 따라 측정한다. 황산에 용해된 안트론 용액은 당과 특이적으로 반응하여 노란색으로부터 녹색으로 변한다. 복합체의 흡광도를 625 nm에서 분광광도계 상에서 판독한다. 당 함량을 표준 글루코스 곡선을 사용하여 측정한다.
도 2에 제시된 결과는 두날리엘라 살리나를 포함하는 배양 매질에서만 t = 12시간에서 배양 매질의 글루코스 농도의 감소를 도시하고, 이는 미세조류가 글루코스를 소비하고 대사하였음을 의미한다.
아미노산은 천연 환경에서 성장하는 미세조류의 중요한 질소 공급원이다. 아미노산은 해수에서 용해된 질소의 상당한 부분을 형성하는 것으로 나타났고, 해양 미세조류의 성장을 위한 추가적인 질소 공급원을 제공할 수 있다. 일부 연구는 용해된 무기 질소가 고갈된 물에서 어둠 조건 하에 최대 아미노산 포획률이 발생함을 시사한다.
두날리엘라 살리나가 탄소질 영양 공급원인 글루코스, 및 질소 공급원인 아미노산과 같은 질소 분자가 매우 풍부한 효모 추출물을 갖는 종속영양 조건 하에 성장하는 능력을 평가한다. 이러한 경우, 배양은 어둠에서 수행되고, 이는 배양 매질에 존재하는 아미노산의 대사에 도움을 준다.
빛이 없는 상태에서 실온에서 t = 0시간 및 t = 12시간에서 배양 매질에 함유된 아미노산을 정확하게 측정하기 위해, 샘플을 HPLC-DAD에 의해 분석한다. t = 0시간 및 t = 12시간에 미세조류 두날리엘라 살리나를 포함하는 배양 매질을 원심분리하여 미세조류를 제거하여 배양 매질에 존재하는 아미노산만을 측정한다. 샘플은 아길런트(Agilent) 1260 HPLC 시스템[아길런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 소재) 상에서 업티스피어 스트래티지(Uptisphere Strategy) C18-2 5 μm(250 x 4.6 mm) US5C182-250/046[인터킴(Interchim) 참조: UE2.6AQ-100/046]으로 분리한다. 유량은 1 mL/분이다. 이동상은 0.1% 인산(H3PO4): 용액 (A) 및 아세토 니트릴: 용액 (B)로 구성된다. 하기 표 1은 용리를 위한 구배 프로그램을 나타낸다.
[표 1]
컬럼의 온도를 25℃로 유지한다. 주입 부피는 5 μL이고, 검출 파장은 UV 검출기를 사용하여 254 nm로 설정한다. 아미노산 표준은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입한다. 주입 전 표준 및 샘플은 페닐이소티오시아네이트(PITC)로 유도된다. 샘플의 체류 시간 및 UV 스펙트럼 피크를 표준 아미노산과 비교하여 아미노산 동정을 수행한다.
특정 아미노산의 농도는 구체적으로 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 알라닌, 아르기닌, 글루탐산의 경우 시간 t = 0과 비교하여 발효의 t = 12시간 후 두날리엘라 살리나를 함유하는 배양 매질의 조건 하에 유의하게 감소한다. 이러한 상이한 아미노산은 발효 중에 미세조류에 의해 소비되고, 성장하는 미세조류의 단백질 합성에 부분적으로 사용된다. 이는 도 3에 도시되고, 이때 발효 12시간 후 "미세조류 + 영양 매질" 추출물의 단백질 함량이 더 높다.
실시예 5: 실시예 1에 따라 제조된 발효된 두날리엘라 살리나의 수성 추출물이 생체외 피부 상의 장벽 기능 및 수분 이동에 미치는 효과의 평가
본 연구의 목적은 클라우딘-1을 평가함으로써, 실시예 3에 따라 제조된 발효되지 않은 두날리엘라 살리나의 수성 추출물과 비교하여, 방부제의 첨가 없이 실시예 1에 따라 제조된 발효된 두날리엘라 살리나의 수성 추출물이 장벽 기능 및 수분 이동에 미치는 영향을 나타내는 것이다.
피부는 신체와 외부 환경 사이의 계면이다. 피부는 외부의 공격으로부터 신체를 보호하고, 물의 확산을 제한하여 탈수와 싸우는 것을 목표로 한다. 함수 항상성의 유지는 과립 층의 밀착 접합부를 비롯한 다양한 요소에 의해 보장된다. 막관통 단백질 클라우딘-1의 일부로 이루어진 이러한 접합부는 세포간 공간을 통한 용질 및 물의 수동 확산을 방지한다. 마지막으로, 피부 노화에 따라 클라우딘-1 발현이 감소되고 클라우딘-1 결핍이 주름의 외관을 야기하는 것이 관찰된다(문헌[Furuse et al.,"Claudin-based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson from claudin-1-deficient mice", J Cell Biol. 156(6):1099-111, 2002]; 문헌[Jin S.P. et al, "Changes in tight junction protein expression in intrinsic aging and photoaging in human skin in vivo", J Dermatol Sci. 97-113/2016]).
프로토콜:
6 mm 직경의 인간 피부 생검을 특정 배양 매질(1 g/L의 DMEM, HAMF12, 소 태아 혈청 및 항생제)에서 생체외 유지한다. 생검을 실시예 1에 따라 제조된 발효된 두날리엘라 살리나 추출물 용액 또는 실시예 3에 따라 제조된 발효되지 않은 두날리엘라 살리나 추출물 용액(둘 다 PBS에서 5% 부피/부피의 최종 농도로 희석됨)으로 48시간 동안 하루에 2회 처리한다.
클라우딘-1의 면역염색을 위해, 조직을 고정하고 파라핀에 매립한다. 이렇게 포함된 피부 생검을 절단하고 절편은 탈랍하고 재수화시킨다. 이어서, 마스킹 해제 프로토콜을 수행하고, 이어서 특정 항-클라우딘-1 항체[압캠(Abcam), ab15098, 토끼 폴리클로날], 및 이어서 형광 염료와 커플링된 적합한 2차 항체를 적용한다. 특정 매질에 장착된 후, 슬라이드를 에피플루오레선스 현미경[자이스 액시오버트(Zeiss Axiovert) 200M 현미경]으로 관찰한다.
결과:
도 4에 도시된 바와 같이, PBS에서 5% 희석된 발효된 두날리엘라 살리나 추출물 용액에 의한 처리는 생체외 생검에서, PBS에서 5% 희석된 발효되지 않은 두날리엘라 살리나 추출물 용액과 비교하여 클라우딘-1 발현이 17%의 유의한 증가(***)를 나타낸다.
결론:
5%로 희석된 발효된 두날리엘라 살리나 추출물의 용액을 적용한 후, 본 발명자들은 클라우딘-1의 발현의 증가를 관찰하였다. 클라우딘-1은 피부에서 장벽 기능 및 수분 이동과 관련된다.
실시예 6: 제형
다음 제형에서, 사용된 발효된 두날리엘라 살리나 추출물을 실시예 1에 따라 수득하고, 방부제로서 8% 사해 염을 첨가한다. 이것은 발효 미네랄 주스[퍼먼트 미네랄 브로스(FERMENT MINERAL BROTH)]로 지칭된다.
실시예 6.1: 보습 데이 크림
실시예 6.2: 페이셜 세럼
실시예 6.3: 페이셜 에센스
실시예 6.4: 나이트 마스크
실시예 6.5: 사해 샤워 젤
실시예 6.6: 사해 샴푸
실시예 6.7: 사해 헤어 컨디셔너
실시예 6.8: 사해 헤어 마스크
Claims (10)
- a) 효모 추출물을 물에 용해시키는 단계;
b) 글루코스를 단계 a)에서 수득된 혼합물에 첨가하는 단계;
c) 사해 염(Dead Sea salt)을 첨가하는 단계;
d) 사해 염을 단계 b)에서 수득된 혼합물에 완전히 용해시킨 후, pH가 5 내지 8인 수득된 배양 매질에 미세조류 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina)를 첨가하는 단계;
e) 단계 d)에서 수득된 혼합물을 어둠 및 실온에서 12시간 이상의 기간 동안 적당히 교반하여 미세조류 두날리엘라 살리나를 발효시키는 단계;
f) 단계 e)에서 수득된 발효된 미세조류 두날리엘라 살리나 혼합물을 분쇄하고 이어서 여과하여 가용성 물질 및 불용성 물질을 분리하는 단계;
g) 사해 염 또는 방부제, 예컨대 나트륨 벤조에이트가 첨가된 가용성 수성 원료 추출물을 회수하는 단계;
h) 0.2 μm 이하의 공극률 임계값으로 멸균 여과를 수행하는 단계; 및
i) pH가 3.5 내지 4.5인 미세조류 두날리엘라 살리나의 발효된 수성 추출물을 수득하는 단계
에 따라 미세조류 두날리엘라 살리나를 효모 추출물, 당 및 염을 포함하는 배양 매질에서 빛 없이 배양하여 미세조류 두날리엘라 살리나의 수성 추출물을 수득하는 방법. - 제1항에 있어서,
단계 a)에서, 분말 형태의 효모 추출물이 0.1 내지 2% w/w, 바람직하게는 0.2% w/w의 효모 추출물/물의 비로 증류수에 용해되는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
단계 b)에서, 글루코스가 혼합물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 4 중량%, 바람직하게는 2 중량%의 농도로 첨가되는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 d) 및 i)에서, pH가 염산(HCl) 또는 나트륨 하이드록사이드(NaOH)의 용액을 첨가함으로써 제어되고 임의적으로 재조정되는, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 i)에서, pH가 3.5 내지 4.0이고, 바람직하게는 pH가 4.0인, 방법. - 추출물의 총 중량을 기준으로 15 내지 25 g/kg의 무수 중량 추출물, 0.1 내지 2 g/kg의 단백질 단편, 0.3 내지 3 g/kg의 당, 0.5 내지 3 g/kg의 아미노산 및 20 내지 150 mg/kg의 페놀 화합물을 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 미세조류 두날리엘라 살리나의 수성 추출물.
- 활성 노화방지제로서 효과량의 제6항에 따른 미세조류 두날리엘라 살리나의 수성 추출물, 및 생리학적으로 허용가능한 매질을 포함하는 조성물.
- 제7항에 있어서,
미세조류 두날리엘라 살리나의 수성 추출물을 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%의 농도로 포함하는 조성물. - 피부 관리, 두피 관리 및 피부 부속기관 관리를 위한 제7항 또는 제8항에 따른 조성물의 화장품 용도.
- 제9항에 있어서,
피부의 외관을 개선하거나, 피부 노화의 징후를 방지하거나, 피부의 수화를 개선하고 장벽 기능을 강화하기 위한 화장품 용도.
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